本发明属于生物传感器检测领域，具体涉及一种基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法。
背景技术：
在生物医学研究和临床应用领域研究小分子和蛋白质的相互作用非常重要，例如生理上的小分子和蛋白质的相互作用、小分子药物和相应的蛋白质的相互作用等等，同时与信号转导、生理代谢相关的蛋白质在许多情形下通过和小分子相互作用实现相应的功能，因此对小分子和蛋白质进行检测在药物分析和临床诊断领域发挥着重要的作用。
小分子和蛋白质的理化性质不同，适用的检测体系不同，一般需要单独的检测体系才能实现两种物质的分别检测。目前，小分子的检测方法主要包括高效液相色谱-质谱法（hplc-ms）、气相色谱（gc）、气相色谱-质谱分析法（gc-ms）等，蛋白质的检测方法主要包括酶联免疫吸附试验（elisa）、蛋白质印记（wb）、比色法、荧光法等。因此，为了提高检测效率、降低检测成本，开发在同一体系中检测小分子和蛋白质的方法显得尤为重要。
拉曼光谱属于分子振动光谱，可以反映分子的特征结构，但是拉曼散射效应是个非常弱的过程，随着科学研究的进一步发展，人们发现拉曼强度可以在粗糙的金属表面实现增强，引起了科学工作者广泛的研究兴趣。除了用于分析分子的结构之外，表面增强拉曼光谱也成为了
一种快速灵敏的检测技术，尤其是以贵金属纳米材料为基底，拉曼信号强度提高多个数量级，能够实现常规方法不能检测到的信号，甚至能够达到单分子检测水平，从而使得贵金属纳米粒子单体或者组装体在拉曼光谱中的研究范围不断扩大。
技术实现要素：
要解决的技术问题：现有的检测小分子和蛋白质的方法需要在独立的体系中进行，从而降低了检测效率，提高了检测成本。
技术方案：本发明公开了一种基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法，包括如下步骤：
（1）磁核金壳复合纳米粒子的合成
称取新合成的磁纳米粒子粉末10mg，加入100ml超纯水超声分散10min，然后在搅拌的状态下加入5ml质量浓度为0.4%的氯金酸，搅拌均匀后在超声的状态下加入3ml质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液，继续超声直到溶液颜色由浅黄色逐渐变成黑色反应终止，在外加磁场的作用下进行磁分离，去除上清，并用超纯水将沉淀物利用磁分离清洗3次，从而得到金壳包裹的磁性复合物，金壳的厚度为5nm。
（2）金纳米粒子的合成
金纳米粒子通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法合成，并通过紫外吸收光谱进行紫外信号的表征，通过透射电子显微镜进行表面形态和粒径的表征。
（3）纳米粒子修饰信标分子
将步骤（2）合成的金纳米粒子在8000r/min的条件下离心5min，去除上清用ph7.2的0.01mpbs缓冲液将金纳米粒子进行重悬，向金纳米粒子中加入信标分子，使得其终浓度为5~10μm，在室温下孵育4h，然后在8000r/min的条件下离心5min去除上清，再用pbs缓冲液将其重悬。
（4）金磁复合纳米粒子修饰链霉亲和素
取5ml步骤（1）合成的金磁复合纳米粒子在外加磁场的作用下吸附，去除上清用ph7.2的0.01mpbs缓冲液将纳米粒子进行重悬，并用0.1mk2co3溶液将ph调整到8.6，然后加入500μl浓度为1mg/ml的链霉亲和素，在缓慢振荡的条件下反应30min，然后加入500μlbsa溶液使得bsa的终浓度为1%，再在振荡的条件下反应40min，通过外加磁场去除上清，并用ph7.2的0.01mpbs缓冲液将纳米粒子进行重悬，得到金磁复合纳米粒子修饰的链霉亲和素。
（5）金纳米粒子修饰生物素
取2ml步骤（3）制备的金纳米粒子，测得其终浓度为20nm，向其中加入生物素修饰的dna分子，使得dna的终浓度为40nm，将其在室温下孵育6h后，在8000r/min的条件下离心5min，得到金纳米粒子修饰的生物素；
生物素修饰的dna：5’-sh-aaaaa-biotin-3’。
（6）磁性纳米组装体的制备以及小分子蛋白质的双重检测
将40μl步骤（4）制备的纳米粒子和50μl步骤（5）制备的纳米粒子混合，分别加入10μl浓度为0nm、0.1nm、0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm、50nm的生物素，另一组检测体系分别加入浓度为0nm、0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm的链霉亲和素，在室温条件下孵育0.5~2h，随后外加磁场去除上清，吸附的磁纳米复合粒子用50μl超纯水进行重悬，分别测定上清和磁纳米复合粒子在1334cm-1处的表面增强拉曼光谱强度。
本发明所述的基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法中所述的磁纳米粒子的合成步骤为：在50ml的乙二醇中加入无水乙酸钠和fecl3·6h2o，使得其终浓度分别为10mm和2mm，将其进行超声分散5min，然后转入反应釜中，200℃的条件下反应8h，反应结束后将反应釜取出使之自然冷却至室温，用超纯水和乙二醇交替洗涤5次，洗涤最后一次的沉淀物用50ml的甲苯分散，倒入圆底烧瓶中，加入1ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌下80℃回流反应6h，将其冷却至室温，再用超纯水和乙二醇交替洗涤5次，最后将磁纳米粒子沉淀物进行真空干燥得到固态的粒径为10nm的磁纳米粒子。
本发明所述的基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法中所述的金纳米粒子的合成步骤为：将95ml超纯水加入干净的锥形瓶中，再加入2.5ml质量浓度为0.4%的氯金酸溶液，置于加热磁力搅拌器上加热至沸腾，沸腾10min后，迅速加入2.5ml质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，待溶液由无色变为酒红色后持续加热5min，停止加热后继续搅拌至溶液冷却至室温，通过紫外吸收光谱扫描得到的金纳米粒子的最大吸收峰在521nm，通过透射电子显微镜观察到金纳米粒子的粒径为10nm。
本发明所述的基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法中所述的信标分子为4-硝基苯硫醇。
本发明所述的基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法中所述的信标分子为4-硝基苯硫醇的终浓度为6μm。
本发明所述的基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法中所述的链霉亲和素修饰的磁纳米复合粒子和生物素修饰的金纳米粒子的孵育时间为1h。
有益效果：本发明首先合成了以磁颗粒为核心金壳包裹的金磁复合纳米粒子，使得纳米粒子具有良好的生物相容性、稳定性和易于修饰性的同时具有磁分离特性。利用生物素和链霉亲和素的相互作用，将链霉亲和素和生物素分别修饰在金磁纳米粒子和金纳米粒子的表面，并在金纳米粒子表面修饰信标分子，不存在目标分子的条件下，利用生物素和链霉亲和素的亲和结合，金纳米粒子修饰在金磁颗粒的表面形成卫星状结构，通过磁分离作用，金磁颗粒以及金磁颗粒-金纳米粒子组装体与金纳米粒子上清进行分离，上清中拉曼信号强度变小，沉淀中拉曼信号呈现出显著的增强。随着目标分子的添加，组装体的量变少，游离的金纳米粒子增多，从而使得沉淀中的拉曼信号强度变小，上清中拉曼信号强度增大，根据生物素或链霉亲和素和拉曼信号强度变化的关系，可以实现生物素或链霉亲和素在同一体系中的单独检测。
附图说明
图1卫星状纳米结构组装体的tem图。
图2生物素检测的标准曲线。
图3链霉亲和素检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种基于磁性纳米组装体双重检测小分子和蛋白质的方法，包括如下步骤：
（1）磁纳米粒子的合成
在50ml的乙二醇中加入无水乙酸钠和fecl3·6h2o，使得其终浓度分别为10mm和2mm，将其进行超声分散5min，然后转入反应釜中，200℃的条件下反应8h，反应结束后将反应釜取出使之自然冷却至室温，用超纯水和乙二醇交替洗涤5次，洗涤最后一次的沉淀物用50ml的甲苯分散，倒入圆底烧瓶中，加入1ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌下80℃回流反应6h，将其冷却至室温，再用超纯水和乙二醇交替洗涤5次，最后将磁纳米粒子沉淀物进行真空干燥得到固态的粒径为10nm的磁纳米粒子。
（2）磁核金壳复合纳米粒子的合成
称取新合成的磁纳米粒子粉末10mg，加入100ml超纯水超声分散10min，然后在搅拌的状态下加入5ml质量浓度为0.4%的氯金酸，搅拌均匀后在超声的状态下加入3ml质量浓度为1%的柠檬酸钠溶液，继续超声直到溶液颜色由浅黄色逐渐变成黑色反应终止，在外加磁场的作用下进行磁分离，去除上清，并用超纯水将沉淀物利用磁分离清洗3次，从而得到金壳包裹的磁性复合物，金壳的厚度为5nm。
（3）金纳米粒子的合成
金纳米粒子通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法合成，合成步骤为：将95ml超纯水加入干净的锥形瓶中，再加入2.5ml质量浓度为0.4%的氯金酸溶液，置于加热磁力搅拌器上加热至沸腾，沸腾10min后，迅速加入2.5ml质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，待溶液由无色变为酒红色后持续加热5min，停止加热后继续搅拌至溶液冷却至室温，通过紫外吸收光谱扫描得到的金纳米粒子的最大吸收峰在521nm，通过透射电子显微镜观察到金纳米粒子的粒径为10nm。
（4）纳米粒子修饰信标分子
将步骤（3）合成的金纳米粒子在8000r/min的条件下离心5min，去除上清用ph7.2的0.01mpbs缓冲液将金纳米粒子进行重悬，向金纳米粒子中加入信标分子4-硝基苯硫醇，使得其终浓度为6μm，在室温下孵育4h，再在8000r/min的条件下离心5min去除上清，用pbs缓冲液将其重悬。
（5）金磁复合纳米粒子修饰链霉亲和素
取5ml步骤（2）合成的金磁复合纳米粒子在外加磁场的作用下吸附，去除上清用ph7.2的0.01mpbs缓冲液将纳米粒子进行重悬，并用0.1mk2co3溶液将ph调整到8.6，然后加入500μl浓度为1mg/ml的链霉亲和素，在缓慢振荡的条件下反应30min，然后加入500μlbsa溶液使得bsa的终浓度为1%，再在振荡的条件下反应40min，通过外加磁场去除上清，并用ph7.2的0.01mpbs缓冲液将纳米粒子进行重悬，得到金磁复合纳米粒子修饰的链霉亲和素。
（6）金纳米粒子修饰生物素
取2ml步骤（4）制备的金纳米粒子，测得其终浓度为20nm，向其中加入生物素修饰的dna分子，使得dna的终浓度为40nm，将其在室温下孵育6h后，在8000r/min的条件下离心5min，得到金纳米粒子修饰的生物素。
生物素修饰的dna：5’-sh-aaaaa-biotin-3’。
（7）磁性纳米组装体的制备以及小分子蛋白质的双重检测
将40μl步骤（4）制备的纳米粒子和50μl步骤（5）制备的纳米粒子混合，分别加入10μl浓度为0nm、0.1nm、0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm、50nm的生物素，另一组检测体系分别加入浓度为0nm、0.5nm、1nm、5nm、10nm、20nm、50nm、100nm的链霉亲和素，在室温条件下孵育1h，随后外加磁场去除上清，吸附的磁纳米复合粒子用50μl超纯水进行重悬，分别测定上清和磁纳米复合粒子在1334cm-1处的表面增强拉曼光谱强度。根据检测物的浓度和sers信号强度之间的关系建立标注曲线得知，在0.1~10nm的生物素浓度范围内线性关系良好，生物素的检测限为0.043nm，在0.5~50nm的链霉亲和素浓度范围内线性关系良好，链霉亲和素的检测限为0.028nm。
（8）实际样本的检测
为了验证本方法在临床样本检测的可行性，将不同浓度的生物素和链霉亲和素分别添加到血清样本中，生物素的添加浓度为：0.2nm、0.8nm、1.5nm、3.6nm、5.2nm，链霉亲和素的添加浓度为：1.5nm、3.5nm、5.8nm、8.3nm、10.6nm，用此方法测得生物素的添加回收率为95.4~98.1%，链霉亲和素的添加回收率为96.2~99.3%，添加回收结果在可接受的范围内。