一种凋亡细胞的染色方法与流程

本发明属于细胞标识领域，具体涉及一种凋亡细胞的染色方法。

背景技术：

凋亡是活体内单个或小团细胞的死亡，死亡细胞的质膜不破裂，不引发死亡细胞的自溶，也不引起急性炎性反应。凋亡的发生于基因调节有关，也有人称之为程序性细胞死亡。细胞凋亡是机体的一种基本生理机制，并贯穿于机体的整个生命活动过程，包括胚胎的发育、新旧细胞的交替、某些组织的正常退化与萎缩、或肿瘤细胞的自发抑制等。

目前，常规的凋亡细胞原位标识技术除了利用电镜观察之外，主要为染色法。

一般的染色法主要为he染色法、mtt染色法、giemsa染色法和tunel原位杂交染色法。其中，he染色法的缺点是凋亡细胞与正常细胞胞核及胞浆着色均非常接近，只能通过胞体或胞核形态进行仔细的识别，在识别直观性上有较大缺陷。mtt染色法虽然也是一种效果较好的方法，如冯春琼等所报道的《细胞凋亡的mtt染色法检测》，但该方法仅适用于活体凋亡细胞的染色。giemsa染色法也是近年来新提出的一种凋亡细胞染色方法，如刘海洋等报道的《giemsa染色法标记脑组织凋亡细胞的可行性验证》，但该实验并未明确标识采用的何种免疫组化方法做对比验证，其标识凋亡细胞的可靠性还有待验证。tunel原位杂交染色法是常用的凋亡细胞染色方法，不过，该法具有如下缺点：染色过程中需要对组织切片进行消化处理，对切片组织结构造成一定程度的破坏；只能标识早期凋亡细胞；试剂价格昂贵，染色过程要求高，不易成功操作，常有假阴性结果出现。

因此，本领域亟需一种操作简单、效果优异的凋亡细胞染色方法。

技术实现要素：

针对现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种凋亡细胞的染色方法，该方法包括如下步骤：

(1)将切片脱蜡至水，利用染色液l进行染色0.2～5分钟；

(2)利用乙酸水溶液溶液清洗后，利用磷钼酸水溶液处理3～8分钟，然后再用乙酸水溶液进行清洗；

(3)利用染色液ⅱ染色10～30分钟，之后用乙酸水溶液进行清洗；

(4)进行脱水、透明处理后，进行封片即可；

所述染色液l的配方为：

酸性复红0.1～1g、丽春红0.1～2g、橘黄g0.1～3g、0.2％醋酸300ml；

所述染色液ⅱ的配方为：

亮绿或苯胺蓝0.1～1克、0.2％醋酸100ml。

优选的，步骤(1)中，所述染色时间为5分钟；和/或，利用磷钼酸溶液处理时，处理时间为5分钟。

优选的，步骤(2)和/或步骤(3)中，所述乙酸水溶液的中乙酸的体积分数为0.2％。

优选的，步骤(2)和/或步骤(3)中，进行所述清洗时，清洗的次数为2次。

优选的，步骤(2)中，所述磷钼酸水溶液的浓度为5g/100ml。

优选的，步骤(3)中所述染色时间为30分钟。

优选的，所述染色液l的配方为：酸性复红1g、丽春红2g、橘黄g2g、0.2％醋酸300ml；和/或，所述染色液ⅱ的配方为：亮绿0.1g、0.2％醋酸100ml。

优选的，步骤(4)中，利用无水乙醇进行所述脱水处理，和/或，利用二甲苯进行所述透明处理。

优选的，步骤(4)中，利用中性树胶进行所述封片。

所述凋亡细胞包括肝凋亡细胞、肿瘤凋亡细胞。但本领域人员应当知晓，本发明的凋亡细胞并不限于肝凋亡细胞和肿瘤凋亡细胞，包含了人和动物的凋亡细胞。

本发明的有益效果：

(1)本发明操作简单，适合推广应用；

(2)本发明能标识早、中、晚不同时期的凋亡细胞，更能全面显示组织细胞凋亡情况；

(3)本发明所需试剂廉价易得，染色成本低。

附图说明

图1为利用本发明方法(实施例1)的染色结果，其中，圈定区域内肝凋亡细胞胞浆以及红细胞被染成鲜红色或桔黄色，未凋亡肝细胞被染成蓝紫色；

图2为实施例1中的对照实验的染色结果，其中，圈定区域内肝凋亡细胞胞核被染成棕黄色，未凋亡肝细胞被苏木素染成蓝色；

图3为利用本发明方法(实施例2)的染色结果，其中，圈定区域内肿瘤凋亡细胞胞浆以及红细胞被染成鲜红色或桔黄色，未凋亡肿瘤细胞被染成蓝紫色；

图4为实施例2中的对照实验的染色结果，其中，圈定区域内肿瘤凋亡细胞胞核被染成棕黄色，未凋亡肿瘤细胞被苏木素染成蓝色。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

染色对象为给小鼠刀豆蛋白后肝损伤模型连续切片，染色结果如图1所示，利用tunel原位杂交染色法作为对照实验，对照染色结果如图2所示。图中，虽然红细胞也会被标识成与凋亡细胞同样的颜色，但红细胞形态与其它组织细胞有显著的差别，对凋亡细胞的识别基本无干扰。

按照下述方法步骤进行染色：

(1)将切片至二甲苯干净脱蜡40分钟，无水乙醇处理10分钟、再用95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇、60％乙醇、50％乙醇各处理2分中，水洗后利用染色液l进行染色5分钟；

(2)利用乙酸水溶液溶液清洗后，利用磷钼酸水溶液处理8分钟，然后再用乙酸水溶液溶液进行清洗；

(3)利用染色液ⅱ染色30分钟，之后用乙酸水溶液溶液进行清洗；

(4)进行脱水、透明处理后，进行封片即可；

所述染色液l的配方为：

酸性复红1g、丽春红2g、橘黄g2g、0.2％醋酸300ml；

所述染色液ⅱ的配方为：

亮绿0.1克、0.2％醋酸100ml。

步骤(2)和步骤(3)中，所述乙酸水溶液中的乙酸的体积分数为0.2％。

步骤(2)和步骤(3)中，进行所述清洗时，清洗的次数为2次。

步骤(2)中，所述磷钼酸水溶液的浓度为5g/100ml。

步骤(4)中，利用无水乙醇进行所述脱水处理，利用二甲苯进行所述透明处理。

步骤(4)中，利用中性树胶进行所述封片。

实施例2

除了染色对象为小鼠腋下种植h22肿瘤细胞生长成的肿瘤组织连续切片之外，其余与实施例1一致，染色结果如图3所示。同样以tunel原位杂交染色法作为对照实验，对照染色结果如图4所示。

实施例3

除了染色液l的配方为：

酸性复红0.1g、丽春红0.1g、橘黄g0.1g、0.2％醋酸300ml之外，其余与实施例1一致。

染色结果与实施例1一致，可区分凋亡细胞。

实施例4

除了染色液l的配方为：

酸性复红1g、丽春红2g、橘黄g3g、0.2％醋酸300ml；

染色液ⅱ的配方为：

亮绿1克、0.2％醋酸100ml、步骤3染色10分钟之外，其余与实施例1一致。

染色结果与实施例1一致，可区分凋亡细胞。

实施例5

除了步骤(1)的染色时间为0.2分钟之外，其余与实施例2一致。

染色结果与实施例2一致，可区分凋亡细胞。

实施例6

除了步骤(1)的染色时间为5分钟，步骤(3)的染色时间为30分钟之外，其余与实施例1一致。

染色结果与实施例1一致，可区分凋亡细胞。