本发明涉及乙醇检测方法，特别涉及一种40到50度酒的乙醇含量即酒精度的简便快速测定方法。
背景技术：
：乙醇是酒的主要成分，其含量是酒品质的重要指标之一，国标中称之为酒精度，通常它是指在20℃下，每100ml酒液中含有的乙醇毫升数。酒精度是酒类产品的必测指标，目前测定方法有很多，常见的包括酒精度计法、密度瓶法、气相色谱法和近红外光谱法等。气相色谱法和近红外光谱法这两种是基于现代分析技术的方法，具有检测灵敏度高、结果精确、可以高通量测定等优点，但是也存在设备昂贵、操作复杂和检测成本高等不足，因此不适合酒厂检测实际。酒厂中最常用的是酒精度计法和密度瓶法，然而这两种方法检测前均需对饮料酒预先蒸馏，除去杂质后，再对酒精水溶液进行测定。整个检测过程耗时长、步骤多、稳定性差，不能满足快速检测发展的需求。综上可知，目前亟需建立准确可靠、简便快速且经济实用的酒精度测定方法，针对40到50度酒本发明提供了基于特定超短dna片段（即寡聚脱氧核苷酸链）在不同酒精度酒样中变性程度不同导致260nm波长下吸光度有所差异，而建立了一种新的酒精度测定方法即满足此需求。dna双链是靠碱基之间的氢键和堆积力维持的，然而在一些外在因素如高温、极端ph、有机试剂如尿素、甲酰胺、甲醇和乙醇存在时，这些维持力会遭到破坏，从而使得dna双链解链变成单链，导致其在260nm下的吸光度大幅增加（又称增色效应）。利用这一特性，构建合适的dna体系，将酒样加入其中处理，利用该dna体系吸光度同酒样中酒精度之间的关联，从而实现酒精度的测定。技术实现要素：本发明的目的在于提供40到50度酒酒精度的简便快速测定方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案为，40到50度酒酒精度简便快速测定方法的主要步骤如下：（1）移取400ul室温待测40到50度酒酒样到空的酶标板中，加入50ul初始变性剂和50ul短双链dna片段混合体系并充分混匀后静置5min，同时设置对照孔为400ul待测酒样加50ul初始变性剂加50ul蒸馏水，待测酒样和对照均取平行测三次，样本处理好后将酶标板置于酶标仪中。（2）设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度减去对照的平均吸光度即为样品中短双链dna片段混合体系的实际吸光度。将样品中dna体系的实际吸光度x代入关系式y=9.1096x+38.38（40≤y≤50）中换算出酒样的酒精度y。其中，步骤（1）中所述的40到50度酒是指酒精度大于等于1且小于等于20的酒水类产品；所述酒样温度为正常室温即可，优选地，控制在30.0±5.0℃之间；所述的初始变性剂是10%质量体积分数的尿素和12%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液，即每100ml混合水溶液中含有10g尿素和12ml甲酰胺；所述的短双链dna片段混合体系包括了2条短双链dna片段1和2，其序列分别如seqidno：1-2所示，各条短双链dna片段浓度均为10μmol/l。本发明筛选到合适的短双链dna片段混合体系，并揭示了其在40到50度酒中吸光度和酒精度之间的关系，在此基础上构建了40到50度酒酒精度的简便快速测定方法。本发明的酒精度测定方法适用于40到50度酒的测定，具有良好的准确性和可靠性，无需蒸馏比较安全，操作简便迅速，所需酒样量很少，且价格低廉，适合于酒厂40到50度酒酒精度测定实践。附图说明图1是本发明40到50度酒酒精度测定新方法的吸光度-酒精度标准曲线。横坐标是加短双链dna片段混合体系和初始变性剂处理的人工酒样在260nm下的吸光度，纵坐标是其酒精度。图中的y=9.1096x+38.38是spss23.0软件拟合的吸光度x和酒精度y的关系式，r2=0.9992表示的是拟合曲线的决定系数。具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明在待测酒样和dna体系中还加入经优化的特定浓度的尿素和甲酰胺混合液，主要是为了使dna片段处于一个易于变性的环境中，从而使得乙醇测定方法具有更高的灵敏度。本发明提供的短双链dna体系包含了2条dna片段，按seqidno：1-2递增的顺序其熔解温度是上升的，因此随着酒精度的增高，体系内变性双链的种类和数量也随之增加，因此吸光度和酒精度之间是正相关的。此外，dna的变性是在一个窄的范围内实现的，因此需要进行筛选和条件优化，使得dna体系中不同熔解温度的dna片段在指定的条件下边界是有所叠加延续的。在乙醇这一温和变性剂的窄变动范围（10ml以内）和dna超短片段（不足30bp），经研究发现乙醇变性剂浓度和特定dna体系的熔解反应程度在一定范围内可以实现线性拟合。由于酒中乙醇和水占主体，固形物含量很低因此其对体系在260nm的吸光度影响很小。此外，设置了只加初始变性剂的酒样做为对照，可尽可能消除背景对吸光度的影响。在本发明体系和条件下，40度以下的酒精度尚不足以使任何短双链dna片段发生局部变性，而50度以上的酒精度已经足以使所有短双链dna片段完全变性，因此本发明提供的酒精度标准曲线只适用于40到50度酒的酒精度测定。在酒水产品质量检测中，分光光度法是常用的手段，可以测定包括色度、甲醇和特定氨基酸等，因此分光光度计是常规设备。实施例1实施例1是本发明40到50度酒酒精度简便快速测定方法中酒精度测定标准曲线的制作。（1）人工40到50度酒样配制用相应的移液管分别取40.0、42.0、44.0、46.0、48.0和50.0ml无水乙醇于100ml容量瓶中，不断加入蒸馏水反复轻微震荡和静置，最终定容到100ml，室温静置10min，即得到了不同酒精度的人工40到50度酒样。（2）人工40到50度酒样前处理用移液枪移取400ul待测40到50度人工酒样（30.0℃）到空的普通酶标板中，先加入10%质量体积分数的尿素和12%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液50ul作为初始变性剂，再加入如seqidno：1-2所示的短双链dna片段混合体系（每条片段的浓度均为10μmol/l）50ul，则总体系为500ul，充分混匀后静置5min。需要说明的是10%质量体积分数的尿素和12%体积体积分数的甲酰胺是指100ml蒸馏水中溶解有10g的尿素和12ml的甲酰胺，短双链dna片段是由上海生工生物工程有限公司合成的互补单链等量混合而成。同时设置对照孔为400ul人工40到50度酒样加50ul初始变性剂加50ul蒸馏水，即对照为用蒸馏水取代短双链dna片段混合体系，各人工40到50度酒样和相应的对照均取平行三次，样本制备好后将酶标板置于酶标仪（美国thermo公司的multiskango）中。（3）拟合酒精度测定方法标准曲线设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度（三个平行取平均）减去对照的平均吸光度（三个平行取平均）即为样品中dna体系的实际吸光度，如表1所示。对吸光度和对应的酒精度的散点进行观察，发现40.0、42.0、44.0、46.0、48.0和50.0这6个酒精度对应的点呈现线性趋势，进行拟合得到酒精度y和吸光度x之间的关系式为y=9.1096x+38.38（40≤y≤50），而r2=0.9992非常接近1表明线性关系显著，则此即酒精度测定方法标准曲线。表1酒精度标准曲线数据平均吸光度x酒精度y0.17940.00.38442.00.62944.00.85046.01.04348.01.27550.0实施例2实施例2是利用本发明新方法对某种10到20度酒酒精度的实际测定。（1）待测酒样前处理选择梅赛宝（山东沃族蓬莱葡萄酒庄有限公司）这一市售威士忌酒，取两瓶（梅赛宝1和梅赛宝2）进行酒精度测定。用移液枪移取400ul该酒样（30.0℃）到空的普通酶标板中，先加入10%质量体积分数的尿素和12%体积体积分数的甲酰胺混合水溶液50ul作为初始变性剂，再加入如seqidno：1-2所示的短双链dna片段混合体系（每条片段的浓度均为10μmol/l）50ul，则总体系为500ul，充分混匀后静置5min。同时设置对照孔为400ul待测酒样加50ul初始变性剂加50ul蒸馏水体系（总体积也为500ul），各待测酒样和相应的对照均取平行三次，样本制备好后将酶标板置于酶标仪（美国thermo公司的multiskango）中。（2）待测酒样酒精度测定设定好酶标仪程序在260nm波长下测定样品孔和对照孔中的吸光度，则样品的平均吸光度（三个平行取平均）减去对照的平均吸光度（三个平行取平均）即为样品中dna体系的实际吸光度，如表2所示。代入酒精度y和吸光度x之间的关系式为y=9.1096x+38.38（40≤y≤50），算出酒精度结果（表2）。此外，同时采用密度瓶法测定该酒样的酒精度，结果如表2所示。表2本发明方法与密度瓶法测定的酒精度数值威士忌酒吸光度平均值本发明方法测的酒精度密度瓶法测的酒精度偏差%梅赛宝10.28340.9641.070.28梅赛宝20.27940.9241.130.51表2中，偏差是指以密度瓶法测得的酒精度为基准，本发明方法测得的酒精度与其差值占酒精度计法结果的百分比。由表2可知，采用本发明方法测定的两瓶威士忌酒酒精度与密度瓶法测定结果偏差分别为0.28%和0.51%，均在1%以内符合国标规定的酒精度测定的精确度。实施例3实施例3是利用本发明新方法对市售牛栏山二锅头（北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂产）这一40到50度酒的酒精度的测定，一共取两瓶（牛栏山1和牛栏山2）。参照实施例2操作，结果见表3。此外，同时采用密度瓶法进行此酒酒精度测定。表3本发明方法与密度瓶法测定的酒精度数值二锅头吸光度平均值本发明方法测的酒精度密度瓶法测的酒精度偏差%牛栏山10.83746.0045.890.24牛栏山20.85146.1345.970.35由表3可知，采用本发明方法测定的两瓶牛栏山二锅头酒精度与密度瓶法测定结果偏差分别为0.24%和0.35%，均在1%以内符合国标规定的酒精度测定的精确度。实施例4实施例4是利用本发明新方法对市售景芝老黄皮白乾（山东景芝酒业股份有限公司产）这一40到50度酒的酒精度的测定，一共取两瓶（白乾1和白乾2）。参照实施例2操作，结果见表4。此外，同时采用密度瓶法进行此酒酒精度测定。表4本发明方法与密度瓶法测定的酒精度数值白乾吸光度平均值本发明方法测的酒精度密度瓶法测的酒精度偏差%白乾11.16248.9749.120.31白乾21.15048.8648.980.24由表4可知，采用本发明方法测定的两瓶白乾酒精度与密度瓶法测定结果偏差分别为0.31%和0.24%，均在1%以内符合国标规定的酒精度测定的精确度。综上可知，本发明的酒精度测定方法适用于40到50度酒的测定，具有良好的准确性和可靠性；与酒精度计法或密度瓶法相比，无需蒸馏比较安全，操作10min且简便迅速；另外所需酒样量很少，且检测成本不足1元/样十分低廉，适合于酒厂此类酒酒精度测定实践。序列表<110>黄种山<120>40到50度酒酒精度简便快速测定方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atatatatatactgactg18<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atatatatatactgactga19当前第1页12