一种免疫生物传感器的制备方法及其应用与流程

本发明涉及免疫生物传感器领域，特别涉及一种免疫生物传感器的制备方法及应用。

背景技术：

石墨烯是最近几年发现的一种特殊的二维碳纳米材料且仅有单原子厚度，具有高的导电性、大的比表面积和室温电子迁移率，并具有优秀的机械力学性能。常温下电子速率极快，电子迁移率超过15000cm²/v·s，远远超过一般导体中电子的传递速度，而其电阻率极低，仅为10^-8ω·cm，且各种原子和分子都可被它吸附和脱附，结构非常稳定，石墨烯修饰电极如今已被应用到多种物质的检测中。普鲁士蓝，又名铁蓝、柏林蓝等，分子式为fe4[fe(cn)6]3，具有优良的电化学可逆性和优良的催化性。其三维网状结构是也是非常独特的，在无机结构中是目前已知最独特的，其三维网状结构与交联的有机聚合物类似，具有优异的稳定结构，且其电化学可逆性非常高，可以当作电子传递的媒介物，并且能降低氧化还原性质，特别是过氧化物电化学反应的过电位，被称为“人工过氧化物酶”，是辣根酶很好的替代品，同时普鲁士蓝制造容易，成本低廉。

猪流行性腹泻病毒引起猪流行性腹泻，是猪的一种急性高度接触性的肠道传染病，临床症状以腹泻，脱水和呕吐为主要特征，是导致哺乳仔猪死亡的重要原因之一，给全世界的养猪业带来了巨大的经济损失。该病毒难以分离，研究者主要通过分子生物学技术如原位杂交技术，pcr技术，荧光定量pcr技术进行分离鉴定。在临床检测主要采用血清学检测，微量血清中和实验，免疫荧光法，酶联免疫吸附试验，免疫组化法以及胶体金免疫层析法等。这些方法虽然能够对猪流行腹泻病毒进行定性定量分析，但其耗时过长，且检测设备不方便携带，难以做到现场检测。

如何通过复合石墨烯和普鲁士蓝制备出一种可灵敏、精准、稳定检测猪流行腹泻病毒的免疫生物传感器，使其可应用于非实验室设置的检测，在行业中具有重大意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种免疫生物传感器的制备方法，同时提供该制备得的免疫生物传感器的在非实验室设置中对猪流行性腹泻病毒检测的应用。

本发明所采取的技术方案是：一种免疫生物传感器的制备方法，其包括如下工艺步骤：

1)将浓度为1mg/ml的氧化石墨烯分散液滴涂在电极基体表面，室温干燥，后将其置于0.1mol/l氯化钾溶液中，采用循环伏安法以100mv/s的扫描速率在-1.5～0.5v的电位范围内扫描20圈，得还原石墨烯修饰电极；

2)将步骤1)所得的还原石墨烯修饰电极插入浓度为0.1mol/l的普鲁士蓝溶液中，采用循环伏安法以50mv/s的扫描速率在0～1.0v电位范围内扫描60圈，形成普鲁士蓝沉积层，得普鲁士蓝/石墨烯修饰电极；

3)将猪流行性腹泻病毒单克隆抗体滴涂在步骤2)所得的普鲁士蓝/石墨烯修饰电极表面，室温干燥，后浸入到质量浓度为1～2％的牛血清蛋白溶液中，水浴反应0.5～1h，得免疫生物传感器。

作为上述方案的进一步改进，步骤1)中所述的电极基体为玻碳电极。

作为上述方案的进一步改进，步骤2)中所述的浓度为0.1mol/l的普鲁士蓝溶液中含有0.2mol/l的铁氰化钾、0.2mol/l的氯化铁和0.1mol/l的氯化钾。

作为上述方案的进一步改进，步骤3)中所述的室温干燥的干燥时间为2～4h。

作为上述方案的进一步改进，步骤3)中所述的水浴反应的温度为37℃。

本发明还提供了一种如上所述的制备方法制备所得的免疫生物传感器。

本发明所采取的另一个技术方案为，一种如上所述的免疫生物传感器在猪流行性腹泻病毒检测中的应用。

作为上述方案的进一步改进，其包括如下检测步骤：

1)将该免疫生物传感器浸入浓度为15μg/ml的猪流行性腹泻病毒中，30min后取出用重蒸馏水淋洗，然后浸入浓度为50μg/ml的猪流行性腹泻病毒多克隆抗体中，30min后取出用重蒸馏水淋洗，得工作电极；

2)将步骤1)所得工作电极浸入到待测样品中进行免疫反应，反应后取出用pbs缓冲液洗净，以ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，采用循环伏安法并根据循环伏安图进行猪流行性腹泻病毒的定性定量检测。

作为上述方案的进一步改进，步骤2)中所述的采用循环伏安法检测的测定条件为采用经pbs定容的ph7.0的底液、扫速为900mv/s，猪流行性腹泻病毒在10^-9～10^-5μg/ml浓度范围内呈线性关系，信噪比为3时检出限为2.5×10^-9μg/ml。

作为上述方案的进一步改进，所述底液为含有0.1mol/l的k4fe(cn)6、0.2mol/l的k3fe(cn)6和0.1mol/l的kcl的浓度为0.01mol/l的pbs缓冲溶液。

本发明的有益效果是：

(1)本发明将猪流行性腹泻病毒单克隆抗体滴涂在普鲁士蓝/石墨烯修饰电极表面并利用牛血清蛋白溶液封闭电极上其余非特异性活性位点，同时限定制备方法中的重要工艺参数，从而使制备得的免疫生物传感器具有优异的灵敏性、准确性和稳定性。

(2)本发明的制备方法简单高效，制备得的免疫生物传感器适用于非实验室设置中对猪流行性腹泻病毒的快速测定。

(3)本发明在猪流行性腹泻病毒现场检测中的应用具有可行性和高效性，其根据循环伏安图中峰电流值走向及其下降的幅度可实现对猪流行性腹泻病毒的定性定量检测。

附图说明

本发明的附图1为不同ph值的循环伏安图；

本发明的附图2为不同底液的循环伏安图；

本发明的附图3为不同扫速的循环伏安图；

本发明的附图4为免疫生物传感器检测不同浓度的猪流行性腹泻病毒的循环伏安图；

本发明的附图5为免疫生物传感器特异性检测结果；

本发明的附图6为免疫生物传感器检测编号为a～f待测试样的循环伏安图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。

实施例1：免疫生物传感器的制备

一种免疫生物传感器的制备方法，其包括如下工艺步骤：

1)用移液枪取浓度为1mg/ml的氧化石墨烯分散液10μl滴涂在电极基体表面，室温干燥，后将其置于0.1mol/l氯化钾溶液中，采用循环伏安法以100mv/s的扫描速率在-1.5～0.5v的电位范围内扫描20圈，得还原石墨烯修饰电极；

2)将步骤1)所得的还原石墨烯修饰电极插入浓度为0.1mol/l的普鲁士蓝溶液中，采用循环伏安法以50mv/s的扫描速率在0～1.0v电位范围内扫描60圈，形成普鲁士蓝沉积层，得普鲁士蓝/石墨烯修饰电极；

3)将猪流行性腹泻病毒单克隆抗体滴涂在步骤2)所得的普鲁士蓝/石墨烯修饰电极表面，室温干燥2～4h，后浸入到质量浓度为1～2％的牛血清蛋白溶液中，在37℃温度条件下水浴反应0.5～1h，得免疫生物传感器。

进一步作为优选的实施方式，步骤1)中所述的电极基体为玻碳电极。具体地，本发明在制备免疫生物传感器前先对所述电极基体，即裸玻碳电极进行预处理：先将玻碳电极用粒径为0.05μm的氧化铝粉在麂皮上抛光，然后依次在无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗，室温条件下干燥。经预处理所得的玻碳电极具有良好的表面理化性能，有利于保证后续电极修饰过程中的电极基体的稳定性。

进一步作为优选的实施方式，步骤1)中所述的浓度为1mg/ml的氧化石墨烯分散液的是将1mg干燥的氧化石墨烯分散在1ml蒸馏水中，超声20min处理得到，其具有良好的稳定性。

进一步作为优选的实施方式，步骤2)中所述的浓度为0.1mol/l的普鲁士蓝溶液中含有0.2mol/l的铁氰化钾、0.2mol/l的氯化铁和0.1mol/l的氯化钾。

实施例2：免疫生物传感器检测条件的确定

(1)不同ph对其检测猪流行性腹泻病毒的影响

将经抗体包被处理后的免疫生物传感器分别在ph6.4、ph6.7、ph7.0、ph7.5和ph8.0的底液中通过循环伏安法进行测试，测试结果如图1所示，得到用相同的扫描速度在相同的电势范围内，ph7.0的底液为该免疫生物传感器检测猪流行性腹泻病毒的最优条件之一。

(2)不同底液对其检测猪流行性腹泻病毒的影响

将经抗体包被处理后的免疫生物传感器分别置于蒸馏水和经pbs定容的底液中，用循环伏安法进行测试，测试结果如图2所示，得到用相同的扫描速度在相同的电势范围内，经pbs定容的底液为该免疫生物传感器检测猪流行性腹泻病毒的最优条件之一。

(3)不同扫速对其检测猪流行性腹泻病毒的影响

将经抗体包被处理后的免疫生物传感器置于经pbs定容的底液中，控制扫速为50～990mv/s范围内用循环伏安法进行测试，测试结果如图3所示，根据峰值变化是否明显，得到扫速为900mv/s为该免疫生物传感器检测猪流行性腹泻病毒的最优条件之一。

(4)对猪流行性腹泻病毒灵敏度的确定

将经抗体包被处理后的免疫生物传感器置于经pbs定容的底液中，采用循环伏安法对不同浓度的猪流行性腹泻病毒试样进行测试，测试结果如图4所示，可知用相同的扫描速度在相同的电势范围内，峰电流随着猪流行性腹泻病毒的浓度增加而下降，这是由于抗原-抗体的免疫反应阻碍了自由电子的传递，从而得到该免疫传感器检测猪流行性腹泻病毒在10^-9～10^-5μg/ml浓度范围内呈线性关系，相关系数(r)为0.9985，信噪比为3时检出限为2.5×10^-9μg/ml。

实施例3：免疫生物传感器的性能检测

(1)稳定性

将该免疫传感器放于4℃冰箱内保存，放置30天后再重新检测，并记录电流响应，与初始信号相比较，其具有良好的一致性。

(2)特异性

采用该免疫传感器检测含prrvs、csfv、fmdv阳性的对比试样，用循环伏安法检测试样中的病毒，其检测结果如图5所示，可见对比试样的电流下降明显，其明显区别于对猪流行性腹泻病毒的检测结果。

实施例4：免疫生物传感器在猪流行性腹泻病毒检测中的应用

本发明中免疫生物传感器对猪流行性腹泻病毒的检测包括如下步骤：

1)分别取病猪的肠、粪便组织充分研磨并用灭菌后的ph7.4的pbs进行稀释溶解，反复冻融3次后在5000r/min转速条件下高速离心处理10min，重复离心处理3次，取上清液装于灭菌离心管中，得编号为a～f的待测样品，并放于4℃冰箱密封保存；

2)将该免疫生物传感器浸入浓度为15μg/ml的猪流行性腹泻病毒中，30min后取出用重蒸馏水淋洗，然后浸入浓度为50μg/ml的猪流行性腹泻病毒多克隆抗体中，30min后取出用重蒸馏水淋洗，得工作电极；

3)将步骤2)所得工作电极分别对步骤1)所得编号为a～f的待测样品进行检测，具体是将步骤2)浸入到各待测样品中进行免疫反应，反应后取出用pbs缓冲液洗净，以ag/agcl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，在实施例3确定的检测条件下采用循环伏安法并根据循环伏安图进行猪流行性腹泻病毒的定性定量检测，其对各待测样品的检测结果如图6所示。

上述实施例中所述底液为含有0.1mol/l的k4fe(cn)6、0.2mol/l的k3fe(cn)6和0.1mol/l的kcl的浓度为0.01mol/l的pbs缓冲溶液。

本发明该实施例中，根据图6检测结果可以看出峰电流值下降，即固定在电极表面上的抗体与待测样品中的病毒发生免疫，其响度电流降低，以此作为该免疫生物传感器对猪流行性腹泻病毒定性检测的依据，同时以测试结果中免疫反应前后峰电流值下降的幅度来作为该免疫生物传感器对猪流行性腹泻病毒定量检测的依据。

上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。