同时测定雪胆中雪胆甲素和雪胆乙素含量的HPLC方法与流程

本发明涉及一种同时测定雪胆中雪胆甲素和雪胆乙素含量的hplc方法。
背景技术：
：川标所收载的雪胆为葫芦科雪胆属植物长果雪胆hemsleyadolichocarpaw.j.chang，峨眉雪胆hems-leyaomeiensisl.t.shenetw.j.chang或巨花雪胆hemsleyagiganthaw.j.chang的干燥块根。秋末春初采挖，除去杂质，趁鲜切片，干燥。别名金龟莲金盆罗锅底，四川省习称金龟莲。能清热解毒，消炎止痛，用于菌痢，肠炎，支气管炎，急性扁桃体炎，虚火牙痛，胃痛。本品历代本草均有记载。《本草便方》称金盆，《修订增补天宝本草》和《四川中药志》均称金龟莲，《分类草药性》以金银盆收载。目前对雪胆的质量研究主要以雪胆甲素为检测指标，方法相对单一。然而雪胆乙素同样也是雪胆药材中很重要的一个活性成分，其同样具有清热解毒，消炎杀菌的作用，因此，实际工作中也有必要对雪胆的雪胆乙素同时进行监控，以更真实地反应药材的内在质量。而且，三种雪胆中，长果雪胆味极苦，巨花雪胆味苦，峨眉雪胆味不苦。较其他两个品种相比，峨眉雪胆味不苦的特点更易被患者接纳宜于临床服用，峨眉雪胆对治疗胃火牙痛的良好效果也使其被市场大量需求，有必要将峨眉雪胆与其它苦味雪胆进行区分。因此，目前需要一种能够同时准确测定雪胆中雪胆甲素和雪胆乙素含量的方法，以确保雪胆的质量和安全，以及区分峨眉雪胆与其他苦味雪胆。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种同时准确、方便、可靠地测定雪胆中雪胆甲素和雪胆乙素含量的hplc方法。本发明提供了一种同时测定雪胆中雪胆甲素和雪胆乙素含量的hplc方法，步骤如下：a、制备供试品溶液：取雪胆粉末，以甲醇为溶剂提取，过滤、离心，得供试品溶液；b、制备对照品溶液：取雪胆甲素、雪胆乙素对照品，混合，加甲醇配制成混合对照品溶液；c、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：色谱柱：c18色谱柱；流动相：流动相为乙腈-0.05％磷酸水溶液；梯度洗脱程序为：0-5min：乙腈：磷酸水(2:98)；5-10min：乙腈：磷酸水(2-35:98-65)；10-30min：乙腈：磷酸水(35:65)；检测波长：205-280nm；d、根据检测结果计算得到雪胆中的雪胆甲素和雪胆乙素含量。其中，步骤a中，每1g雪胆粉，甲醇用量为30-60ml；优选地，每1g雪胆粉用40ml甲醇。其中，步骤a中，所述提取是超声或回流提取。其中，所述提取的时间是30-60分钟，优选地，提取的时间是50分钟。其中，步骤a中，所述离心的条件为16000rpm离心10min。其中，步骤c中，所述色谱柱的规格为：内径4.6mm，长度250mm，填料粒径5μm；优选的色谱柱型号为sepaxbio-c18色谱柱。其中，步骤c中，所述检测波长为210nm。其中，所述色谱条件的柱温为25℃；流速为1.0ml/min。其中，所述雪胆的基源品种为峨眉雪胆hems-leyaomeiensisl.t.shenetw.j.chang、长果雪胆hemsleyadolichocarpaw.j.chang、巨花雪胆hemsleyagiganthaw.j.chang。本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定雪胆中两种雪胆素成分——雪胆甲素和雪胆乙素含量的hplc方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高雪胆的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法还准确检测出了不同基源品种中两种雪胆素成分，为雪胆的临床应用提供了有效的参考。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1提取方法考察，其中，a:甲醇回流，b:甲醇超声；图2：流动相1为甲醇：水(80:20)时的样品色谱峰分离情况图3：流动相2为乙腈：水(35:65)时的样品色谱峰分离情况；图4：流动相3为乙腈：水(40:60)时的样品色谱峰分离情况；图5：流动相4为乙腈：0.05％磷酸水(梯度1-3)时的样品色谱峰分离情况；图6：为不同波长下的样品色谱峰分离情况；图7：为不同雪胆样品的雪胆甲素及雪胆乙素含量比较。图8：峨眉雪胆的含量测定：1雪胆甲素，2雪胆乙素。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。实施例1本发明hplc方法方法如下：1、制备供试品溶液：取雪胆粉末(过2号筛)1g，精密加入甲醇40ml，40℃超声50min，放冷，补足失重，过滤，取续滤液2ml，16000rpm离心10min，取上清液，制得供试品溶液。2、制备对照品溶液精密称取雪胆素甲0.00232g，置于5ml容量瓶中，加甲醇定容至5ml，制成浓度为0.464mg/ml的雪胆甲素储备液；精密称取雪胆素乙0.00319g，置于5ml容量瓶中，加甲醇定容至5ml，制成浓度为0.638mg/ml的雪胆乙素储备液；精密吸取雪胆甲素储备液1000ul、雪胆乙素储备液400ul至同一2ml的容量瓶中，加入甲醇定容至2ml，制得雪胆素甲浓度为0.232mg/ml、雪胆素乙浓度为0.1276mg/ml的混合标准品溶液。3、分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测，色谱条件如下：色谱柱：sepaxbio-c18(5μm，4.6×250mm)；柱温25℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl；检测波长210nm；流动相为乙腈：0.05％磷酸水(梯度)，梯度洗脱程序为：0-5min：乙腈：磷酸水(2:98)5-10min：乙腈：磷酸水(2-35:98-65)10-30min：乙腈：磷酸水(35:65)。4、根据检测结果计算得到雪胆中的雪胆甲素和雪胆乙素含量。以下通过试验例具体说明本发明的有益效果：试验例1本发明方法的工艺参数筛选一、实验材料1.实验设备和仪器uph-i-10t优普超纯水器(成都超纯科技有限公司)；ps-80超声波清洗机(深圳市洁康洗净电器有限公司)；fa1204c电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；shz-d(iii)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；hhs-8s电子恒温不锈钢水浴锅(上海宜昌仪器纱筛厂)；q-400b高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)；agilent1200高效液相色谱仪：仪器包括g1322a(四元泵)，g1329a/b(自动控温自动进样器)，g1316a(柱温箱)，g1315b/d(二极管阵列检测器)，agilentchemstation工作站；色谱柱：sepaxbio-c18(5μm，4.6×250mm)。2.试剂和试药雪胆甲素对照品(批号：16061504)购买于测定普菲德生物技术有限公司；雪胆乙素对照品(批号：150801)购买于成都瑞芬思生物科技有限公司；fisher色谱乙腈(色谱纯)、sigma色谱甲醇(色谱纯)、水(up水)，甲醇、盐酸、磷酸、乙酸乙酯、正丁醇。二、本发明方法的筛选(一)对照品溶液的制备精密称取雪胆素甲0.00232g，置于5ml容量瓶中，加甲醇定容至5ml，制成浓度为0.464mg/ml的雪胆甲素储备液；精密称取雪胆素乙0.00319g，置于5ml容量瓶中，加甲醇定容至5ml，制成浓度为0.638mg/ml的雪胆乙素储备液；精密吸取雪胆甲素储备液1000ul、雪胆乙素储备液400ul至同一2ml的容量瓶中，加入甲醇定容至2ml，制得雪胆素甲浓度为0.232mg/ml、雪胆素乙浓度为0.1276mg/ml的混合标准品溶液。(二)供试品溶液的制备在供试品溶液的制备中，以巨花雪胆为例，发明人对提取方法、提取溶媒、提取时间及提取溶媒用量进行了考察，具体如下：1、提取方法的考察方法1：取雪胆粉末1g一份置锥形瓶中，加甲醇(1：50)50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)40分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，置2ml离心管中，16000rpm离心10min，取上清液，即得。方法2：取雪胆粉末1g一份置锥形瓶中，加甲醇(1：50)50ml，密塞，称定重量，在80℃水浴锅中回流40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置2ml离心管中，16000rpm离心10min，取上清液，即得。分别精密吸取2种方法的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，以雪胆甲素和雪胆乙素的混合溶液为对照品，计算2种雪胆素的含量。色谱条件如下：色谱柱：sepaxbio-c18(5μm，4.6×250mm)；柱温25℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl；检测波长210nm；流动相为乙腈：0.05％磷酸水，梯度洗脱程序如下：0-8min：乙腈：磷酸水(30-35:70-65)；8-28min：乙腈：磷酸水(35:65)；28-30min：乙腈：磷酸水(35-30:65-70)。结果见表1和图1。表1提取方法考察测定结果由图1和表1可知，二种提取方法均可以有效提取出雪胆甲素和雪胆乙素，其中，超声提取的效率稍高，综合考虑提取效果和操作简便性，大规模测定时优选的提取方法为超声提取。2、提取溶剂的考察采用超声提取法制备供试品，考察提取溶媒的影响。分别选取甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇(50:1)用量。分别精密吸取4种不同溶媒用量的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，以雪胆甲素和雪胆乙素的混合溶液为对照品，计算2种雪胆素的含量。色谱条件如下：色谱柱：sepaxbio-c18(5μm，4.6×250mm)；柱温25℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl；检测波长210nm；流动相为乙腈-0.05％磷酸水(40:60)，洗脱。结果见表2。表2提取溶媒考察测定结果由表2可知，提取溶剂最优为甲醇。3、提取溶媒用量的考察采用超声提取法制备供试品，考察提取溶媒用量的影响。分别选取30ml、40ml、50ml、60ml的甲醇(50:1)用量。分别精密吸取4种不同溶媒用量的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，以雪胆甲素和雪胆乙素的混合溶液为对照品，计算2种雪胆素的含量。色谱条件如下：色谱柱：sepaxbio-c18(5μm，4.6×250mm)；柱温25℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl；检测波长210nm；流动相为乙腈：0.05％磷酸水，洗脱程序为：0-5min：乙腈：磷酸水(30-35:70-65)；5-28min：乙腈：磷酸水(35:65)；28-30min：乙腈：磷酸水(35-30:65-70)。结果见表3。表3提取溶媒用量的考察测定结果由表3可知，甲醇用量为30-60ml时均能有效提取出雪胆甲素和雪胆乙素，其中，用量40ml时提取效果最佳。4、超声时间的考察采用超声提取法制备供试品，考察超声时间的影响。分别选取30min、40min、50min、60min提取时间，分别精密吸取4种超声时间的供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪,计算2种雪胆素的含量。色谱条件如下：色谱柱：sepaxbio-c18(5μm，4.6×250mm)；柱温25℃，流速为1.0ml/min，进样量为10μl；检测波长210nm；流动相为乙腈：0.05％磷酸水，洗脱程序为0-5min：乙腈：磷酸水(30-35:70-65)；5-28min：乙腈：磷酸水(35:65)；28-30min：乙腈：磷酸水(35-30:65-70)。结果见表4。表4超声时间的考察测定结果由表4可知，超声时间为30-60min时均能有效提取出雪胆甲素和雪胆乙素，其中，超声50ml时提取效果最佳。因此，最终确定的最佳的供试品溶液制备方法为：取峨眉雪胆、长果雪胆、巨花雪胆粉末(过2号筛)各1g，精密加入甲醇40ml，40℃超声50min，放冷，补足失重，过滤，取续滤液2ml，16000rpm离心10min，取上清液，制得供试品溶液。(三)色谱条件的考察1、流动相的考察分别考察了四种不同流动相：甲醇：水(80:20)、乙腈：水(35:65)、乙腈：水(40:60)、乙腈：0.05％磷酸水(梯度)等溶液作为流动相，柱温25℃，流速1.0ml/min，检测波长210nm。按药典规定下操作观察色谱图峰的分离效果，结果分别见图2-5。其中，梯度洗脱1为：0-8min：乙腈：磷酸水(30-35:70-65)8-28min：乙腈：磷酸水(35:65)28-30min：乙腈：磷酸水(35-30:65-70)梯度洗脱2为：0-5min：乙腈：磷酸水(30-35:70-65)5-28min：乙腈：磷酸水(35:65)28-30min：乙腈：磷酸水(35-30:65-70)梯度洗脱3(筛选的最佳洗脱条件)为：0-5min：乙腈：磷酸水(2:98)5-10min：乙腈：磷酸水(2-35:98-65)10-30min：乙腈：磷酸水(35:65)由图2-5可知，甲醇：水(80:20)洗脱系统下，雪胆素甲和雪胆素乙的出峰时间较短且非常接近，对雪胆素甲、乙的含量测定误差影响较大；乙腈：水(35:65)洗脱系统下，雪胆素样品分离度不好；乙腈：水(40:60)洗脱系统下，雪胆素乙出峰时间较短，且样品分离度不好；而且乙腈：0.05％磷酸水的梯度洗脱1、2时的样品整体峰型均不好，只有本发明优化的梯度洗脱3洗脱系统下，雪胆甲素，乙素，分离度较好，且整体峰都可以。因此，最终确定流动相系统为乙腈：0.05％磷酸水(梯度洗脱3)。2、测定波长的选择分别在吸收波长为205nm、210nm、212nm、280nm在4个波长下用dad检测器，记录整个光谱图，获得样品和对照品在雪胆素这个色谱峰的紫外扫描图，观察色谱图，结果见图6。雪胆甲素、乙素均为末端吸收，紫外扫描显示均无最大波长。波长越小相应峰面积会越大，但同时一些杂峰的面积也会增大或者杂峰数量增多。由图6可见，4种波长均可有效检测，其中，210nm的峰形在既定的流动相条件下要好一些。最后含量测定时，统一选择了常用的210nm为检测波长。试验例2本发明方法用于区分不同雪胆取峨眉雪胆、长果雪胆、巨花雪胆粉末(过2号筛)各1g，按照本发明确定的方法，进行检测。结果见表5和图7-8。表5三种雪胆的含量测定雪胆甲素雪胆乙素峨眉雪胆＜2.66＜0.876长果雪胆24.3863.444巨花雪胆16.2422.520可见，峨眉雪胆在雪胆甲素、雪胆乙素相应保留时间处峰面积极小甚至没有出现峰，说明峨眉雪胆中雪胆甲素、雪胆乙素含量极低，而长果雪胆、巨花雪胆中雪胆甲素和雪胆乙素含量较高，根据其含量数值可用来区分峨眉雪胆和长果雪胆、巨花雪胆。试验例3本发明方法对不同雪胆样品的测定结果取下述雪胆样品各批次，按照本发明确定的方法，进行检测，结果见表5。表5中的各编号雪胆为不同批次的下述样品：1-4：峨眉雪胆5：长果雪胆6：四川辅正药业股份有限公司提供的峨眉雪胆粉末成品7-14：峨眉雪胆15：巨花雪胆表5含量测定结果可见，实际检测工作中，峨眉雪胆的雪胆甲素、雪胆乙素含量极低，甚至无法检出，而长果雪胆、巨花雪胆中雪胆甲素和雪胆乙素含量较高，与雪胆种类相符。因此，本发明方法可以准确区别峨眉雪胆和长果雪胆、巨花雪胆。综上，本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定雪胆中两种雪胆素成分——雪胆甲素和雪胆乙素含量的hplc方法，该方法准确可靠、简便快速，为提高雪胆的质量控制水平、促进药材的开发利用奠定了基础。同时，本发明的方法还准确检测出了不同基源品种中两种雪胆素成分，为雪胆的临床应用提供了有效的参考。当前第1页12