专利名称：制备α－(1,4)－连接的寡糖的方法
技术领域：
本发明的背景本发明的领域本发明涉及到制备α-(1,4)-连接的寡糖的方法，并且更具体地，涉及到在特定的条件下，通过酶与容易从天然产品得到的直链淀粉，制备由下面1式表示的寡糖的方法。 由于从本发明制备的寡糖具有α-(1,4)连接单元和适当的糖分布，它特别适合用作制备手性化合物的有用中间体光学纯(S)-3-羟基-γ-丁内酯的原料。
在下面，详细介绍了用于制备(S)-3,4-二羟基丁酸衍生物和(S)-3-羟基-γ-丁内酯的常规技术，它们被用于制备所述的手性化合物。
由β-酮酯的酶还原或催化还原制备(S)-3-羟基丁酸衍生物的方法是知道的[J.Am.Chem.Soc.,105,5925~5926(1983)；TetrahedronLett.,31,267~270(1990)；欧洲专利公开452,143A2]。这些方法具有难度，因为前手性中心应当被还原到一侧，以产生手性中心，并且需要采用贵重的金属催化剂。
通过选择性还原(L)-苹果酸酯制备(S)-3,4-二羟基丁酸酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯的技术是已知的[Chem.Lett.,1389~1392(1984)；USP 5,808,107]。该技术具有不足，因为还原应当选择性地进行到两个酯官能团中的仅仅一个。
从碳水化合物制备(S)-3,4-二羟基丁酸衍生物和(S)-3-羟基-γ-丁内酯的许多方法已被介绍了。
报道了制备异己糖酸(B)或(S)-3,4-二羟基丁酸(C)的技术[J.Chem.Soc.,1924~1931(1960)]，如
图1所示，即通过碱降解在4-位上含有葡萄糖取代基的碳水化合物，例如4-O-甲基-(D)-葡萄糖、麦芽糖、直链淀粉和纤维素，消除作为离去基团的C-4取代基，形成二羰基化合物(A；4-脱氧-2,3-hexodiulose)，并且用碱反应形成的二羰基化合物。但是，(S)-3,4-二羟基丁酸的收率低。
图1 同样，已经报道了由碱降解在4-位上含有葡萄糖取代基的碳水化合物，形成二羰基化合物(A)，分离所形成的二羰基化合物(A)，并用过氧化氢与它反应，以主要产物得到了(S)-3,4-二羟基丁酸(C)和乙醇酸(D)[J.Cem.Soc.,1932~1938(1960)]。该方法存在严重问题，这在于产物以由于互变异构化产生的少量异构体和环状化合物与从由二羰基化合物(A)衍生来的水合物的混合物存在。因此，二羰基化合物(A)不能以好的收率从反应混合物中分离出。另外的问题在于由于过度氧化，所制备的(S)-3,4-二羟基丁酸被降解为甲酸和乙醇酸。
单独采用碱或采用在碱中的氧，从碳水化合物制备(S)-3,4-二羟基丁酸的类似技术是知道的。如图1所示，建议将二羰基化合物(A)作为(S)-3,4-二羟基丁酸的合成中间体。但是，收率据报道为低到大约30％[J.Res.Natl.Bur.Stand,32,45(1944)；J.Am.Chem.Soc.,2245~2247(1953)；J.Am.Chem.Soc.,1431~1435(1955)；Carbohyd.Res.,11,17~25(1969)；J.Chromatography,549,113~125(1991)]。在这些方法中，制备了(S)-3,4-二羟基丁酸与不同类型的混合物，包括乙醇酸(D)、异己糖酸(B)、甲酸、酮、二酮和甘油酸。由于(S)-3,4-二羟基丁酸的收率很低，这些方法也被认为不适合工业应用。
采用碱和氧化剂从二糖(乳糖)制备(S)-3,4-二羟基丁酸的方法已被介绍了[国际专利公开WO98/04543]。在这项工作中，在反应条件下，(S)-3,4-二羟基丁酸被环化为(S)-3-羟基-γ-丁内酯，并且通过将两个羟基保护为丙酮酯化合物而被提纯，即(S)-3,4-O-异亚丙基-3,4-二羟基丁酸甲酯，它在酸性介质下被再环化为(S)-3-羟基-γ-丁内酯。
包括碱氧化在4-位上含有葡萄糖取代基的碳水化合物过程的(S)-3,4-二羟基丁酸的制备方法已经知道了[USP 5,292,939,5,319,110和5,374,773(1994)]。在这些方法中，首先形成了二羰基化合物(A)中间体，氧化为(S)-3,4-二羟基丁酸(C)和乙醇酸(D)。但是，完全没有介绍手性化合物最重要的物理性能，光学纯度。同样，考虑反应的机理，目标化合物的提纯很困难。在二糖例如麦芽糖或乳糖的场合，在二糖中，只有一个糖单元形式(S)-3,4-二羟基丁酸，并且另一个糖单元起离去基团的作用，因此，目标产物和离去基团以1∶1混合物共存。相应地，很难从反应混合物中分离和纯化(S)-3,4-二羟基丁酸或(S)-3-羟基-γ-丁内酯。可获得的最大的物质转化率为28.3wt％。换句话说，从100克二糖可以得到28.3克(S)-3-羟基-γ-丁内酯。对于多糖，例如在上面专利中提到的麦芽糖糊精、淀粉和纤维素，(1,4)和/或(1,6)葡萄糖单元象网一样复杂地连接起来。问题在于从包含在(1,6)连接单元上的(1,4)连接端基的还原端基单元上进行的逐步氧化反应。因此，没有形成更多的目标产物。同样，由于还原端基单元的过度氧化，多糖被降解为复杂的酸混合物，包括甲酸、草酸、乙醇酸、和赤糖酸，[J.Am.Chem.Soc.,81,3136(1959)；Starch41 Nr.8,S.303~309(1989)；Synthesis,597~613(1997)]。
通过酸或碱水解，将较高分子量糖降解为相对较低分子量糖，进行了从多糖来提高(S)-3,4-二羟基丁酸或(S)-3-羟基-γ-丁内酯收率的努力。虽然在该方法中，反应活性被提高到一定程度，(1,4)连接和(1,6)连接不被选择性地水解而得到无规的分布。相应地，在以高收率制备(S)-3,4-二羟基丁酸衍生物上存在严重问题[Encyclopedia ofChemical Technology,3rd ed.492~507]。
关于采用(1,4)连接的多糖制备(S)-3-羟基-γ-丁内酯，从还原端基单元连续地进行逐步氧化反应成为非还原端基单元，以得到(S)-3,4-二羟基丁酸，直到保留最后的链单元(离去基团)。即如果(1,4)-连接的多糖被用作制备(S)-3-羟基-γ-丁内酯的原料，可得到的理论物质转化率为63wt％，大约高于采用二糖方法的两倍。换句话说，从100克(1,4)-连接的多糖可以得到63克(S)-3-羟基-γ-丁内酯。同样，与二糖相比，在反应混合物中，由于产生出少量的离去基团，目标产物容易提纯。因此，(1,4)-连接的多糖的使用可望提高生产率。
但是，关于常规的多糖，在逐步氧化反应中，由于具有无规(1,4)键和(1,6)键的紧密结构，目标产物和副产物(酸，例如甲酸、草酸、乙醇酸和赤糖酸)是竞争地形成的。因此，多糖向具有(1,4)键的适当的糖分布范围的选择性降解技术是需要的。
另外，为了工业应用，采用生物酶处理过程，由较高分子量糖向较低分子量糖的转变已有许多报道。
已介绍的技术包括通过酶处理淀粉来制备葡萄糖、麦芽糖和乙醇[USP 3,791,865(1974)；USP 3,922,200(1975)；USP 4,855,232(1989)；日本专利公开4-158,795(1992)；Methods Carbohydr.Chem.,10,231~239(1994)；Methods Carbohydr.Chem.,10,245~248(1994)]，以及制备具有适当葡萄糖当量(DE)的麦芽糖糊精[USP 3,986,890(1976)；USP 4,447,532(1984)；USP 4,612,284(1986)；USP 5,506,353(1996)]。在这些参考文献中，通过高分子量多糖的降解或转化，它们被转化为用于医药、食品添加剂和诊疗试剂的适当物质。
但是到现在，为了大量生产(S)-3-羟基丁内酯通过用酶生物处理高分子多糖而制备(1,4)连接的寡糖的方法还不知道。
本发明的总结本发明的发明人经过大量努力，开发了从商业上容易得到的直链淀粉制备光学纯(S)-3-羟基-γ-丁内酯的方法。我们发现在特定条件下通过直链淀粉与酶的反应，接着通过氧化、酯化和环化得到的α-(1,4)连接的寡糖，由于寡糖的结构特殊性，由氧化反应形成的副产物被最小化。而且，可以在同样的反应器中连续地进行氧化反应，而不需要另外分离和提纯上面制备的寡糖。
相应地，本发明的目的是提供一种方法，该方法被用来以高的收率制备用作制备光学纯(S)-3-羟基-γ-丁内酯原料的寡糖，不需要对中间体进行额外的提纯。
图的简要介绍图1a代表由外消旋3-羟基-γ-丁内酯的气相色谱仪(GC)得到的光学纯度分析结果。
图1b代表由从常规方法的二糖制备的3-羟基-γ-丁内酯的气相色谱仪(GC)得到的光学纯度分析结果。
图1c代表由从本发明的寡糖制备的3-羟基-γ-丁内酯的气相色谱仪(GC)得到的光学纯度分析结果。
本发明的详细介绍本发明的特征在于在pH4.0~8.0和40~120℃下，酶反应直链淀粉为由式1表示的α-(1,4)连接的寡糖。 下面给出了本发明的详细介绍。
本发明涉及到采用特殊的酶将直链淀粉转化为具有最佳糖分布的的寡糖，以制备目标产物。即本发明通过解决由于直链淀粉的特殊结构，即由于分子间氢键的双螺旋结构造成的问题，促进了接下来的氧化反应。本发明的基本发明思路为采用特殊的酶，将直链淀粉降解为具有最佳糖分布的的寡糖，以大批量生产(S)-3-羟基-γ-丁内酯。
本发明的制备过程是有优势的，这在于用α-淀粉酶降解了由于非常强的分子间氢键形成的双螺旋结构，以从所述的直链淀粉获得得到具有适当糖分布的的寡糖。在这种酶反应中，如果α-淀粉酶反应过长的时间，直链淀粉被过度降解，因此得不到想要的寡糖。相应地，在本发明中，引入了使转化的寡糖失活的技术。
本发明的酶反应是在40~120℃下，在水或pH4.0~8.0的缓冲溶液中进行的。α-淀粉酶是以直链淀粉的0.001~10wt％的范围被采用，并且α-淀粉酶的酶反应被进行30分钟到4小时，并且然后剩余的α-淀粉酶被失活。失活反应是在酸性(pH2.0~4.5)和高温(60~150℃)条件下进行的，并且持续10分钟到4小时。制备的寡糖的还原端基单元和分子量分布是通过光学分析器、HPLC分析和凝胶渗透色谱(GPC)分析，从还原端基单元和葡萄糖当量分析来分析出的。
寡糖是通过选择性酶反应得到的，并且具有大多数在3~50个葡萄糖单元并且优选地5~50个葡萄糖单元的分布。由于制备的寡糖具有适当的糖分布，以制备(S)-3-羟基-γ-丁内酯，通过连续的顺序反应并使副产物最小化(即甲酸、草酸、乙醇酸和赤糖酸的酸混合物)，(S)-3-羟基-γ-丁内酯的收率很高。而且，得到的(S)-3-羟基-γ-丁内酯被证明光学性很纯(＞99.9％ee)。
本发明的制备过程的详细说明如下。它包括1)采用特殊酶的生物处理，通过直链淀粉的降解制备在式1中表示的具有特征α-(1,4)连接的寡糖的步骤，2)通过氧化反应，制备(S)-3,4-二羟基丁酸的酯的步骤，和3)通过环化制备的酯化合物，以高的收率制备光学纯(S)-3-羟基-γ-丁内酯的步骤。特别地，本发明的制备过程的特征为在同样的反应器中制备(S)-3-羟基-γ-丁内酯，而不需要另外提纯中间体(寡糖和(S)-3,4-二羟基丁酸的酯)。
在30~65℃条件下，通过滴加碱和氧化剂6-36小时进行寡糖的氧化。过氧化氢、碱金属过氧化物、碱土金属过氧化物和烷基过氧化氢被用作氧化剂，并且过氧化氢或叔丁基过氧化氢为最优选。氧化剂是以直链淀粉的每摩尔葡萄糖单元的1-3当量的范围被采用。碱是选自由碱金属氢氧化物或碱土金属的氢氧化物组成的种类中，并且氢氧化钠或氢氧化钾是优选的。碱是以直链淀粉的每摩尔葡萄糖单元的2-4当量的范围被采用。
不同原料的(S)-3-羟基-γ-丁内酯的制备收率比较如下[参考实验实施例1]。如果从奶酪副产物得到的麦芽糖(二糖)或乳糖(二糖)被用作原料，(S)-3-羟基-γ-丁内酯的理论物质转化率为不超过所用的原料重量的28.3wt％。另一方面，如果采用具有超过50个葡萄糖单元的多糖中的直链淀粉，(S)-3-羟基-γ-丁内酯的理论物质转化率类似于本发明制备的寡糖的理论物质转化率。但是，由于非常强的分子间氢键形成的双螺旋结构限制了逐步氧化反应，因此收率变得很低。然而，通过将本发明的寡糖用作原料，(S)-3-羟基-γ-丁内酯的收率高到所用原料重量的57.2wt％。
为了从制备出的(S)-3,4-二羟基丁酸合成(S)-3-羟基-γ-丁内酯，顺序地进行酯化和环化反应。
本发明的酯化反应是在30-80℃范围内，在酸催化剂存在下，采用同时作为反应溶剂和试剂的醇进行的。无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸和硝酸，或有机酸例如氟代烷基磺酸、芳烷基磺酸、芳烷基磺酸的水合物和三氟乙酸被用作酸催化剂。具有1-5个碳原子的线型或支链醇被用作醇。
在酸催化剂存在下，在30-80℃范围内的温度下进行本发明的环化反应2-5小时，以得到目标化合物，(S)-3-羟基-γ-丁内酯。无机酸例如盐酸、硫酸、磷酸和硝酸，和有机酸例如氟代烷基磺酸、芳烷基磺酸、芳烷基磺酸的水合物和三氟乙酸被用作酸催化剂。
如上面说明的，本发明的优点在于通过应用特殊的酶，通过将直链淀粉转化为寡糖，氧化直链淀粉的低反应性被解决了。而且，副产物的形成被最小化，并且可以以高的收率和很简单的提纯过程制备光学纯(S)-3-羟基-γ-丁内酯。
下面的实施例是为了作为本发明的例证，并且不应被认作限制由附带的权利要求书所确定的本发明的范围。实施例1(S)-3,4-二羟基丁酸甲酯的制备将10升水和5公斤干的直链淀粉加入到50升的反应器中。当将反应器加热到55℃后，加入12克α-淀粉酶(从Bacillus licheniformisNovo Nordisk来的BAN；EC 3.2.1.1)。在将反应溶液加热到75℃后，在该温度下搅拌反应溶液2小时。加入5毫升0.1N的HCl溶液以调节反应溶液的pH为3.0-3.5，然后，在90℃下搅拌反应溶液1小时，以使剩余的α-淀粉酶失活。在将反应混合物缓慢冷却到60℃后，在24小时内，将40％的NaOH(8.64公斤)溶液和30％的H2O2(5.25公斤)溶液滴加到反应溶液中，并在该温度下搅拌反应溶液1小时。采用NMR分析证明了制备的(S)-3,4-二羟基丁酸的钠盐。1H-NMR(D2O,ppm)δ2.27(dd,1H),2.39(dd,1H),3.41(dd,1H),3.51(dd,1H),3.8~3.9(m,1H)将反应溶液浓缩并加入10升的甲醇。将硫酸加入以调节pH为4~5，然后在50℃下将反应溶液搅拌3小时。将碳酸钠加入以中和溶液，并将反应溶液过滤以除去副产物，然后将甲醇浓缩以得到(S)-3,4-二羟基丁酸甲酯。通过与内标比较，以NMR分析证明了(S)-3,4-二羟基丁酸甲酯的形成(转化率92％)。1H-NMR(CDCl3,ppm)δ2.5(dd,2H),3.5(dd,1H),3.6(dd,1H),3.7(s,3H),4.1(m,1H)。实施例2(S)-3-羟基-γ-丁内酯的制备将10升水和5公斤干的直链淀粉加入到50升的反应器中。当将反应器加热到55℃后，加入12克α-淀粉酶(从Bacillusamyloliquefaciens,Novo Nordisk来的Teramyl；EC 3.2.1.1)。在将反应溶液加热到85℃后，在该温度下搅拌反应溶液2小时。加入5毫升0.1N的HCl溶液以调节反应溶液的pH为3.0-3.5，然后，在90℃下搅拌反应溶液1小时，以使剩余的α-淀粉酶失活。在将反应混合物缓慢冷却到60℃后，在24小时内，将40％的NaOH(8.64公斤)溶液和30％的H2O2(5.25公斤)溶液滴加到反应溶液中，并在该温度下搅拌反应溶液1小时。采用NMR分析证明了制备的(S)-3,4-二羟基丁酸的钠盐。1H-NMR(D2O,ppm)δ2.27(dd,1H),2.39(dd,1H),3.41(dd,1H),3.51(dd,1H),3.8~3.9(m,1H)将反应溶液浓缩并加入10升甲醇。在该溶液中加入甲烷磺酸以调节pH为4~5，然后在50℃下将反应溶液搅拌3小时。冷却后，将碳酸钠加入以中和溶液，并将反应溶液过滤以除去副产物，然后将甲醇浓缩以得到(S)-3,4-二羟基丁酸甲酯。通过与内标比较，以NMR分析证明了(S)-3,4-二羟基丁酸甲酯的形成(转化比率93％)。1H-NMR(CDCl3,ppm)δ2.5(dd,2H),3.5(dd,1H),3.6(dd,1H),3.7(s,3H),4.1(m,1H)不进行任何分离，加入0.5wt％浓HCl，在减压下的65℃下使制备的(S)-3,4-二羟基丁酸甲酯成环。用乙酸乙酯溶解得到的溶液并用碳酸钠中和得到的溶液。在过滤和浓缩得到的溶液后，得到(S)-3-羟基-γ-丁内酯(2.86公斤，所用直链淀粉的57.2wt％)。1H-NMR(CDCl3,ppm)δ2.28(dd,1H),2.74(dd,1H),4.13(dd,1H),4.32(dd,1H),4.4-4.5(m,1H)对比实施例1从淀粉制备(S)-3-羟基-γ-丁内酯将20升水和5公斤干的淀粉加入到50升的反应器中，并将温度升高到70℃。在48小时内，将40％的NaOH(8.64公斤)溶液和30％的H2O2(5.25公斤)溶液滴加到反应溶液中，并在该温度下搅拌反应溶液1小时。如实施例2，将反应溶液酯化和成环，以得到(S)-3-羟基-γ-丁内酯(1.1公斤，所用淀粉重量的22.0wt％)。对比实施例2从淀粉制备(S)-3-羟基-γ-丁内酯将10升0.5N的HCl溶液和5公斤干的淀粉加入到50升的反应器中，并在100℃下使淀粉水解20分钟。在将溶液冷却到20℃后，用100毫升40％的NaOH溶液中和溶液并将温度升高到70℃。在48小时内，将40％的NaOH(8.64公斤)溶液和30％的H2O2(5.25公斤)溶液滴加到反应溶液中，并在该温度下搅拌反应溶液1小时。如实施例2，将反应溶液酯化和成环，以得到(S)-3-羟基-γ-丁内酯(1.22公斤，所用淀粉重量的24.4wt％)。对比实施例3从直链淀粉制备(S)-3-羟基-γ-丁内酯将20升水和5公斤干的直链淀粉加入到50升的反应器中，并将温度升高到70℃。在48小时内，将40％的NaOH(8.64公斤)溶液和30％的H2O2(5.25公斤)溶液滴加到反应溶液中，并在该温度下搅拌反应溶液1小时。如实施例2，将反应溶液酯化和成环，得到(S)-3-羟基-γ-丁内酯(1.35公斤，所用直链淀粉重量的27.0wt％)。实验实施例1对比不同原料的(S)-3-羟基-γ-丁内酯的收率对于含有表1所示的各种碳水化合物的反应溶液，如实施例2进行氧化、酯化和成环，得到(S)-3-羟基-γ-丁内酯。(S)-3-羟基-γ-丁内酯的收率如表1所示。
表1
表1表明，对于二糖，相对质量转化率低到23.7wt％。另一方面，如果采用特殊的酶处理，将直链淀粉转化为寡糖，则相对质量转化率被提高到57.2wt％，几乎是二糖的两倍。如果不用酶处理直链淀粉，则相对质量转化率低到27.0wt％。实验实施例2(S)-3-羟基-γ-丁内酯的光学纯度分析采用下面的方法合成(S)-3-醋酸基-γ-丁内酯，以分析由本发明和常规制备方法制备的(S)-3-羟基-γ-丁内酯的光学纯度。
将102毫克(1mmol)以各种方法制备的(S)-3-羟基-γ-丁内酯溶解在3毫升的二氯甲烷中，将0.4毫升(5mmol)吡啶和0.47毫升(5mmol)乙酸酐加入到溶液中。3小时后，用1N的HCl终止反应。用二氯甲烷萃取(S)-3-羟基-γ-丁内酯。结束后，用二氧化硅凝胶柱色谱仪提纯(S)-3-醋酸基-γ-丁内酯。将得到的(S)-3-醋酸基-γ-丁内酯溶解在二氯甲烷中，用注射器取出0.5μl进行GC分析。结果如下面表2和图1a~1c所示。
表2
为了提高医疗效果并使副作用最小，对于手性化合物，需要高于99.5％ee的高光学纯度。表2和图1a~1c显示由本发明制备的(S)-3-羟基-γ-丁内酯的光学纯度高达99.9％ee。因此，它非常适合用作其它手性化合物的中间体。结果分别显示于图1a、1b和1c。
本发明的制备方法得到了光学纯(S)-3-羟基-γ-丁内酯，它非常适合用工业应用，因为副产物的形成被最小化并且提纯过程很简单。它包括碱氧化在特定条件下从直链淀粉的酶反应得到的α-(1,4)连接的寡糖，接着通过酯化和环化得到目标产物。本发明解决了采用昂贵金属催化剂进行选择性不对称还原反应的缺点，并且使从具有光学纯手性中心的非昂贵天然产品的分离容易，因此，使作为各种医药的手性中间体的工业应用得到最优化。而且，其相对质量转化率几乎为采用二糖时的两倍。
权利要求
1．在pH4.0~8.0和40~120℃的条件下，通过直链淀粉的α-淀粉酶的酶反应，制备由式1表示的α-(1,4)连接的寡糖的方法。
2．根据权利要求1的方法，其中所述的酶反应是在水或pH4~8的缓冲溶液中进行的。
3．根据权利要求1的方法，其中所述的α淀粉酶是以直链淀粉的0.001~10％的范围被采用。
4．根据权利要求1的方法，其中所述的寡糖具有3到50个葡萄糖单元。
5．根据权利要求1的方法，其中在α-淀粉酶的酶反应后，剩余的α-淀粉酶在pH2.0~4.5和温度60~150℃的条件下被失活。
全文摘要
本发明涉及到制备α－(1,4)－连接的寡糖的过程,并且更具体地,涉及到在特定的条件下,通过酶与容易从天然产品得到的直链淀粉的反应,制备由1式表示的寡糖的过程。由于从本发明制备的寡糖为α－(1,4)－连接的并且具有适当的糖分布,它特别适合用作制备光学纯(S)－3－羟基－γ－丁内酯的原料。
文档编号C07C69/675GK1316008SQ99810313
公开日2001年10月3日 申请日期1999年7月23日 优先权日1998年7月24日
发明者朴英美, 千钟弼, 赵翼行, 卢炅淥, 柳昊成, 黄大一 申请人:三星精密化学株式会社