一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法与流程

本发明涉及显微观察样品技术领域，尤其是涉及一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法。

背景技术：

鲤鱼是淡水鱼中分布最广、产量最多的鱼类之一，由于鲤鱼脂肪含量低、蛋白质含量丰富，成为人们最喜欢的淡水鱼类之一。鲤鱼肌肉中最小的结构单位为肌纤维，每一条肌纤维就是一个细胞。相较比其他动物，鱼肉的肌纤维更短更细、蛋白质组织松散、水分含量高、肌纤维，密度更大，这些结构上的特征致使鱼肉比其他动物的肌肉更柔软，因此经常被作为动物性蛋白资源制作食品原料。但是基于上述特征，鲤鱼肉也更易被降解，在低温冷藏过程中使得鲤鱼肌肉软化，进而则会在短时间内导致肌肉的品质下降。因此，研究不用类型肌肉的软化情况，对日常保存鲤鱼肉和选育优良品种的鲤鱼有着重要的意思。

鲤鱼肌肉由红色肉、粉色肉和白色肉组成，肉眼往往不能很好的区分，在分别分析这三种肌肉类型理化性质时，导致在采肉时不能完全把这些分开，进而导致不能正确的进行后续实验，最终不能正确的分析研究这三种肌肉类型的理化性质。光学显微镜(opticalmicroscope，简写om)是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，能看到的许多微小生物和构成生物的基本单元-细胞。因此，可以利用光学显微镜分辨鲤鱼三种肌肉细胞。而为了对细肌肉胞进行观察，通常要先对肌肉细胞进行染色，令细胞膜、细胞质和细胞核可以容易的在显微镜下观察，肌肉细胞常用的染色方法有：he染色和肌球蛋白atp酶染色等。但是he染色样品制备过程中在染色时间、取材组织块体积大小、气温等诸多方面对制作者的要求比较苛刻，且制备时间长。而由于肌球蛋白三磷酸腺苷酶（atp）存在于肌肉中，因此可以利用atp酶染色分辨鲤鱼三种肌肉细胞的纤维类型和分布。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能保持肌肉细胞形态的完整性，能够清晰地辨别红色肉细胞、粉色肉细胞和白色肉细胞，保证分别采取三种类型肌肉的准确率，方便简单的辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法，包括冻结、冻结、前处理、atpase反应、发色、光学显微镜观察，具体步骤为：

冻结：将从鲤鱼背部取的样品块用浓度为2-3%的冷冻保护剂清洗9-12min，放在样品台上，滴加冰冻切片包埋剂，再将样品与样品台放入装有异戊烷的容器中，并将容器放入液氮中急速冷冻至冻结点即可，上述冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.6-0.8，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:83-92，冷冻干燥过程中，左旋糖苷和右旋糖苷的合理比例能增加溶液的粘度，使得糖苷在肌肉细胞的蛋白质分子之间产生位阻，同时提高样品的玻璃化转变温度，能更好地抑制冰晶的形成，控制冷冻过程中的ph值的变化，保证冻结时肌肉细胞的稳定性，该保护剂的加入不仅增大了水分子的表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用，使得蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子，保护肌肉细胞的天然构象，而且保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了肌肉细胞的天然结构和功能的完整性，该步骤中冰冻切片包埋剂能立即在样品表面迅速涂开，其冰冻速度和软硬韧度与组织细胞相近，具有支持填充、减少皱褶和断裂等作用，并可经由水冲洗完全去除，对光学显微镜下肌肉细胞无干扰，该冻结可以使肌肉表面和内部同时降温，使得样品内结晶较少，最大限度地保持肌肉细胞形态的完整性；

切片：将达到冻结点后的样品放入-20至-30℃的低温恒温器中保持50-70min，然后样品台固定至冷冻切片机上切出厚度为9-11µm的切片，收集切好的样品至载玻片上，室温下干燥即得样品切片，该步骤切片前先将样品进行修整，修整时每次切出20-30µm厚，样品修整后，调节切片机进行切片，采用恒冷冰冻切片科避免造成肌肉失水、肌纤维面积减少和酶活性丧失，减少肌肉组织破坏，最大限度地保持肌肉细胞形态的完整性；

前处理：将前处理容器中装入含有0.09-0.11m抑胰肽酶缓冲液和17-19mmcacl2的前处理溶液，前处理溶液的ph为10.40-10.60，并将前处理容器放入18-22℃恒温槽中至温度恒定，然后将样品切片放入前处理容器中处理20-30min，倒出前处理溶液，再用清洗液清洗2-3次，每次清洗13-16min，即可得前处理切片，该步骤中抑胰肽酶和cacl2相互协同发挥作用，不仅能抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶，阻止肌肉中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活，而且能抑制红色肉肌肉细胞中的atp酶活性，使得红色肉肌肉细胞不显色，而粉色肉肌肉细胞显示深色，白色肉肌肉细胞不失活，保持原本颜色；

atpase反应：将前处理切片中加入清洗液，然后放入18-22℃恒温槽中至温度恒定，再将清洗液完全倒出，立刻加入18-22℃的反应液反应25-35min，反应结束后将反应液倒出，立即加入蒸馏水清洗3-4次，再加入蒸馏水浸渍1-2min，重复浸渍6-8次，即得atpase反应切片，该步骤中的atpase反应即是肌肉细胞中肌球蛋白atp酶使肌肉细胞中的atp水解为adp，并释放出磷酸基，磷酸基游离在酶活性位置处，为发色步骤做准备；

发色：将atpase反应切片用浓度为0.8-1.1%的cacl2溶液浸泡3-4min，倒出cacl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗3-4次，再加入蒸馏水浸渍1-2min，重复浸渍6-8次，然后再加入浓度为1.8-2.1%的cocl2溶液浸泡3-4min，倒出cocl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗3-4次，再加入蒸馏水浸渍1-2min，重复浸渍6-8次，最后用浓度为0.8-1.1%的硫化铵溶液浸泡50-70s，倒出硫化铵溶液后，立即加入蒸馏水清洗3-4次，再加入蒸馏水浸渍1-2min，重复浸渍6-8次，即得发色切片，该步骤中用cacl2溶液浸泡可使游离出的磷酸基生成不溶性的磷酸盐，固定在样品组织表面，然后cocl2溶液浸泡可将磷酸钙置换成磷酸钴，最后硫化铵将磷酸钴置换成能发色的黑色硫化钴，硫化钴存在于酶活性位置处，便于在光学显微镜下观察；

光学显微镜观察：取出发色切片，吸取多余水分，盖上盖玻片，甘油封片后，利用光学显微镜进行观察，即可辨别鲤鱼三种肌肉细胞，得到的显微镜图像中红色肉细胞、粉色肉细胞和白色肉细胞分界线明显，能够清晰地辨别鲤鱼三种肌肉细胞的分布，为保证分别采取三种类型肌肉的准确率提供可能。

作为优选，清洗液的组成为：17-19mmcacl2、48-52mmkcl和0.09-0.11m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，清洗液的ph为9.35-9.45。

作为优选，反应液的组成为：17-19mmcacl2、48-52mmkcl、3.0-3.2mmatp和0.09-0.11m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，反应液的ph为9.35-9.45。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明辨别方法得到的显微镜图像中红色肉细胞、粉色肉细胞和白色肉细胞分界线明显，能够清晰地辨别鲤鱼三种肌肉细胞的分布，为保证分别采取三种类型肌肉的准确率提供可能；该方法可以使肌肉表面和内部同时降温，使得样品内结晶较少，最大限度地保持肌肉细胞形态的完整性；该方法使得红色肉肌肉细胞不显色，而粉色肉肌肉细胞显示深色，白色肉肌肉细胞不失活，保持原本颜色，便于在光学显微镜下观察，且最终产物仍存在于酶活性位置处。

附图说明

图1为本发明实施例3中红色肉肌肉细胞和粉色肉肌肉细胞的光学显微镜图；

图2为本发明实施例3中粉色肉肌肉细胞和白色肉肌肉细胞的光学显微镜图；

图3为本发明实施例3中白色肉肌肉细胞的光学显微镜图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法，包括冻结、冻结、前处理、atpase反应、发色、光学显微镜观察，具体步骤为：

1）冻结：将从鲤鱼背部取的样品块用浓度为2.1%的冷冻保护剂清洗12min，放在样品台上，滴加冰冻切片包埋剂，再将样品与样品台放入装有异戊烷的容器中，并将容器放入液氮中急速冷冻至冻结点即可，上述冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.62，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:90，冷冻干燥过程中，左旋糖苷和右旋糖苷的合理比例能增加溶液的粘度，使得糖苷在肌肉细胞的蛋白质分子之间产生位阻，同时提高样品的玻璃化转变温度，能更好地抑制冰晶的形成，控制冷冻过程中的ph值的变化，保证冻结时肌肉细胞的稳定性，该保护剂的加入不仅增大了水分子的表面张力，促使了蛋白质分子优先与水分子相互作用，使得蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的水分子和相对较少的保护剂分子，保护肌肉细胞的天然构象，而且保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，从而保持了肌肉细胞的天然结构和功能的完整性，该步骤中冰冻切片包埋剂能立即在样品表面迅速涂开，其冰冻速度和软硬韧度与组织细胞相近，具有支持填充、减少皱褶和断裂等作用，并可经由水冲洗完全去除，对光学显微镜下肌肉细胞无干扰，该冻结可以使肌肉表面和内部同时降温，使得样品内结晶较少，最大限度地保持肌肉细胞形态的完整性；

2）切片：将达到冻结点后的样品放入-22℃的低温恒温器中保持65min，然后样品台固定至冷冻切片机上切出厚度为9µm的切片，收集切好的样品至载玻片上，室温下干燥即得样品切片，该步骤切片前先将样品进行修整，修整时每次切出20-30µm厚，样品修整后，调节切片机进行切片，采用恒冷冰冻切片科避免造成肌肉失水、肌纤维面积减少和酶活性丧失，减少肌肉组织破坏，最大限度地保持肌肉细胞形态的完整性；

3）前处理：将前处理容器中装入含有0.11m抑胰肽酶缓冲液和17mmcacl2的前处理溶液，前处理溶液的ph为10.40，并将前处理容器放入22℃恒温槽中至温度恒定，然后将样品切片放入前处理容器中处理22min，倒出前处理溶液，再用清洗液清洗3次，每次清洗13min，即可得前处理切片，该步骤中抑胰肽酶和cacl2相互协同发挥作用，不仅能抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶，阻止肌肉中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活，而且能抑制红色肉肌肉细胞中的atp酶活性，使得红色肉肌肉细胞不显色，而粉色肉肌肉细胞显示深色，白色肉肌肉细胞不失活，保持原本颜色；

4）atpase反应：将前处理切片中加入清洗液，然后放入22℃恒温槽中至温度恒定，再将清洗液完全倒出，立刻加入22℃的反应液反应35min，反应结束后将反应液倒出，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍2min，重复浸渍6次，即得atpase反应切片，该步骤中的atpase反应即是肌肉细胞中肌球蛋白atp酶使肌肉细胞中的atp水解为adp，并释放出磷酸基，磷酸基游离在酶活性位置处，为发色步骤做准备；

5）发色：将atpase反应切片用浓度为1.1%的cacl2溶液浸泡3min，倒出cacl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍2min，重复浸渍6次，然后再加入浓度为2.1%的cocl2溶液浸泡3min，倒出cocl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍2min，重复浸渍6次，最后用浓度为1.1%的硫化铵溶液浸泡50s，倒出硫化铵溶液后，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍2min，重复浸渍6次，即得发色切片，该步骤中用cacl2溶液浸泡可使游离出的磷酸基生成不溶性的磷酸盐，固定在样品组织表面，然后cocl2溶液浸泡可将磷酸钙置换成磷酸钴，最后硫化铵将磷酸钴置换成能发色的黑色硫化钴，硫化钴存在于酶活性位置处，便于在光学显微镜下观察；

6）光学显微镜观察：取出发色切片，吸取多余水分，盖上盖玻片，甘油封片后，利用光学显微镜进行观察，即可辨别鲤鱼三种肌肉细胞，得到的显微镜图像中红色肉细胞、粉色肉细胞和白色肉细胞分界线明显，能够清晰地辨别鲤鱼三种肌肉细胞的分布，为保证分别采取三种类型肌肉的准确率提供可能。

上述清洗液的组成为：17mmcacl2、52mmkcl和0.09m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，清洗液的ph为9.35。

上述反应液的组成为：17mmcacl2、52mmkcl、3.0mmatp和0.09m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，反应液的ph为9.35。

实施例2：

一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法，具体步骤为：

1）冻结：将从鲤鱼背部取的样品块用浓度为3%的冷冻保护剂清洗9min，放在样品台上，滴加冰冻切片包埋剂，再将样品与样品台放入装有异戊烷的容器中，并将容器放入液氮中急速冷冻至冻结点即可，上述冷冻保护剂为海藻糖和糖苷，其重量比为1:0.8，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:84；

2）切片：将达到冻结点后的样品放入-28℃的低温恒温器中保持55min，然后样品台固定至冷冻切片机上切出厚度为11µm的切片，收集切好的样品至载玻片上，室温下干燥即得样品切片；

3）前处理：将前处理容器中装入含有0.09m抑胰肽酶缓冲液和19mmcacl2的前处理溶液，前处理溶液的ph为10.50，并将前处理容器放入18℃恒温槽中至温度恒定，然后将样品切片放入前处理容器中处理30min，倒出前处理溶液，再用清洗液清洗2次，每次清洗16min，即可得前处理切片，上述清洗液的组成为：19mmcacl2、48mmkcl和0.11m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，清洗液的ph为9.45；

4）atpase反应：将前处理切片中加入清洗液，然后放入18℃恒温槽中至温度恒定，再将清洗液完全倒出，立刻加入18℃的反应液反应35min，反应结束后将反应液倒出，立即加入蒸馏水清洗4次，再加入蒸馏水浸渍1min，重复浸渍8次，即得atpase反应切片，上述反应液的组成为：19mmcacl2、48mmkcl、3.2mmatp和0.11m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，反应液的ph为9.45；

5）发色：将atpase反应切片用浓度为0.85%的cacl2溶液浸泡4min，倒出cacl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗4次，再加入蒸馏水浸渍1min，重复浸渍8次，然后再加入浓度为1.9%的cocl2溶液浸泡4min，倒出cocl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗4次，再加入蒸馏水浸渍1min，重复浸渍8次，最后用浓度为0.9%的硫化铵溶液浸泡70s，倒出硫化铵溶液后，立即加入蒸馏水清洗4次，再加入蒸馏水浸渍1min，重复浸渍8次，即得发色切片；

6）光学显微镜观察：取出发色切片，吸取多余水分，盖上盖玻片，甘油封片后，利用光学显微镜进行观察，即可辨别鲤鱼三种肌肉细胞，得到的显微镜图像中红色肉细胞、粉色肉细胞和白色肉细胞分界线明显，能够清晰地辨别鲤鱼三种肌肉细胞的分布，为保证分别采取三种类型肌肉的准确率提供可能。

实施例3：

一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法，具体步骤为：

1）从鲤鱼背部胸鳍附近切下1×1×1cm样品块，用浓度为2.5%的冷冻保护剂清洗10min，放在样品台上，滴加冰冻切片包埋剂，再将样品与样品台放入装有异戊烷的容器中，并将容器放入液氮中急速冷冻至冻结点即可，上述冷冻保护剂为重量比为1:0.7的海藻糖和糖苷混合物，糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比为1:88；

2）将达到冻结点后的样品放入-25℃的低温恒温器中保持60min，然后样品台固定至冷冻切片机上切出厚度为10µm的切片，收集切好的样品至载玻片上，室温下干燥即得样品切片；

3）将前处理容器中装入含有0.1m抑胰肽酶缓冲液和18mmcacl2的前处理溶液，前处理溶液的ph为10.60，并将前处理容器放入20℃恒温槽中至温度恒定，然后将样品切片放入前处理容器中处理20min，倒出前处理溶液，再用清洗液清洗3次，每次清洗15min，即可得前处理切片，上述清洗液的组成为：18mmcacl2、50mmkcl和0.1m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，清洗液的ph为9.40；

4）将前处理切片中加入清洗液，然后放入20℃恒温槽中至温度恒定，再将清洗液完全倒出，立刻加入20℃的反应液反应20min，反应结束后将反应液倒出，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍1-2min，重复浸渍6-8次，即得atpase反应切片，上述反应液的组成为：18mmcacl2、50mmkcl、3.1mmatp和0.1m2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液，反应液的ph为9.40；

5）将atpase反应切片用浓度为1%的cacl2溶液浸泡3min，倒出cacl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍1.5min，重复浸渍7次，然后再加入浓度为2%的cocl2溶液浸泡3min，倒出cocl2溶液后，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍1.5min，重复浸渍7次，最后用浓度为1%的硫化铵溶液浸泡1min，倒出硫化铵溶液后，立即加入蒸馏水清洗3次，再加入蒸馏水浸渍1.5min，重复浸渍7次，即得发色切片；

5）取出发色切片，吸取多余水分，盖上盖玻片，甘油封入后，利用光学显微镜进行观察，即可辨别鲤鱼三种肌肉细胞。

本实施例鲤鱼三种肌肉细胞的光学显微镜图如图1、图2和图3所示，图1为红色肉肌肉细胞和粉色肉肌肉细胞的光学显微镜图；图2为粉色肉肌肉细胞和白色肉肌肉细胞的光学显微镜图；图3为白色肉肌肉细胞的光学显微镜图，图中r为红色肉肌肉细胞、p为粉色肉肌肉细胞、w为红色肉肌肉细胞。从图中可以很清晰地分辨鲤鱼三种肌肉细胞，得到的显微镜图像中红色肉细胞显示为白色，粉色肉细胞显示颜色较深，而白色肉细胞保持原有的颜色；图中红色肉细胞和粉色肉细胞分界线明显，粉色肉细胞呈马赛克状排列；图中能够清晰地辨别鲤鱼三种肌肉细胞的分布，为保证分别采取三种类型肌肉的准确率提供可能，说明本发明一种辨别鲤鱼三种肌肉细胞的组织学方法的效果较好。

本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。