一种巴戟天低聚糖成分的鉴别方法与流程

本发明属于中药化学成分分析技术领域，具体涉及一种基于uplc-qtof/ms的巴戟天低聚糖成分的鉴别方法。

背景技术：

中药巴戟天为茜草科植物巴戟天morindaofficinalishow的干燥根，主产于广东、福建、广西、海南等地，是传统补肾阳的良药，为四大南药之一，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿功效。巴戟天主要含有糖类、脂类、蒽醌、有机酸等成分。目前，从巴戟天药材中分离鉴定的糖类成分有果糖、蔗糖、巴戟甲素、蔗果三糖、耐斯糖、if-果呋喃糖基耐斯糖、菊粉二糖至七糖。低聚糖因其广泛的生物活性是目前研究热点之一，但是目前对巴戟天中药效显著的低聚糖糖产品的研发相对滞后，低聚糖的鉴定主要采取提取、分离和纯化或衍生化后，再利用核磁共振谱、质谱等方法鉴别，实验耗时长，费用大；并且未见有对巴戟天低聚糖成分进行全面表征的研究报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于uplc-qtof/ms的巴戟天低聚糖成分的鉴别方法。

本发明所提供的基于uplc-qtof/ms的巴戟天低聚糖成分的鉴别方法，包括下述步骤：

1)制备样品溶液及对照品溶液：

将巴戟天的根干燥、粉碎、过筛，用甲醇水溶液超声提取，离心，收集上清液，将上清液过滤，得到样品溶液，备用；

用甲醇水溶液将对照品溶解，得到对照品溶液，备用；

2)采用uplc-qtof/ms进行检测，根据检测结果，确定巴戟天低聚糖成分。

上述方法步骤1)中，所述过筛具体可为过40目筛。

所述甲醇水溶液具体可为体积浓度30％的甲醇水溶液。

所述超声提取在室温下进行。

所述超声提取可进行多次，具体可为2次。

每次超声提取的时间可为30min。

所述离心的条件可为12000g离心10min。

所述过滤可为经0.2μm微孔滤膜过滤。

所述对照品为：1f-果呋喃糖基耐斯糖、d(+)葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖以及耐斯糖，纯度均≥98％。

上述方法步骤2)中检测的实验条件如下：

色谱条件：

色谱柱：acquityuplcbehamidec18(2.1x100mm，1.7μm)；

流动相a：80％乙腈水溶液(v/v，含0.1％氨水)，流动相b：30％乙腈水溶液(v/v，含0.1％氨水)；

洗脱梯度：0～0.5min(0→0a，即洗脱液是100％的流动相b)，0.5～2.0min(0→10％a)，2.0～2.5min(10％→13％a)，2.5～9.0min(18％→34％a)，9.0～14min(34％→50％a)，14～16min(50％→60％a)，16～18min(60％→60％a)；

柱温35℃；

流速：200μl·min^-1；

进样量：1.0μl。

质谱条件：

数据采集模式：负离子(esi-)条件下采用continuum模式，用碘化钠校正质量范围50-2500da；

毛细管电压：2.0kv；

锥孔电压40v，电离源温度110℃，脱溶剂温度450℃；

脱溶剂气流速900l/h；

低能量通道碰撞能量为6ev，高能量扫描碰撞能量为30～50ev。

巴戟天低聚糖成分的质谱信息如下：

表1巴戟天低聚糖成分的质谱信息

注：*为巴戟天低聚糖[m─2h]^2─

本发明采用uplc-qtof/ms方法，快速地对巴戟天低聚糖成分进行全面表征，通过谱图解析，确定了19种巴戟天低聚糖的结构，为巴戟天药材创新性开发利用研究提供了科学依据。

附图说明

图1为巴戟天提取物的uplc-q-tofms总离子流(tic)色谱图。

图2为利用unify软件处理的巴戟天中菊粉型低聚糖3d离子流色谱图。

图3为巴戟天菊粉型低聚糖结构简式。

图4为巴戟天样品中蔗糖、蔗果三糖和耐斯糖的质谱图及其与相应对照品质谱图。

图5为1f-果呋喃糖基耐斯糖的质谱图，其中a为高能量质谱图，b为低能量质谱图。

图6为峰8的质谱图，其中a为高能量质谱图，b为低能量质谱图。

图7为峰15的质谱图，其中a为低能量质谱图，b为高能量质谱图，c为部分放大的高能量质谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

1.材料

1.1样品

巴戟天样品(巴戟天的肉质根)采集于广东郁南，经中国中医科学院郝近大研究员鉴定为茜草科科植物morindaofficinalishow，原植物标本现保存于中国中医科学院中药资源中心。

1.2仪器

acquityuplc-i-class串联xevo-g2-sq-tof质谱联用仪，配有masslynx4.1质谱工作站(waters公司，美国)，分析天平(梅特勒-托利多，瑞士)，离心机(eppendorf公司，德国)，kq-100de超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，0.2μm注射器式滤器(pall公司，美国)。

1.3试剂

色谱级乙腈、甲醇(merck公司，德国)；氨水(色谱级，德国merck公司)；超纯水为milli-q纯水系统制备(电阻≥18.2mω，millipore公司，美国)

1.4对照品

1f-果呋喃糖基耐斯糖(批号11965-201501，购自中国食品药品检定研究院)；d(+)葡萄糖(批号w-f012-150730)，蔗糖(批号z-f038-160715)，蔗果三糖(批号z-f005-151203)，耐斯糖(n-f016-150617)，北京融城鑫德科技有限公司提供，以上对照品纯度≥98％。

2.方法

2.1样品溶液及对照品溶液制备

样品经干燥、粉碎，过40目筛，精密称取0.1g，加2.0ml30％甲醇水溶液(v/v)，室温超声提取2次，每次30min，12000g离心10min，取上清液经0.2μm微孔滤膜过滤，备用。分别精密称取适量对照品，加甲醇(30％甲醇水溶液(v/v))超声溶解，4℃避光保存，备用。

2.2实验条件

2.2.1色谱条件

色谱柱为acquityuplcbehamidec18(2.1x100mm，1.7μm)；流动相a：80％乙腈水溶液(v/v，0.1％氨水)，流动相b：30％乙腈水溶液(v/v，0.1％氨水)；洗脱梯度：0～0.5min(0→0a)，0.5～2.0min(0→10％a)，2.0～2.5min(10％→13％a)，2.5～9.0min(18％→34％a)，9.0～14min(34％→50％a)，14～16min(50％→60％a)，16～18min(60％→60％a)，柱温35℃，流速：200μl·min-1，进样量：1.0μl。

2.2.2质谱条件

数据采集模式：负离子(esi-)条件下采用continuum模式，用碘化钠校正质量范围50-2500da；毛细管电压：2.0kv；锥孔电压40v，电离源温度110℃，脱溶剂温度450℃；脱溶剂气流速900l/h；低能量通道碰撞能量为6ev，高能量扫描碰撞能量为30～50ev。

2.3数据处理

建立了巴戟天低聚糖的化合物库，导入unify1.7软件中，进行峰提取和自动匹配鉴定低聚糖，并与对照品的色谱和质谱信息进行比对，确证所匹配化合物的结构以及其相应碎片特征，同时，根据文献报道的巴戟天低聚糖相关数据，鉴定巴戟天低聚糖成分，并进行结构确认。

3.结果与分析

3.1实验条件优化

为全面表征巴戟天药材的低聚糖成分，通过比较以纯水、不同浓度甲醇及乙醇为提取溶剂时，提取物的色谱分离度、以及在高、低能量下质谱信息，对色谱条件、质谱条件进行了优化，确定了巴戟天低聚糖的检测条件，见2.1、2.2。巴戟天提取物的uplc-q-tofmse总离子流(tic)色谱图见图1，利用unify软件处理的巴戟天中菊粉型低聚糖3d离子流色谱图见图2，由图2可以直观看到[m-h]-、[2m-h]-、[m-2h]^2-等特征碎片的离子强度表征情况，并且明显看出低质量低聚糖的[2m-h]^-峰、高质量低聚糖的[m-2h]^2-峰的离子强度均较高。

3.2化合物鉴定

建立unify分析方法:建立巴戟天低聚糖数据库，并与unifi1.7软件自带的中药化学成分数据库合并，设置3d峰检测参数的强度阈值和加合离子峰的种类，负离子模式下加合离子为[m-h]-、[m+hcoo]-、[m-2h]2-。unify分析软件自动标识经处理后的可信数据，并识别同一个化合物的不同加合形态，给出鉴定化合物的分子式、质量数误差、同位素匹配偏差，保留时间、峰强度及加合离子等信息；同时，根据高能量下的碎片信息，自动匹配对应化合物结构可能的裂解方式。由于软件无法有效区分异构体类化合物，并且有时个别分子离子峰判断也可能存在误差，匹配鉴定的结果需要进行人工确认。

利用unifi分析软件进行处理后自动匹配了200多个化合物，结合对照品的色谱质谱信息，以及文献报道，巴戟天药材中的低聚糖为菊粉型低聚糖，菊粉型低聚糖一端是蔗糖，由β(1→2)糖苷键链接而成的线性直链型低聚糖，糖链增长基团为β-呋喃型果聚糖，末端常带有一个葡萄糖残基，随着聚合度的增加，增长的基团和连接方式不变，聚合度(dp)通常在2～60之间，聚合度较低(dp＝2～9)的常称果糖低聚糖。本研究发现，巴戟天低聚糖的分布具有一定的规律性，即相邻两个低聚糖之间相差一个质量数为162da(c6h10o5)的六碳糖。巴戟天菊粉型低聚糖结构简式见图3，本实验检测到19个巴戟天菊粉型低聚糖。巴戟天样品中蔗糖、蔗果三糖和耐斯糖的质谱图及其与相应对照品质谱图见图4，巴戟天菊粉型低聚糖鉴定结果见表1。

3.3dp＝3～13巴戟天低聚糖类的鉴定

以峰4为例，说明菊粉型低聚糖的质谱裂解途径：在低能量质谱图中出现准分子离子峰[m-h]-(m/z827.2668)、加合离子峰[m+hcoo]-(m/z873.2733)，以及[2m-h]-(m/z1655.5356)；在高能量质谱图中，m/z647.2035是从[m-h]-脱去失去1分子h2o和1分子c6h10o5所产生的碎片离子；m/z485.1503是[m-h]-脱去失去1分子h2o和2分子c6h10o5所产生的碎片离子，m/z323.0969是[m-h]-失去1分子h2o和3分子c6h10o5所产生的碎片离子；m/z179.0543是[m-h]-失去4分子c6h10o5所产生的碎片离子，通过与对照品1f-果呋喃糖基耐斯糖色谱质谱信息的比对，确定峰4为1f-果呋喃糖基耐斯糖，其质谱图见图5。

峰8在低能量质谱图中出现准分子离子峰[m-h]-(m/z1475.4810)、加合离子峰[m+hcoo]-(m/z1521.4850)、以及[m-2h]2-(m/z737.2354)、[m+hcoo-2h]2-(m/z760.2384)；在高能量下，m/z1295.4162是从[m-h]-脱去失去1分子h2o和1分子c6h10o5所产生的碎片离子；m/z1151.3727是[m-h]-脱去失去2分子c6h10o5所产生的碎片离子，m/z971.3068是[m-h]-失去1分子h2o和3分子c6h10o5所产生的碎片离子；m/z809.2545是[m-h]-失去1分子h2o和4分子c6h10o5所产生的碎片离子；m/z737.2354是[m-h]-失去2分子h2o所产生的碎片离子；m/z647.2023和485.1493分别是[m-h]-失去1分子h2o、5分子c6h10o5和[m-h]-失去1分子h2o和6分子c6h10o5所产生的碎片离子，m/z3411073和179是[m-h]-脱去7分子c6h10o5和8分子c6h10o5所产生的碎片离子。根据文献信息，推测峰8为菊粉型9聚糖，其质谱图见图6。

同理，峰9～14的低能量质谱图中依次出现增加了162da的碎片离子峰和[m-2h]2-峰，以及相应的加合离子峰[m+cl]-、[m+hcoo]-，高能质谱图中有[m-h-c6h10o5-h2o]-峰、[m-h-2c6h10o5]-峰等依次脱失18da、162da、180da或其整数倍的碎片离子峰和[m-2h]2-碎片离子峰，因此，根据质谱信息，并结合文献报道[1,10-13]i，推测峰9～14依次为菊粉型低聚10糖～菊粉型低聚15糖，鉴定结果见表1。

3.3dp＝14～19巴戟天低聚糖类的鉴定

用碘化钠校正质谱检测器质量轴到2500da，所以未能准确检测到质量数大于2500da的分子离子峰。但是，在低能量质谱图中可以准确检测到[m-2h]2-、[m-3h]3-、[m-2h+cl]2-碎片峰，高能质谱图中出现[m-h]-依次脱失18da、162da、180da或其整数倍的碎片离子峰。

以峰15为例，说明该菊粉型低聚糖的质谱裂解情况，在低能量质谱图中出现的[m-2h]-(m/z1304.4230)，[m-h+hcoo]2-(m/z1327.9240)的碎片峰；在高能量质谱图中，出现m/z179.0551、341.1078、503.1615、665.2161、827.2669、989.3194、1475.6339、1637.5265、1961.8220、2123.8633、2285.9060等一系列[m-h]-脱失162da或180da的碎片离子，通过unifi分析并结合中药成分数据库，并结合文献报道，推测峰15为菊粉型16糖，其质谱图见图7。同理推测峰16、17、18分别为菊粉型17、18、19糖。

4讨论

糖类在自然界中分布广泛，单糖的连接方式、连接顺序和绝对构型的不同，造就了糖类化合物的信息非常丰富。因低聚糖具有独特的结构和广泛的生物活性，因其能显著提高肠道微生物群的生长和功能；又因不易被消化吸收，被广泛应用于食品工业中，用来取代脂肪或作为低热量的甜味剂。低聚糖成分是巴戟天药材主要成分，占药材干重的30％以上。研究报道巴戟天低聚糖具有抗抑郁、促进免疫、抗应激、保护心血管作用。本研究优化了巴戟天药材低聚糖的色谱和质谱分离和检测条件，利用acquityuplcbehamidec18柱，通过uplc-qtof/ms检测系统，成功分离并鉴定了巴戟天药材中19个低聚糖成分，为巴戟天创新药物开发研究提供科学依据。