分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种分离测定利伐沙班及其杂质的方法及应用。

背景技术：

利伐沙班是一个高选择性直接抑制因子xa的口服抗凝药，其分子式为c19h18cln3o5s，化学名为：5-氯-n-({(5s)-2-氧代-3-[4-(3-氧代-4-吗啉基)-苯基]-1,3-噁唑烷-5-基}-甲基)-2-噻吩-甲酰胺，其结构式为：

在合成利伐沙班的工艺中，一些已知结构的中间体和未知杂质因去除不完全而残留，影响利伐沙班的纯度和质量，这些已知结构的中间体和未知结构的杂质以及伐沙班的降解产物统称为药物质量控制中通常所说的有关物质(即杂质)。这些杂质均要进行控制，以保证利伐沙班质量。

国家食品药品监督管理局颁发的利伐沙班片的进口标准，标准号为jx20080077。该进口标准不能对杂质i、杂质j、以及主峰后的杂质c和杂质f、杂质l、杂质e进行分离；杂质h的溶剂效应明显，极大的影响峰形，影响积分，进而影响杂质h的提取回收率；另外进口标准的稀释剂的酸浓度较大，影响主药的稳定性，进而降为杂质i、杂质j和未知杂质等。

专利cn105004802b公开了一种用液相色谱法分离测定利伐沙班及其相关杂质的方法，其流动相a加入了离子对，平衡所需时间长，且离子对试剂不稳定，基线有很多未知的小峰，对有关物质测定产生极大的干扰，又不能加入鬼峰小柱去除。

专利cn105738489a公开了一种用液相色谱法测定利伐沙班及其杂质的方法。其能够分析的杂质较少，仅5种。稀释剂与杂质h产生溶剂效应，影响杂质h的提取，从而影响杂质提取方法的准确度。

因此到目前为止，还没有公开的方法报道可稳定、准确地全面测定同时分离利伐沙班及其制剂杂质。因此开发一种能全面、快速、稳定分离分析利伐沙班及其制剂杂质的方法，对于药物的质量控制是十分有意义的工作。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离测定利伐沙班及其杂质的方法，其采用合适的稀释剂和流动相a、b，能够快速、稳定、准确、全面地分离分析利伐沙班及其制剂杂质。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

上述分离测定利伐沙班及其杂质的方法包含以下步骤：

1)取利伐沙班溶于稀释剂得样品溶液；

2)配制流动相：

a配制试剂a得流动相a；

b配制试剂b得流动相b；

3)将步骤1)所述样品溶液注入分离检测系统中，用步骤2)所述流动相对步骤1)所述样品溶液进行洗脱分离得洗脱液；

4)步骤3)所述洗脱液进入检测器测定。

步骤3)所述分离检测系统为高效液相色谱仪，其色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；

所述利伐沙班的杂质包括工艺杂质和降解杂质，为杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i、杂质j和杂质l的一种或多种，其结构为：

杂质l

作为优选的方案，色谱柱柱箱温度为20-50℃。

稀释剂：乙腈-酸的水溶液，其中酸的浓度为0.01-5mmol/l。

通过我们的试验发现，稀释剂酸度超过40mmol/l，有关物质，样品中的杂质和主峰不稳定；不加酸则样品中的辅料交联羧甲基钠会和我们的杂质h反应，影响杂质h的提取，从而影响样品中杂质提取方法的准确度。因此稀释剂加入适宜浓度的酸，进行提取，既能防止辅料的干扰对杂质h的提取，也能保证样品溶液的稳定性。

试剂a：含有甲醇和乙腈的缓冲盐溶液，其中甲醇和乙腈的体积占比为0-10％，且乙腈占甲醇和乙腈的体积比例为0-30％；

试剂b：缓冲盐溶液－乙腈。

上述的流动相a、b均能保证缓冲盐的恒定，这样能保证有关物质测定的基线的纯净和稳定，并且加入缓冲盐溶液，能保证流动相的ph值稳定，防止杂质g、杂质i、杂质l的移动。

流动相的初始比例，甲醇和乙腈的总占比不得超过10％，且乙腈占甲醇和乙腈的比例不得大于30％，否则杂质h的溶剂效应在有的仪器上能显示出来，有可能不同的仪器表现状态不同，有的表现理论踏板数降低，有的拖尾，有的双峰。

作为优选的方案，试剂a、b的缓冲盐溶液选自以下缓冲盐：磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、高氯酸盐，其浓度为0.005-0.02mol/l。

进一步，所述的缓冲盐溶液优选磷酸盐缓冲液。

进一步，所述缓冲体系的ph值为3-5。用磷酸溶液调节溶液ph值，在此ph值区间内均能很好地分离利伐沙班及其杂质。

作为优选的方案，稀释剂中酸溶液为磷酸溶液，稀释剂中乙腈的体积含量为20％-50％。

作为优选的方案，步骤4)所述检测器的波长为210-280nm。

作为优选的方案，步骤3)所述流动相流速为0.8-2ml/min。

进样速度也会影响色谱柱分离效果和分析结果。进样速度的影响：进样速度慢则会使色谱峰形加宽，影响分离效果。流速1.5保证分析时间较短，峰形较好，理论踏板数高。因此，进一步，流速优选为1.5ml/min。

上述方法能快速同时实现上述杂质的分离和检测，稳定性强且精密度和灵敏度高，可将利伐沙班及其11种杂质a-j和l完全分离并进行检测，提供了利伐沙班及其相关杂质的分离测定的方法，从而确保了利伐沙班原料药及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

本发明的目的之二在于提供一种上述方法在分离测定利伐沙班原料药和制剂中各有关物质含量的应用。上述方法可稳定、准确地快速测定同时分离利伐沙班及其原料药和制剂杂质，对药物的质量控制是十分有意义的工作。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供的稀释剂加入适宜浓度的酸，既能防止辅料的干扰对杂质h的提取，也能保证样品溶液及色谱峰的稳定性，与现有技术专利cn105738489a相比，稀释剂不会产生杂质h的溶剂效应，分离高，回收率高；

2)本发明提供的流动相，通过调节甲醇和乙腈的占比，提供了两种成分的比例范围，避免了此范围外杂质h的溶剂效应；

3)本发明提供的高效液相色谱法分离测定利伐沙班及其杂质，该方法可同时将利伐沙班及其杂质完全分离并进行检测，能够分离的杂质种类为11种；

4)本发明提供的方法简便可行，灵敏度高，准确度高，重现性好，可以有效分离和测定利伐沙班制剂中各有关物质含量，从而确保了利伐沙班原料药及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

附图说明

图1为实施例稀释剂1的高效液相色谱图。

图2为实施例稀释剂的高效液相色谱图。

图3为实施例利伐沙班系统适用性实验溶液的高效液相色谱图。

图4为实施例利伐沙班对照品溶液的高效液相色谱图。

图5为实施例利伐沙班供试品溶液的高效液相色谱图。

图6为对比实施例空白溶剂的高效液相色谱图。

图7为对比实施例利伐沙班样品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下将参照附图对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

分离测定利伐沙班及其杂质的方法

1.仪器与条件

仪器：高效液相色谱仪；

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，agilenteclipexdb-c18，250mm×4.6mm，5μm或性能相当的色谱柱；

检测器检测波长：250nm；

流动相流速：1.5ml/min；

流动相a：取1.0mol/l磷酸二氢钠溶液(用磷酸调ph值至3.0)10ml，加水至900ml，摇匀后，加入50ml甲醇和50ml乙腈；

流动相b：取1.0mol/l磷酸二氢钠溶液(用磷酸调ph值至3.0)10ml，加水至300ml，摇匀后，加入700ml乙腈；

稀释剂1：乙腈-0.2mol/l磷酸溶液-水(300∶10∶690)；

稀释剂2：乙腈-0.2mol/l磷酸溶液-水(600∶10∶390)；

稀释剂：2mmol/l磷酸溶液；

色谱柱柱箱温度为40℃；

进样量：5μl。

2.实验步骤

(1)系统适用性试验溶液：称取利伐沙班杂质k对照品(含杂质a、杂质g、杂质b、杂质i、杂质j、利伐沙班、杂质c，杂质e、杂质l及杂质f)10mg，置25ml量瓶中，加稀释剂2适量，超声使溶解，放冷，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性试验溶液。

供试品溶液：取本品5片(规格20mg)或10片(规格10mg)，置250ml量瓶中，加稀释剂2约125ml，超声处理约15分钟(随时振摇)，使片剂崩解完全，放冷，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；

对照品溶液：精密称取利伐沙班对照品适量，加稀释剂1溶解并稀释制成每1ml中约含400μg的溶液，摇匀，精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，用稀释剂1稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液2.0ml，置10ml量瓶中，用稀释剂1稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

(3)取上述稀释剂、系统适用性试验溶液、供试品溶液、对照品溶液各5μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，按表1所示的数据进行线性梯度洗脱，记录色谱图，结果见图1-5。

表1梯度洗脱程序

3.实验结果

(1)检查

供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除溶剂峰与梯度洗脱峰外，按下列公式计算各杂质的含量，各杂质不得过下表中限度规定，杂质总量不得过0.5％。下表2所列为各杂质峰的典型保留时间、相对保留时间、校正因子和限度规定。。计算公式：

式中：ax——供试品溶液中杂质峰峰面积；

as——对照品溶液中主峰峰面积；

cx——供试品溶液中利伐沙班的浓度,μg/ml；

cs——对照品溶液浓度,μg/ml；

f——杂质校正因子。

表2各杂质的保留时间、校正因子和限度规定

(2)系统适用性实验

取系统适用性试验溶液5μl注入液相色谱仪，记录色谱图，杂质l与杂质f的分离度应不小于1.0。

(3)测定法

取系统适用性试验溶液过柱，测定结果见表3。

表3实验测定结果

试验结果表明，本发明提供的方法基线好，稀释剂不干扰供试品的检测；各色谱峰之间的分离度均大于1.5；由此可见，本方法柱效高，分离效果好，专属性强。

对比实施例

1.仪器与条件

高效液相色谱仪：岛津lc-20at

色谱柱：purospherstarrp-18(55×4mm，3μm)

检测器检测波长：250nm

进样量：10μl

稀释剂：30％乙腈

2.分离测定利伐沙班及其杂质的方法

(1)取利伐沙班及对照品各适量，用30％乙腈水溶液溶解样品得样品溶液；

(2)流动相a的配制：称取戊烷磺酸钠0.8g、移取磷酸0.67ml于1000ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph值至3.8±0.1；流动相b为乙腈；

(3)取稀释剂和步骤(1)的样品溶液10μl注入型号为岛津lc-20at的色谱仪，色谱柱型号为purospherstarrp-18，设置流动相流速为1.0ml/min，检测波长为250nm，色谱柱柱箱温度为30℃；

表4梯度洗脱程序

按表4所示的数据进行线性梯度洗脱，完成利伐沙班有关物质的分离及测定。记录色谱图，对照品溶液测定结果见表5，高效液相色谱图见图6、图7。

表5实验测定结果

结合图6和图7，对比实施例2的基线有很多未知的小峰，对有关物质测定产生极大的干扰，又不能加入鬼峰小柱去除。因此会影响所测有关物质含量的准确度。

与对比实施例相比，本发明提供的方法基线好，稀释剂不干扰供试品的检测，分离高，回收率高且准确度高，因此可以有效分离和测定利伐沙班制剂中各有关物质含量，从而确保了利伐沙班原料药及其制剂的质量可控，并最终确定产品的安全有效。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。