一种新利司他中杂质A生物样品的测定方法与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种新利司他中杂质a生物样品的测定方法。

背景技术：

新利司他是由山东新时代药业有限公司研制开发，主要治疗肥胖及其并发症的药物，可通过与胃肠道脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活，达到减少热量摄入、控制体重的作用。优点是不作用于神经系统、不影响胃肠道其他酶的活性，不被吸收进入血液、不抑制食欲，无需限制饮食，是一种新型强效的特异性胃肠道脂肪酶的抑制剂。由于新利司他原料药的工艺杂质来源和种类复杂多样，对这类原料药工艺杂质的控制一直是一项挑战性的工作。新利司他杂质a是其中最主要的一种工艺杂质，它是新利司他的降解产物，也是合成新利司他的中间体，其在新利司他中含量最高可达1.5％。新利司他杂质a的分子式为c25h41no4，分子量为419.60，化学结构如下所示：

新利司他杂质a是新利司他中不可去除的杂质，并且含量较高，根据ich指导原则，需要对其进行毒性及伴随毒代动力学研究，考察其是否可吸收入血并对机体产生何种影响，这是明确新利司他安全性的必要工作。因此，急待开发出一种稳定、准确、检测限低的液质分析方法，用于新利司他中杂质a的体内药代动力学测定，这对指导新药开发以及指导临床合理用药有着十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新利司他杂质a的生物样品测定方法。所述的方法包括确定一种大鼠口服新利司他杂质a混悬液后其血浆中的新利司他杂质a浓度的测定方法。

本发明的新利司他杂质a的测定方法采用超高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱法(uplc-ms/ms)来检测生物样品中新利司他杂质a浓度，本方法中生物样品采用有机溶剂沉淀法处理；乙腈作为沉淀溶剂；液相条件中流动相由0.1％甲酸水和0.1％甲酸乙腈组成，18：82v/v等度洗脱；奥利司他作为新利司他杂质a生物样品测定的内标；样品处理后的上清液用四氢呋喃作为稳定剂。

本发明上述所述的新利司他杂质a的生物样品测定方法，其具体包括如下步骤：

(1)生物样品处理：血液、尿液等液体组织取出后4000r/min离心10min，取上清液50μl待测；脏器、粪便等固体组织分离后立即用生理盐水研磨，4000rpm离心10min，取上层澄清液体作为待测液。

(2)测定前预处理：取50μl待测生物样品，加入5μl浓度为1mg/l的奥利司他内标工作液，加入145μl乙腈涡旋混匀，10000rpm离心10min，吸取150μl上清液加入10μl四氢呋喃混匀，进样3μl进行lc-ms/ms分析。

(3)新利司他杂质a采用超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的高通量测定方法：取上述处理液3μl进行lc-ms-ms分析，其中液相条系统条件为流动相：a相为0.1％甲酸水，b相为：0.1％甲酸乙腈，a：b＝18：82等度洗脱；色谱柱为thermohypersilgold50*2.1；流速：0.5ml/min；柱温：30℃；样品盘温度：20℃；进样量：3μl；质谱系统条件为：离子源：h-esi；喷射电压：3500v；鞘气：40arb；辅助气：10arb；尾吹气：0arb；离子传输毛细管温度：325℃；气化温度：50℃。

(4)新利司他杂质a标准曲线的确定：取大鼠空白生物样品组织45μl，加入系列混合标准溶液5μl，配制成相当于新利司他杂质a浓度为10000，5000，2000，400，100，40，20ng·ml^-1的模拟生物样品，按“测定前预处理”项下操作，每一浓度进行双样本分析，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(w＝1/x²)最小二乘法进行回归分析，确定新利司他杂质a的生物样品标准曲线及其定量限；所述的内标物为奥利司他。

(5)为详细阐述该测定方法，本发明以检测大鼠口服新利司他杂质a混悬液后，血浆中新利司他杂质a的药代动力学参数为例：将24只大鼠随机分为3组，给予新利司他杂质a混悬液，剂量分别为20mg/kg、80mg/kg、320mg/kg。各组大鼠于给药前锁骨下静脉取空白血，于给药后0.5h、1h、3h、6h、9h、12h、24h取血0.2ml。按照步骤(1)中生物样品处理、步骤(2)测定前预处理和步骤(3)中的超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的高通量测定方法以及步骤(4)中所获得的新利司他杂质a标准曲线计算，确定不同取样时间的血浆中新利司他杂质a的浓度，并利用das软件确定新利司他杂质a的体内药代动力学参数。

本发明建立的测定方法具有如下优势：

(1)通过加入四氢呋喃以增加处理后样品稳定性，并最终确定了最佳的加入比例，保证了测定结果的准确性。

(2)采用c1850mm短柱进行分析，单个样品的分析时间仅为3.8min，大大增加了分析通量，提高了分析速度，有利于大批量样品的快速分析，本发明中的测定方法不仅可用于生物样品中新利司他杂质a浓度的测定亦可用于临床快速监测患者的血药浓度。

(3)通过对多种生物样品处理方法及沉淀溶剂、液相条件中流动相、母离子/子离子离子对、内标等多种检测条件进行优选最终确定了本发明的检测方法具有高精密度、专属性、稳定性,为新利司他新药开发以及指导临床合理用药提供了有力保证。

附图说明

图1为大鼠空白血浆样品色谱图。

图2为大鼠空白血浆加药样品色谱图。

图3为大鼠口服新利司他杂质a混悬液12h的血浆样品色谱图。

图4为各剂量组大鼠口服新利司他杂质a后的药物浓度-时间曲线图

注：通道i为新利司他杂质a色谱峰，通道ii为内标奥利司他色谱峰。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更清楚地了解本发明，申请人对本发明所述新利司他杂质a生物样品的测定方法进一步描述如下，其中检测方法的方法学考查的生物基质以大鼠血浆为例，具体实施以大鼠口服新利司他杂质a混悬液后的药代动力学实验为例，但本领域技术人员应能知晓，所述的进一步阐述和举例并不以任何方式限定本发明的专利保护范围。

实施例1本发明检测方法的方法学考察

一、标准溶液的配制

(1)标准系列溶液的配制

新利司他杂质a标准储备液配制方法：精密称取新利司他杂质a标准品适量，置于10ml容量瓶中，加四氢呋喃溶解定容，配成浓度为1000mg/l的新利司他杂质a标准储备液。

将新利司他杂质a标准储备液用20％四氢呋喃乙腈根据一定比例稀释，配成浓度梯度分别为100、50.0、20.0、4.00、1.00、0.400和0.200mg/l的标准工作液。

(2)内标溶液的配制

内标奥利司他标准储备液配制方法：精密称取奥利司他标准品适量，置10ml容量瓶中，加82％乙腈水溶解，并定容至刻度，配成浓度为1000mg/l的奥利司他标准储备液。

内标奥利司他标准工作液配制方法：吸取内标奥利司他标准储备液0.1ml，置100ml容量瓶中，加82％乙腈水稀释并定容至刻度，配成浓度为1mg/l的奥利司他标准工作液。

(3)标准质控溶液的配制

新利司他杂质a质控储备液配制方法：精密称取新利司他杂质a标准品适量，置10ml容量瓶中，加四氢呋喃溶解，并定容至刻度，配成浓度为1000mg/l的新利司他杂质a质控储备液。

将新利司他杂质a质控储备液用20％四氢呋喃乙腈根据一定比例稀释，配成浓度为160mg/l的稀释质控工作液和浓度分别为80.0、4.00、0.400和0.200mg/l的质控工作液。

各储备液及标准系列溶液置4℃冰箱保存备用。

二、分析方法的确证

1.方法的专属性

大鼠空白血浆50μl，除用10μl流动相代替内标溶液外，其余按“血浆样品预处理”项下方法操作，获得空白样品的色谱图(图1)；将一定浓度的新利司他杂质a对照品溶液和内标溶液加入空白血浆中，依“血浆样品处理”操作，获得相应的色谱图(图2)，取大鼠口服10mg/kg新利司他杂质a后12h的血浆样品，同法操作，得色谱图(图3)。其中新利司他杂质a的保留时间为3.22min，内标奥利司他的保留时间为1.78min；结果表明，血浆中内源性物质不干扰测定。

2.标准血浆样品的配制

分别取5μl相应浓度的新利司他杂质a标准工作液，加入到45μl空白血浆中，涡旋混匀。即配成含有一定浓度新利司他杂质a的标准血浆样品。

3.血浆样品预处理

取50μl大鼠含药血浆，加入5μl浓度为1mg/l的奥利司他内标工作液，加入145μl乙腈涡旋混匀，10000rpm离心10min，吸取150μl上清液加入10μl四氢呋喃混匀，进样3μl进行lc-ms/ms分析。

4.标准曲线和线性范围

取大鼠空白血浆45μl，加入系列混合标准溶液5μl，配制成相当于新利司他杂质a血浆浓度为10.0，5.00，2.00，0.40，0.10，0.0400，0.0200mg/l的模拟血浆样品，按“血浆样品预处理”项下操作，每一浓度进行双样本分析，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(w＝1/x²)最小二乘法进行回归分析。结果表明，新奥利司他杂质a在0.0200mg/l-10.0mg/l范围内线性关系良好，典型大鼠血浆样品标准曲线为y＝-0.00442068+0.00677983*x，r＝0.9991；定量下限(lloq)为0.0200mg/l。

5.精密度和准确度

取大鼠空白血浆45μl，按照“标准血浆样品的配制”项下方法，配制低(0.0400mg/l)、中(0.400mg/l)、高(8.00mg/l)三个浓度的质量控制(qc)样品。按“血浆样品预处理”项下操作，每一浓度进行6样本分析，连续测定3批，随行标准曲线。根据当日标准曲线计算qc样品的浓度，结果进行方差分析，求得方法的精密度rsd和准确度re，两个被测组分的日间rsd≤3.6％，日内rsd≤3.8％，re在3.6％～4.6％之间，达到相关规范要求。

6.基质效应

使用6个不同来源的大鼠空白血浆，配制低(0.0400mg/l)、中(0.400mg/l)、高(8.00mg/l)三个浓度水平进行基质效应考察。

样品a：取45μl纯化水，5μl新利司他杂质a工作液(0.400、4.00、.80.0mg/l)，5μl奥利司他(1.00mg/l)内标工作液和145μl乙腈，涡旋混匀，10000rpm离心10min，取150μl上清与10μl四氢呋喃混合，进样5μl进行lc-ms/ms分析。记录新利司他杂质a及内标奥利司他的色谱峰面积。

样品b：45μl空白大鼠血浆，加入145μl乙腈，涡旋沉淀蛋白，10000rpm离心10min；取140μl上清液加入5μl新利司他杂质a质控工作液(0.400、4.00、80.0mg/l)和5μl奥利司他(1mg/l)内标工作液及10μl四氢呋喃，混匀后进样5μl进行lc-ms/ms分析。记录新利司他杂质a和内标奥利司他的色谱峰面积。。

样品b测得的峰面积与相应浓度的样品a测得的峰面积比即为新利司他杂质a及内标奥利司他的基质效应。

结果表明待测物新利司他杂质a在低、中、高三个qc浓度水平上的基质效应分别为99.7％、93.3％、88.1％；内标奥利司他的基质效应为101％。因此在本试验选择的色谱和质谱条件下，可忽略基质效应对新利司他杂质a及奥利司他测定的影响。

7.提取回收率

样品c：按照“标准血浆样品的配制”项下配制高、中、低浓度水平的质控样品，采用“血浆样品预处理”的方法进行血浆样品处理，进行lc-ms/ms分析，记录新利司他杂质a及内标奥利司他的色谱峰面积。

样品c测得的峰面积与相应浓度的样品b测得的峰面积比即为新利司他杂质a及内标奥利司他的提取回收率。

结果表明低、中、高三浓度的回收率分别为103％，100％和105％。内标回收率以同法测定结果为101％。

8.样品稳定性

本发明考察了未处理的血浆样品室温放置6h的稳定性，血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性，处理后的血浆样品室温放置24h内的稳定性。每一项稳定性考察时，按“标准曲线和线性范围”项下配制低、中、高三个浓度的qc样品，每一浓度进行3样本分析，照“血浆样品的预处理”项下操作，测得样品浓度，计算相对误差(re％)。结果表明处理后的血浆样品室温放置24h内稳定，未处理的血浆样品室温放置4h稳定，血浆样品经历3次冻-融化循环后稳定。

总结，本方法所建立的uplc-ms/ms法检测大鼠血浆中新利司他杂质a度的方法准确可靠，其在专属性、精密度、回收率、稳定性及基质效应等方面均符合相关方法学考察限制要求。适合进行相关药代动力学试验样品的分析检测。

实施例2新利司他杂质a混悬液大鼠药代动力学试验

取体重约300g的sd大鼠12只，分为3组，雌雄各半；分别灌胃给药新利司他杂质a混悬液，低、中、高剂量组分别为20mg/kg、80mg/kg、320mg/kg。给药当天称量体重，根据体重精确计算给药剂量及相应体积。各组大鼠于给药前锁骨下静脉取空白血，于给药后0.5h、0.25、0.5、1、3、6、9、12和24h取血0.2ml，血液于4000rpm离心10min，取上层澄清血浆，迅速贮存于-20℃冰箱中待测定。

测定大鼠血浆中新利司他杂质a采用超高效液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)的高通量测定方法。具体为：

1.实验药品及仪器

1.1标准品与试剂

新利司他杂质a对照品(纯度98.9％，山东新时代药业股份有限公司，批号141201)

奥利司他对照品(内标物，纯度99.2％，中国食品药品检定研究院，批号530131106)

四氢呋喃：hplc级，merk

甲酸：hplc级，roescientificinc.。

甲醇：hplc级，merk；

乙腈：hplc级，merk；

纯化水(山东新时代药业有限公司)。

1.2仪器

分析天平：bt125d，sartorius,germany；

高速离心机：sigma3k15，sigma；

lc-ms/ms仪器组成：

watersacquityuplc/thermotsqendurams串联三重四级杆质谱仪；

工作站：xcalibur；

色谱柱：thermohypersilgold50*2.1；

1.3实验动物

sd大鼠来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。

2.实验方法和结果

2.1lc-ms/ms分析条件

2.1.1色谱条件：

流动相0.1％甲酸乙腈：0.1％甲酸水＝82:18；

流速：0.5ml/min；

柱温：30℃

样品盘温度：20℃

进样体积：3μl。

2.1.2质谱条件：新利司他杂质a和奥利司他的离子化采用电喷雾离子源，正离子模式。在srm扫描模式下，新利司他杂质a和奥利司他产生了质子化的母离子[m+h]⁺。所用的离子对和碰撞反应条件如下表：

离子源：h-esi；喷射电压：3500v；鞘气：40arb；辅助气：10arb；尾吹气：0arb；离子传输毛细管温度：325℃；气化温度：50℃。

2.2实验结果：

大鼠口服新利司他杂质a的非房室模型药代动力学分析：本项目建立的新利司他杂质a血药浓度测定方法学的定量限为0.0200mg/l，使大鼠在口服低、中、高剂量新利司他杂质a9-12h后依然能够检测到位于定量限附近的血药浓度，最低检测浓度小于cmax的1/20(中国药典2015版要求至少检测到cmax的1/10到1/20)。

新利司他杂质a口服吸收后约3小时达峰，低、中、高剂量新利司他杂质a口服后血药峰浓度cmax分别达到3.05、11.2和12.1mg/l，系统暴露量auc0-t分别为22.2，64.9和85.0mg/l*h。说明新利司他杂质a在大鼠体内的血药浓度并不随剂量增加而成线性增加。具体数据结果见表1。不同剂量下大鼠口服新利司他杂质a后的药时曲线见图4。

表1各组大鼠口服新利司他杂质a后的药代动力学参数