一种检测水体毒性的双信号生物电化学方法与流程

本发明涉及一种检测水体毒性的双信号生物电化学方法，属于生化检测技术领域。

背景技术：

近一个世纪以来，工农业的快速发展使环境受到越来越严重的污染。尤其是水环境，大量的有机物、重金属、农药进入到水环境中，成为水体污染的主要来源。为了加强河水及饮用水的安全，我国近年来将水质毒性纳入控制标准。

常用的水质毒性检测方法主要是理化方法和生物方法。理化方法通过复杂的物理化学仪器手段来检测水中有毒污染物，如卤代烃、除草剂、杀虫剂、重金属等污染物质。但污染物对生态系统的综合影响并不是每种单一物质毒性的简单相加，因此理化分析方法并不能直接全面地反映有毒物质对环境、生物的综合影响。此外，理化分析方法还需要昂贵的仪器设备，监测范围有限，操作程序复杂，不适用于水体生物毒性的快速、在线监测。

生物检测水体毒性主要是利用毒性污染物对细菌、藻类、鱼类等的生理代谢或细胞活性的抑制作用进行检测，但是，对细胞生理代谢或细胞活性的影响进行检测往往需要较长的实验周期，且操作繁琐、费用高，结果不稳定，重复性差，不能及时反映水质情况，无法满足对环境质量实时预报预警、突发毒物泄漏应急监测、污染处理设施在线监控等的需要，不适用于常规的检验。

生物电化学传感器是指以生物材料或生物本身作为识别元件，电极作为换能元件，以电势或者电流作为信号输出的传感器。由于其输出信号易检测识别、仪器要求简单、不需要复杂的预处理、检测成本低而备受关注。《wiringbacterialelectronflowforsensitivewhole-cellamperometricdetectionofriboflavin》一文中(analyticalchemistry,2016,88:11222-11228)提及可以通过希瓦氏菌与电极之间电子流动的关系实现对核黄素的检测，证明该细胞与电极之间的电子流动和细胞的活性有关。基于此，我们设计了以希瓦氏菌的电化学活性为指标来实现以3,5二氯苯酚(dcp)、cu²⁺、cd²⁺、zn²⁺、cr⁶⁺五种有毒污染物为代表的水体毒性检测的生物电化学传感器。

《p-benzoquinone-mediatedamperometricbiosensordevelopedwithpsychrobactersp.fortoxicitytestingofheavymetals》文中当存在有毒污染物时，微生物的呼吸作用受到抑制，阻碍了微生物和电子媒介体之间的电子传递从而来反映有毒污染物毒性大小。本发明中水体毒性对希瓦氏菌细胞的电化学活性的抑制通过三电极系统的阳极电流大小变化来进行实时监测，不需要额外添加电子媒介，输出电流的抑制率可以直接作为水体毒性的指示信号之一。此外，由于希瓦氏菌电活性受到水体毒性的抑制，在三电极系统中输出电流达到最大值所需的时间也会随着毒性的增加而延长。达到最大电流值的延迟时间可以作为水体毒性的另一种指示信号。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种双信号检测水体毒性的生物电化学方法，为水体毒性的检测提供了一种简单、快速、可靠的工具。

本发明的技术方案是：

一种双信号检测水体毒性的生物电化学方法，按以下步骤进行操作：

(1)在lb液体培养基中过夜活化希瓦氏菌种，将活化的希瓦氏菌菌液离心，离心后的沉淀加入到反应缓冲溶液中。

(2)将三电极安装在步骤(1)所得反应缓冲溶液中，连接信号检测系统，组成生物电化学传感器。

(3)在步骤(2)中的生物电化学传感器中加入有毒污染物，孵育一定时长。

(4)在步骤(3)中的生物电化学传感器的工作电极上加载外电压，记录电流变化值和电流达到最大值所需时间，计算电流的抑制率。

其中希瓦氏菌(shewanellaoneidensismr-1)，购自美国模式菌种保藏中心(atcc)；将保存的希瓦氏菌接种至培养基进行培养，获得活化的菌体。

其中反应缓冲液由以下物质组成，总体积5％的lb液体培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠5g/lph＝7；总体积95％的m9培养基：na2hpo4.12h2o17.8gl^-1、kh2po43gl^-1、nacl0.5gl^-1、nh4cl1gl^-1；终浓度为18mm的乳酸钠、0.1mm的cacl2和1mm的mgso4。

其中，步骤(1)中所述的希瓦氏菌沉淀加入到反应缓冲溶液中，其od值控制在0.5-2之间。

步骤(2)中所述的三电极分别为，工作电极：碳布、参比电极：饱和甘汞电极和对电极：铂丝电极。

步骤(2)中所述的信号检测系统由记录电流输出的仪器和控制电位的仪器组成，如电化学工作站chi660e、chi1000e(上海辰华仪器有限公司)。

步骤(3)中所述的有毒污染物为dcp、cu²⁺、cd²⁺、zn²⁺或cr⁶⁺。

步骤(3)中所述的孵育时长为10min-300min。

步骤(4)中所述的生物电化学传感器所加载的外电压为0v-0.5v。

步骤(4)中所述的电流抑制率(inhibitioncurrent，ic)可通过公式计算

ic＝100×(icon-itox)/icon，电流抑制率可以表征水体毒性大小，计算得到ic50值(即电流抑制率达到50％时有毒污染物浓度)来衡量毒性大小。另外达到最大电流值的延迟时间t＝ttox-tcon,t与有毒污染物的浓度呈一定的线性关系，通过t可以来反映有毒污染物毒性的大小。如图2所示。

其中icon：不含有毒污染物水样的电流值；

itox：含有有毒污染物水样的电流值；

tcon：不含有毒污染物水样达最大电流值所需的时间；

ttox：含有毒污染物水样达最大电流值所需的时间。

本发明的有益效果：

本发明使用了简单的电化学仪器来实现电压控制和电流信号记录，所以检测的成本低廉；以希瓦氏菌的电化学活性作为毒性指标，水体毒性的浓度范围与最大输出电流的抑制率、细胞达到最大电流所需时间之间有良好线性关系，可以实现对水体毒性的双信号检测。

附图说明

图1为本发明的生物电化学传感器实物图。

图2电流抑制率曲线图。

图3控制不同od值的电流抑制率结果。

图4加载不同外电压的电流抑制率结果。

图5添加不同浓度dcp电流输出结果。

图6添加不同浓度cu²⁺电流输出结果。

图7添加不同浓度cd²⁺电流输出结果。

图8添加不同浓度zn²⁺电流输出结果。

图9添加不同浓度cr⁶⁺电流输出结果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体描述，其目的在于更好的理解本发明的技术内涵，但是本发明的保护范围不限于以下的实施范围。

实施例1：

(1)使用菌种：希瓦氏菌(shewanellaoneidensis)，购自atcc美国模式菌种保藏中心，菌种编号atcc700550。

(2)希瓦氏菌菌液的获得：向lb培养基(含酵母提取物5g/l，胰蛋白胨10g/l和氯化钠5g/l，ph＝7.0)中接入希瓦氏菌菌种，于30℃、震荡转数200rpm过夜培养，获得菌液。

(3)生物电化学传感器的反应缓冲液的配制：0.6mllb培养基和11.4mlm9培养基充分混合，另外添加乳酸钠、氯化钙、硫酸镁使其终浓度分别达到18mm、0.1mm和1mm。

(4)过夜培养的希瓦氏菌液5000rpm离心，所获得的菌体沉淀加入到反应缓冲溶液中，控制od值在1.0。

(5)生物电化学传感器的组装：将由钛丝连接的1x2cm的碳布组成的工作电极、饱和甘汞电极、铂丝电极安装在上述溶液中，连接电化学工作站chi660e(上海辰华仪器有限公司)，组成生物电化学传感器

(6)在生物电化学传感器中加入20mg/l的dcp标准液，孵育1h。

(7)在生物电化学传感器的工作电极上加载0.5v电压，记录电流变化值。

(8)标准曲线绘制：用超纯水配制浓度为0mg/l、10mg/l、15mg/l、30mg/ldcp的标准溶液。准备4个生物电化学传感器，加入不同浓度的标准溶液，施加0.5v电压，记录电流的变化曲线(图5)。从图5中即可以看出，随着加入dcp的浓度的提高，最大电流的抑制率和电流达到最大值所需时间(t)与dcp的浓度之间一定的线性关系；dcp浓度与最大电流的抑制率正比，并且与电流达到最大值所需时间成正比，计算得到dcp的ic50为13mg/l。

实施例2：

与实施例1基本相同，但有以下改变：菌体od值控制在0.5。电流抑制结果如图3所示。0.5的菌体od值亦可检测dcp毒性大小。

实施例3：

与实施例1基本相同，但有以下改变：菌体od值控制在1.5。电流抑制结果如图3所示。1.5的菌体od值亦可检测dcp毒性大小。

实施例4：

与实施例1基本相同，但有以下改变：菌体od值控制在2.0。电流抑制结果如图3所示。2.0的菌体od值亦可检测dcp毒性大小。

实施例5：

与实施例1基本相同，但有以下改变：工作电极上施加的电压为0v。电流信号如图4所示。0v的电压值亦可检测dcp毒性大小。

实施例6：

与实施例1基本相同，但有以下改变：工作电极上施加的电压为0.2v。电流信号如图4所示。0.2v的电压值亦可检测dcp毒性大小。

实施例7：

与实施例1基本相同，但有以下改变：工作电极上施加的电压为0.3v。电流信号如图4所示。0.3v的电压值亦可检测dcp毒性大小。

实施例8：

与实施例1基本相同，但有以下改变：加入的有毒污染物为不同浓度cu²⁺。电流信号如图6所示，计算得到cu²⁺ic50为2mg/l。

实施例9：

与实施例1基本相同，但有以下改变：加入的有毒污染物为不同浓度cd²⁺。电流信号如图7所示，计算得到cd²⁺ic50为10mg/l。

实施例10：

与实施例1基本相同，但有以下改变：加入的有毒污染物为不同浓度zn²⁺。电流信号如图8所示，计算得到zn²⁺ic50为20mg/l

实施例11：

与实施例1基本相同，但有以下改变：加入的有毒污染物为不同浓度cr⁶⁺。电流信号如图9所示，计算得到cr⁶⁺ic50为3.5mg/l。