一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法与流程

本发明属于谷物品质检测
技术领域：
，具体涉及一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法。
背景技术：
：水稻是世界三大粮食作物之一，全世界约1/3的人口是以大米为主食。大米的生产量和消费量长久以来一直是粮食作物中最多的，而基本上大部分水稻种植者和消费者都在亚洲。水稻品质的提高和这些地区人们的生活水平及健康都是密不可分的。大米是我国绝大多数人的主要主食，同时也是我国主要的出口产品。随着人们生活水平的不断提高，对大米品质的要求也越来越高，有机大米逐渐走进了消费者的餐桌。有机大米是指来自于有机农业生产体系，根据国际有机农业生产要求和相应的标准生产加工的，并通过独立的有机食品认证机构认证的大米产品。由于有机水稻在种植和生长的整个过程都不允许施用任何化学合成的农药、化肥、生长调节剂等，更容易受到病虫草害等因素的影响，因此有机大米产品具有产量低、精米率低、成本高等特点。目前我国有机大米的消费额以每年30％～50％的速度增长，据预测，未来10年内，我国有机大米年均增长率将达20％～30％。有机稻米产业快速发展的同时也伴随着诸多问题，许多生产商“以次充好、以假乱真”的行为，极大的扰乱了有机大米产品市场的正常发展。因此，建立一种鉴别有机大米的方法具有很强的实用意义。代谢组学是系统生物学中的重要分支，是主要对内源性及外源性小分子代谢产物进行定性和定量检测的一门科学。代谢组学可以较为全面地研究植物复杂代谢过程及其产物，因此近年来在植物研究领域受到广泛关注。植物代谢组学的发展为分析植物次生代谢网络结构、限速步骤、解析细胞活动过程以及寻找植物间的亲缘关系等等提供了可能。根据研究目的的不同，可以将代谢组学分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学。非靶向代谢组学是一种无偏向的代谢组学分析，主要针对生物体内源性代谢物进行系统全面的分析；靶向代谢组学是一种定向的分析，主要针对特定的某一类代谢物进行的分析。目前，非靶向代谢组学分析由于其对次级代谢产物的差异性研究，使其在植物活性物质差异分析、代谢机制和相关代谢网络，尤其是植物品种及产地的差异性鉴别方面应用广泛。现有的对有机大米的检测项目仅仅局限在几个常见的指标，无法对有机大米品质做出综合而有效的判断，而人工的判断方法受各种因素的影响较大，信服力太弱。技术实现要素：本发明的目的是为了解决采用现有检测手段无法对大米品质做出综合而有效的判断的问题，提供一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述方法如下：将有机大米样品和非有机大米样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱方法实现对前处理后的有机大米样品和非有机大米样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到的有机大米样品和非有机大米样品的超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法正交偏最小二乘-判别分析模型区分有机大米和非有机大米，并利用s曲线图得到对辨别影响较大的因素，通过开源在线数据库massbank对这些物质进行识别。本发明相对于现有技术的有益效果是：(1)应用了代谢组学技术结合超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱技术对大米样品中次级代谢产物分析，信服力高。非靶向代谢组学技术可以对代谢物的整体情况进行研究，更能反映样本的整体情况，同时，可应用统计学知识寻找差异性代谢物，为进一步研究提供技术支持。(2)采用本发明的分析方法能够有效区分有机大米和非有机大米，结果以opls-da得分图的形式展示，并利用开源在线数据库对差异性物质(潜在生物标示物)进行鉴定。能够直观的判别其分类情况，无需进行相关验证和分析，可以得到结论，检测结果准确可靠。(3)大米样品前处理方法简单快捷，方法建立后对检测人员操作技术要求较低。在整个前处理过程，为了保证尽可能多的获取大米样品的代谢物信息，提取试剂用的是甲醇和水的混合溶剂对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。经过实验验证，不适合的前处理方法不能最大限度地提取大米样品的内源性代谢产物，将会造成不容易区分的检测结果，使得检测结果不准确。(4)简化操作流程：传统的检测需要配置标准样品，绘制标准曲线，同时需要对多种化学物质进行测定，过程繁琐，费时费力。应用非靶向的代谢组学方法进行测定，前处理过程简单，操作方便，上机操作也比较便捷，可以进行批量处理，省时省力，可信度高。(5)针对超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱应用代谢组学区分有机大米和非有机大米的分析方法，本发明根据大米样品的特点，优化筛选得到一组使得分析样品得到最佳分离效果和检测效果的超高效液相色谱条件以及四级杆-飞行时间高分辨质谱的工艺条件，经过试验验证，通过该工艺条件，能够在opls-da得分图上将有机大米与非有机大米有效区分。(6)在opls-da模型的基础上，利用s曲线图筛选出对分离影响较大的因子，并利用数据库对这些物质进行识别。识别出的物质可以作为目标物质为今后有机大米的鉴别分析打下基础。(7)本发明使用了四级杆-飞行时间高分辨质谱，分辨率较高，与其他的检测方法相比，可以得到更准确和更多的物质，这在数据分析中具有显著的优势。附图说明图1为有机大米和非有机大米样品opls-da散点得分图；图2为opls-da模型的s曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。具体实施方式一：本实施方式记载的是一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述方法如下：将有机大米样品和非有机大米样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱方法实现对前处理后的有机大米样品和非有机大米样品中的化学成分的分离与测定，然后对得到的有机大米样品和非有机大米样品的超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱(uhplc-q-tofms)原始数据进行预处理，最后应用多元统计分析方法正交偏最小二乘-判别分析(opls-da)模型区分有机大米和非有机大米，并利用s曲线图(s-plot)得到对辨别影响较大的因素(潜在生物标示物)，通过开源在线数据库massbank(http://www.massbank.jp/)对这些物质进行识别。具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述的有机大米样品和非有机大米样品品种均为稻花香、龙粳、松粳中的一种或多种。具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述的前处理具体为：将有机大米样品和非有机大米样品粉碎，过1mm孔径筛，再将过筛后的有机大米样品和非有机大米样品与有机溶剂混合，超声，离心，过有机滤膜，即完成前处理，得到可上机检测的样品。具体实施方式四：具体实施方式三所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述的有机大米样品和非有机大米样品与有机溶剂的添加比例均为1g：(3～10)ml，优选1g：5ml，可保证样品中代谢物提取效果较好；所述的有机溶剂为甲醇水溶液，体积分数为60～85％，最优选为70％。具体实施方式五：具体实施方式三所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，超声时间为10～40min，优选为30min；离心的具体条件为：4℃条件下8000～12000rpm离心15～30min，优选10000rpm离心20min。具体实施方式六：具体实施方式三所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述的有机滤膜孔径为0.20～0.25μm，优选为0.22μm。具体实施方式七：具体实施方式一所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述的超高效液相色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱(c18柱)；a相：甲酸水溶液，b相：甲酸乙腈溶液，梯度洗脱流程：0～1.5min，15％b；1.5～5.0min，15-55％b；5.0～17.0min，55～70％b；17.0～20.0min，70-90％b；20.0～21.0min，90-15％b。具体实施方式八：具体实施方式七所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述的甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％；所述的甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.1％；流速0.3ml/min，柱温36℃；进样量5μl。具体实施方式九：具体实施方式一所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，所述的四级杆-飞行时间高分辨质谱选用aglient6540uhdaccurate-massqtofspectrometer，质谱条件为：双esi源，正离子模式，干燥气体温度325℃，流速9l/min；雾化器压力45psi；毛细管电压4000v；采样锥电压，140v；提取锥形电压，65v；扫描范围，m/z：50～2000；扫描模式：fullscan(全扫描)；参考离子为m/z：301.998139和1033.988109。具体实施方式十：具体实施方式一所述的一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，对得到的有机大米样品与非有机大米样品的uhplc-q-tofms原始数据采用msconvert软件进行转格，再用xcms软件进行预处理，该预处理指对总离子流色谱图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据，然后通过多元分析方法opls-da得分图的形式区分结果进行展示，并通过s曲线图筛选出对鉴别结果影响较大的物质(潜在标识物)，利用在线数据库massbank对潜在标识物进行鉴别。术语解释：多元统计分析方法是建立在多元统计分布基础上的一类处理多元统计数据方法的总称，是统计学中的具有丰富理论成果和众多应用方法的重要分支。常用的多元统计分析方法主要包括：多元回归分析、聚类分析、判别分析、主成分分析、因子分析、对应分析、典型相关分析等。本发明主要采用正交偏最小二乘-判别分析法(orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，opls-da)。仪器与设备：aglient1290uhplcsystem，德国安捷伦公司；acquitybehc18column(2.1id×150mm,particlesize1.7μm)，美国waters公司；aglient6540uhdaccurate-massqtofspectrometer，德国aglient公司；3k15实验室高速台式冷冻离心机，德国sigma公司；milli-q纯水仪，美国millipore公司；mx-s型涡旋仪，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；kq-700de型数控超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；材料与试剂：有机大米(经中绿华夏有机食品认证中心认证)，由各大米生产公司获得；非有机大米，由各地农户处获得；超纯水(18.2mω·cm)，milli-q纯水仪获得；乙腈(色谱纯)，德国merck公司；甲醇(色谱纯)，美国sigma公司；无水甲酸(色谱纯)，德国merck公司。本发明分析方法的原理是：不同的种植方式会导致大米内源性代谢物质的差异，这些差异直接影响了大米产品的品质，使用uhplc可以将大米中的化学物质分开，使用质谱技术进行检测，可以得到大米的液相和质谱数据，然后应用代谢组学分析技术，对所得的数据应用opls-da技术进行分析，从而直观区分有机和非有机大米样品。高效液相色谱是一种采用小颗粒填料色谱柱(粒径小于2μm)和超高压系统(压力大于105kpa)的新兴液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，适用于微量复杂混合物的分离和高通量研究。同时，aglient6540uhdaccurate-massqtofspectrometer具有超高分离度、超高速度、超高灵敏度等特点，可以对大米中的化学物质进行更精确地检测，使结果更可靠，更有信服力。具体包括以下步骤：将有机大米样品和非有机大米样品分别采用有机溶剂进行前处理后，应用超高效液相色谱串联四级杆-飞行时间高分辨质谱方法实现对前处理后的样品的化学成分的分离与测定，然后对所得到的大米样品的uhplc-q-tofms原始数据进行转格和预处理，最后应用多元统计分析方法正交偏最小二乘-判别分析(opls-da)模型区分有机大米样品和非有机大米样品。对于不同产地的大米样品，种植环境还受到海拔、经纬度、光照、温度、湿度等影响，所以即使同为有机大米，不同产地之间的大米样品中的代谢物组成和含量不会完全相同，故它们之间会呈现一定的差异，但是经过本发明的实验验证，这并不影响最终的检测结果，能够进行有效的区分。在本发明的某些实施例中，所述大米样品选择稻花香、松粳、龙粳中的一种或多种。在整个前处理过程中，为了保证尽可能多的获取样品的代谢物信息，提取试剂选用的是甲醇和水的混合溶剂对测试样品进行溶解，超声后离心过有机滤膜即可上机检测，前处理步骤简单，易于操作。在本发明的优选实施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为70％。本发明还进行了其他提取试剂的研究，如乙醇水溶液，丙酮溶液以及异丙醇溶液，但是得到的效果并不理想，无法全面的提取大米样品中的代谢物。在本发明某些优选的实施例中，样品前处理过程包括：将大米样品粉碎，过筛(1mm孔径)，与有机溶剂混合，超声，离心，过有机滤膜，得到可上机检测的样品。其中，超声时间为10～40min，优选30min；离心条件：4℃条件下8000～12000rpm离心15～30min，优选10000rpm离心20min；有机滤膜孔径为0.20～0.25μm，优选为0.22μm；为保证样品中代谢物提取效果较好，样品与有机溶剂的添加比例为1g：(3～10)ml，优选1g：5ml。其中，所述大米样品与有机溶剂的添加比例较为关键，能够对测试样品充分溶解，从而获取更多的样品代谢物信息，使得最终检测结果更加准确。色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的，为了使每个组分都得到分离和鉴定，必须选择合适的色谱和质谱分析条件。本发明针对大米样品组分的特点，考察了超高效液相色谱中的流动相、梯度洗脱流程、柱温和进样量等条件对分离效率和分析速度的影响，最终优化筛选得到一组使得样品得到最佳分离效果的超高效液相色谱条件。在本发明优选的实施例中，超高效液相色谱条件为：采用十八烷基键合硅胶柱(c18柱)；a相：甲酸水溶液，b相：甲酸乙腈，梯度洗脱流程：0-1.5min，15％b；1.5-5.0min，15-55％b；5.0-17.0min，55-70％b；17.0-20.0min，70-90％b；20.0-21.0min，90-15％b。甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％，甲酸乙腈溶液中甲酸的体积分数为0.1％；流速0.3ml/min，柱温36℃；进样量5μl。大米样品是一个成分复杂的试样，本发明筛选得到的梯度洗脱程序能够更好的对大米样品中复杂物质的组分进行强有力的分离，为后续鉴别有机大米和非有机大米做好基础。本发明还采用了其他的梯度洗脱程序，发现不合适的梯度洗脱程序，无法使每个组分都得到有效的分离，进而无法有效区分有机和非有机大米。本发明针对大米样品的组分特点，为改善化合物的雾化和电离状况，提高灵敏度，通过对分辨率、气体流速、喷雾电压等条件进行考察，最终优化筛选得到一组使得检测效果准确的四级杆-飞行时间高分辨质谱条件。在本发明优选的实施例中，四级杆-飞行时间高分辨质谱选用aglient6540uhdaccurate-massq-tofspectrometer，质谱条件为：双esi源，正离子模式，干燥气体温度325℃，流速9l/min；雾化器压力45psi；毛细管电压4000v；采样锥电压，140v；提取锥形电压，65v；扫描范围，m/z：50～2000；扫描模式：fullscan(全扫描)；参考离子为m/z：301.998139和1033.988109。经过试验验证，通过该超高效液相色谱和质谱的工艺条件，能够在opls-da得分图上将有机大米样品和非有机大米样品有效区分。应用代谢组学技术可以测定许多内源性化合物的定性及定量信息。这些信息在输出的谱图上表现为许多信号峰，在色谱质谱图上表现为不同保留时间出现色谱峰。从处理效果和方便性来讲，在本发明优选的实施例中，对得到的大米样品和非有机大米样品的uhplc-q-tofms原始数据采用msconvert软件进行转格，再用xcms软件进行预处理，该预处理指对总离子流色谱图原始数据中的色谱峰的提取、峰对齐、去噪音等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据；然后通过多元统计分析方法opls-da得分图的形式对区分结果进行展示。其中，msconvert软件是proteowizard公司研制的一种数据转换格式软件，xcms是scrippscenter开发的一种通用处理lc-ms原始数据的软件。区分方法是：在opls-da得分图中，将有机大米样品点与非有机大米样品点所归属的区域进行比较，若是两者的样品分属于两个明显分离的区域，则说明两者差异明显。实施例1：一种利用代谢组学技术区分有机大米和非有机大米的方法，包括以下步骤：(1)样品前处理将大米样品粉碎，过筛(1mm孔径)，称取600mg样品于5ml离心管中，加入3ml提取溶剂(70％甲醇溶液(v/v))，涡旋混匀溶解，超声30min，4℃条件下10000rpm离心20min，然后将上清液过0.22μm有机滤膜，上机，上样量为5μl。(2)应用aglient1290uhplc系统串联aglient6540uhdaccurate-massq-tofspectrometer仪器实现对样品中化学成分的分离与测定。(1)液相色谱参数色谱柱：acquitybehc18column(2.1id×150mm，particlesize1.7μm)(acquity，waters，milford，ma，usa)。液相：a相，0.1％甲酸水溶液，b相：0.1％甲酸乙腈；流速：0.3ml/min；柱温36℃。时间/mina/％b/％085151.585155.0455517.0307020.0109021.08515(2)质谱参数正离子模式电离模式双esi源扫描模式fullscan干燥气体温度325℃流速9l/min雾化器压力45psi毛细管电压4000v采样锥电压140v提取锥形电压65v扫描范围m/z50～2000参考离子m/z301.998139和1033.988109(3)数据处理与多元统计分析对得到的大米样品的uhplc-q-tofms原始数据采用msconvert进行格式转制，并用xcms软件包进行预处理，该预处理是指对总离子流色谱原始数据中的色谱峰的提取，峰对齐，去噪音等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、去噪音等处理，得到各个峰的保留时间、峰高、峰面积和质荷比数据，然后通过simca-p软件的多元统计分析方法opls-da得分图的形式对鉴别结果进行展示。opls-da是一种有监督的检验方法，是一种多因变量对多自变量的回归建模方法。opls-da是pls-da的扩展，即先使用正交信号校正技术，将x矩阵信息分解成与y相关和不相关的两类信息，然后过滤掉与分类无关的信息，使相关的信息主要集中在第一个预测成分中，与pls-da模型相比较，opls-da能够更好地区分样品组间差异，提高模型的有效性和解析能力，使分析结果变得简单和易于解释，其判别效果可视化更加明显。(4)应用对象的成果展示：大米样品为20个有机大米样品，20个非有机大米样品，按照(1)～(3)的流程进行操作，得到有机大米和非有机大米的opls-da散点得分图。从opls-da散点图中可以看出各个样品的聚集及离散程度，每一个点代表一个样品，其中o1-o20代表20个有机大米样品(圆点)，c1-c20代表20个非有机大米样品(方块)。如图1所示，有机大米样品分布于散点图的左半部分(x轴负半轴)，非有机大米主要集中在散点图的右半部分(x轴正半轴)。这说明有机大米和非有机大米在次级代谢产物的成分和含量上有一定的差异，同时说明opls-da模型可以很好地将有机大米样品和非有机大米样品区分开来。根据数据的高可靠性(相关性)和高量级度(协方差)，一些对opls-da模型分类影响较大的因子(距离主体较远的点)可以被手动的选择出来，我们将其称之为潜在性生物标识物(potentialbiomarker)。由图2可知，共30个潜在生物标识物被筛选出来，其中过表达因子(s曲线图右上角)15个，低表达因子(s曲线图左下角)15个。截止至目前，没有权威的准则或参考标准可被应用于非靶向代谢组学化合物的鉴定当中。在本实施例中，我们利用在线开源数据库massbank(http://www.massbank.jp/)对上述最具统计学意义的30个潜在生物标识物进行物质鉴别，结果如表1所示。其中8个化合物，我们给出了可能性较高的化合物名称，其中的12个化合物，我们注释了分子式。组氨醇(histidinol)、锦葵色素苷(malvin)、松脂醇(pinoresinol)、兔唇花灵(lagochiline)、4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferylglucuronide)、香豆素106(coumarin106)、nα-苯甲酰-l-精氨酸(nα-benzoyl-l-arginine)及氢化辛可宁(hydrocinchonine)八种物质可被视作鉴别有机大米和非有机大米的标志性物质。表1潜在生物标识物的鉴定表1中，1.由metlin和massbank数据库确定2.基于峰值离子3.鉴定级别：1.被识别出的化合物，2.推定的注释化合物，3.推定的特征化合物，4.未知化合物4.nm-无匹配。当前第1页12