氟油在作为降低太赫兹波检测液相生物样本水敏感性的溶剂中的应用及方法与流程

本发明属于医学检测领域，涉及氟油在作为降低太赫兹波检测液相生物样本水敏感性的溶剂中的应用，还涉及利用氟油作为太赫兹波检测液相生物样本溶剂检测生物样本的方法。

背景技术：

太赫兹波是指频率为0.1到10thz，位于红外和微波之间的电磁波，是宏观电子学向微观光子学过渡的波段。近年来，随着thz波的产生和检测技术逐渐成熟和应用领域的极大拓展，国际国内thz技术的研发和应用方向已经发生了广泛而深刻的变化。由于其独特的电磁波特性，太赫兹研究工作的关注焦点除天文学、通讯、化学和国防安全等之外，近年来已转移到生物学应用中。由于生物大分子之间/内的弱相互作用力(氢键、范德华力)、骨架振动和偶极子旋转等正好处于thz频谱范围内，并且太赫兹脉冲具有良好的时间分辨率(皮秒量级)，使得太赫兹光谱技术和太赫兹成像技术近年来生物医学中的研究工作广泛开展开来，是当前受到极大重视的交叉前沿学科。长久以来thz波液相检测存在“水敏感性”这一技术瓶颈，所谓“水敏感性”是指：水分子对thz波及其敏感(室温下1thz处纯水的吸收系数为220-250cm^-1左右)，水对thz波的吸收占据了输出信号的大部分，使得识别溶液中的物质变的十分困难。由于包括细胞、细菌和生物大分子等在内的生物样本大多处于水相环境，同时检测环境中也存在水蒸气的干扰，导致靶细胞与靶分子检测信号被干扰与湮没。因此thz检测信号在穿过生物样本时大部分均被其周围的水分子损耗，导致输出信号微弱，给液态生物样本检测带来极大干扰。为了规避这一问题，既往的生物样本多制成固体压片，仅通过吸收峰的测定进行单一物质的鉴定，但在正常机体中生物大分子在液态环境中才能执行生理功能，活细胞也必须依赖液相环境，严重影响了thz光谱技术在生物医学领域的应用。

根据现有文献研究，克服thz波“水敏感性”问题主要有以下几个技术手段：

(1)thz波频段优化：研究表明在小于1thz的低频范围内，thz的“水敏感性”急剧降低，筛选优化thz波的频段有助于克服“水敏感性”；

(2)采用反射式探测方法：目前的太赫兹时域光谱技术可分为透射式与反射式，在透射模式下，thz经过样品时大部分被水吸收，检测信号微弱，而反射式时域光谱技术可以有效减少水对thz波的吸收；

(3)利用微流体技术：微流体技术是指在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的技术，当样品溶液通过微流体的微通道时，待测样品周围的水层厚度被减少到毫米或百微米级别，从而减少thz波接触细胞前的信号损失。

上述3种技术手段中，采用thz波频段优化和反射式的探测方法只是优化thz信号提取的方式，效果有限且并没有从根本上解决水对thz波的强烈吸收，而微流体技术受限于制作工艺和微通道内部摩擦力的影响，最多可将样品周围水层厚度减少至毫米或百微米级别，并不足以有效排除“水敏感性”的问题。因此，亟待解决“水敏感性”的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供氟油在作为降低太赫兹波检测液相生物样本水敏感性的溶剂中的应用，利用在thz频段吸收极低的氟油置换生物物质周围吸收极高的溶剂水的原理，降低生物样本thz波液相检测水敏感性；本发明的目的之二在于提供一种采用氟油降低太赫兹波检测液相生物样本水敏感性的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、氟油在作为降低太赫兹波检测液相生物样本水敏感性的溶剂中的应用。

本发明中，氟油是指氢氟油或全氟烃油，是一种具有极好的化学惰性、氧化稳定性、热稳定性和润滑性的无色无味液体，以往多应用于化工、电子、半导体等领域。

2、一种降低太赫兹波检测液相生物样本水敏感性的方法，包括如下步骤：将待检测生物样本中的待测物质固定于检测装置上，然后采用氟油冲刷样本置换周围水分子，最后进行thz光谱检测。

优选的，所述氟油冲刷样本置换周围水分子的条件为以微流注射泵注入，以20μl/min的流速冲刷至少5min。

优选的，所述生物样本为细胞、细菌或蛋白。

优选的，所述生物样本为细胞时检测方法如下：

将细胞悬液滴加于聚乙烯片上，细胞由于贴壁性可沉降紧贴于聚乙烯片上生长，24h后可形成密集排布的单层贴壁细胞爬片，然后将单层贴壁细胞爬片夹入检测夹具中，用微量注射泵注入氟油对有贴壁细胞的聚乙烯片以20μl/min的流速冲刷至少5min，封闭后进行thz光谱检测。

更优选的，所述细胞为浓度1.5×10⁶cell/ml的乳腺癌mda-mb-231细胞。

优选的，所述生物样本为细菌检测方法如下：

挑取待检测单菌落采用玻片旋涂法均匀涂于聚乙烯片上，制作细菌涂片；然后将涂片夹入检测夹具中，用微量注射泵注入氟油对细菌涂片以20μl/min的流速冲刷至少5min，封闭后进行thz光谱检测。

优选的，所述生物样本为蛋白见检测方法如下：

利用液滴微流体乳化技术将蛋白溶液与氟油制成50μm直径的“油包水”型液滴溶液，将25μl液滴溶液通入微流体芯片检测区，夹入检测夹具中，静置5min使液滴在检测区域内均匀分布，封闭后进行thz光谱检测。

更优选的，所述蛋白为浓度200mg/ml的牛血清白蛋白。

本发明的有益效果在于：本发明采用的氟油替代生物物质周围的水作为thz波检测时的溶剂主要有如下优点：

(1)氟油具有极佳的生物相容性：氟油的主要成分为氟、碳和氢，属于惰性液体，不含对一般生物物质有害的成分，其内也可溶解氧气。因此从分子组成上分析氟油作为溶剂时不会对细胞、细菌和生物大分子等生物大分子的活性和形态产生明显损害，可保证thz波检测时生物样本的真实性。除了氟油，二甲基硅油和肉豆蔻酸异丙酯是两种常见的惰性有机溶剂，图1比较了这三种溶剂覆盖于贴壁细胞上后采用cellcountingkit-8(cck-8)细胞增殖-毒性检测试剂盒测量的细胞存活率结果。结果显示作用时间为5分钟时细胞存活率无明显差别，当作用时间延长到30分钟时，氟油细胞存活率稍高于二甲基硅油，肉豆蔻酸异丙酯对细胞损害最为明显，当作用时间为1个小时后氟油作用的细胞存活率仍处于80％以上，明显高于其他两种惰性有机溶剂，说明氟油对细胞活性影响最小。此外，图2展示了氟油在覆盖细胞前和覆盖细胞30min后细胞形态的原子力显微镜检测结果，图像显示氟油作为活细胞的溶剂覆盖细胞30min后不会对活细胞胞体形态造成较大影响。以上结果说明氟油在生物相容性方面具有明显的优势。本领域人员共知活细胞和死细胞在太赫兹波段具有不同的光谱响应特性且细胞胞体形态变化也会影响太赫兹光谱检测结果，因此采用对细胞活性损害小、对活细胞胞体形态影响微弱的氟油作为液相检测溶剂对于获取样本真实的太赫兹波响应特征具有重要意义。

(2)氟油在thz频段吸收极低：氟油在室温下1thz处的吸收系数为4.5cm^-1左右，仅为纯水的1/50左右，因此在相同液层厚度的情况下thz波穿过氟油层时其能量损耗远远低于其穿过水层时。采用氟油置换生物物质周围的溶剂水可以降低thz检测信号在穿过液态样本时的信号损失，提高输出thz波检测信号的强度。二甲基硅油和肉豆蔻酸异丙酯在室温下1thz处的吸收系数分别为16和11.5cm^-1左右，均大于氟油。因此，氟油在降低信号损失，消除水敏感性方面的能力更强(图3)。

(3)氟油密度大于水：水的密度为1g/cm³，而本发明所用的氟油密度为1.8-2g/cm³左右，采用氟油冲刷固定的生物样本时，密度较大的氟油会向下沉降，而生物物质周围密度较小的水层会由于密度差异自动浮于氟油层上方，因此采用氟油对生物样本周围的溶剂水分子进行置换可达到完全替代目的。而二甲基硅油(0.963g/cm³)和肉豆蔻酸异丙酯(0.85g/cm³)的密度均小于水，冲刷固定的生物物质时，会浮于其周围水层的上方，难以完全替代。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为氟油、二甲基硅油和肉豆蔻酸异丙酯对细胞的影响。

图2为氟油覆盖细胞前后效果图(a：氟油覆盖细胞前；b：氟油覆盖细胞后30分钟)。

图3为不同溶剂在thz频段的吸收系数。

图4为氟油冲刷生物样本置换周围水分子的条件优化图。

图5为氟油作为溶剂检测肿瘤细胞结果。

图6为氟油作为溶剂检测细菌结果。

图7为氟油作为溶剂检测蛋白结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1、氟油冲刷生物样本置换周围水分子的条件优化

氟油冲刷生物样本置换周围水分子的条件优化方法，具体步骤如下：

(1)以肿瘤细胞为生物物质模型，将5ml浓度为1.5×10⁶cell/ml的乳腺癌mda-mb-231细胞悬液滴加于聚乙烯(pe)片上，制作单层贴壁细胞爬片；

(2)将细胞爬片夹入带有一个进样孔和一个出样孔的检测夹具中(德国布鲁克公司的液体样本检测池，型号：a145，购买途径：布鲁克公司)，从进样孔以微流注射泵注入氟油，以20μl/min的流速冲刷pe片，每隔1min记录一次样本的thz光谱检测结果。

检测结果如图4所示，前5min内thz光谱的检测信号逐步增强，说明细胞周围对thz光谱吸收极强的水被氟油逐步冲刷走。冲刷5min后thz光谱的检测信号逐渐稳定，说明此时细胞周围的水分子已经基本被氟油置换完毕。因此在20μl/min的流速下至少冲刷5min可达到置换生物物质周围水分子的目的。

实施例2、利用氟油作为溶剂检测肿瘤细胞

氟油作为溶剂检测肿瘤细胞的方法，具体步骤如下：

(1)将5ml浓度为1.5×10⁶cell/ml的乳腺癌mda-mb-231细胞悬液滴加于聚乙烯(pe)片上，制作单层贴壁细胞爬片；

(2)将细胞爬片夹入带有一个进样孔和一个出样孔的检测夹具中(同实施例1)。实验组：从进样孔中以微流注射泵注入氟油对有无贴壁细胞的pe片以20μl/min的流速冲刷至少5min；对照组：从进样孔中以微流注射泵注入培养基对有无贴壁细胞的pe片以20μl/min的流速冲刷至少5min；

(3)封闭夹具的进样孔和出样孔，进行thz光谱检测。

检测结果如图5所示。结果显示，当细胞周围为培养基(主要成分为水)时，thz波透过率极低且有细胞和无细胞覆盖的pe片的thz透过率基本相同，有无细胞的差异难以区分。而当细胞周围为氟油时，thz波透过率明显提高且有细胞覆盖的pe片的thz透过率明显低于无细胞覆盖时，细胞对thz波的响应得以体现。采用氟油替代水层的方法可降低thz检测信号在穿过液态样本时的信号损失，提高输出thz波检测信号的强度，有效降低细胞液相检测时的水敏感性。

实施例3、利用氟油作为溶剂检测细菌

氟油作为溶剂检测细菌的方法，具体步骤如下：

(1)挑取纯培养后血平板上的单个细菌菌落采用玻片旋涂法均匀涂于聚乙烯(pe)片上，制作细菌涂片；

(2)将细菌涂片夹入带有一个进样孔和一个出样孔的检测夹具(同实施例1)中，实验组：从进样孔中以微流注射泵注入氟油对有细菌的涂片以20μl/min的流速冲刷至少5min；对照组：从进样孔中以微流注射泵注入pbs缓冲液对无细菌的涂片以20μl/min的流速冲刷至少5min；

(3)封闭夹具的进样孔和出样孔，进行thz光谱检测。

检测结果如图6所示。结果显示，当细菌涂片周围为pbs缓冲液(主要成分为水)时，thz波透过率极低且有细菌和无细菌覆盖的pe片的thz透过率基本相同，有无细菌的差异难以区分。而当细菌涂片周围为氟油时，thz波透过率明显提高且有细菌胞覆盖的pe片的thz透过率明显低于无细菌覆盖时，细菌对thz波的响应得以体现。采用氟油替代水层的方法可降低thz检测信号在穿过液态样本时的信号损失，提高输出thz波检测信号的强度，有效降低细菌液相检测时的水敏感性。

实施例4、利用氟油作为溶剂检测蛋白液滴检测

氟油作为溶剂检测蛋白液滴的方法，具体步骤如下：

(1)利用液滴微流体乳化技术将浓度为200mg/ml的牛血清白蛋白(bsa)溶液与氟油制成50μm直径的“油包水”型液滴溶液(液滴内部为bsa溶液，外部为氟油)；

(2)将“油包水”型液滴注入带有一个进样孔和一个出样孔的检测夹具(同实施例1)中，静置5min使液滴在检测区域内均匀分布；

(3)封闭夹具的进样孔和出样孔，进行thz光谱检测；分别以bsa溶液、bsa液滴和pbs作为对照。

检测结果如图7所示。结果显示，当bsa溶于pbs缓冲液(主要成分为水)时，thz波透过率极低且和纯pbs的thz透过率基本相同，差异难以区分。而当将bsa制成液滴，以氟油置换蛋白周围水分子时，bsa液滴和纯氟油的差异增大，bsa对thz波的响应进一步增强。采用氟油替代水层的方法可降低thz检测信号在穿过液态样本时的信号损失，提高输出thz波检测信号的强度，有效降低蛋白液滴检测时的水敏感性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。