本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种胶原纤维马松三色染色试剂盒及其制备方法和染色方法。
背景技术：
随着病理学的快速发展，病理组织染色成为该领域关键技术之一，特别是基于组织基本结构的伊红-苏木素染色法，不仅可直观反映组织内部细胞质和细胞核的变化，而且可通过细胞和细胞核的变化判定组织细胞的病变状态。然而，由于细胞结果的复杂性，组织内容还存在多种特殊结构，如胶原纤维、网状纤维、弹力纤维、肌肉组织、脂肪、糖原、粘液、病理性沉淀(如铜、含铁血黄素等)、核酸等，如何快速界定组织细胞内特殊结构成分的变化成为该领域亟待解决的问题。因此，组织细胞特殊染色技术得到了快速发展，通过该技术可确定组织细胞内正常结构和病理变化过程中出现的异常物质、病变及病原体等，更有利于直观展示组织细胞的病理学变化。
胶原纤维是一类分布最广泛、含量最多的，且主要含有胶原蛋白和氨基酸(如甘氨酸、脯氨和羟脯氨酸等)的纤维组合物，广泛分布于各脏器内，在皮肤、巩膜和肌腱最为丰富。为了明确胶原纤维的病理变化，常用vangieson、masson和mallary等特殊染色方法，淡绿可将其染成绿色，苯胺蓝可将其染成蓝色。然而，鉴于上述方法染色试剂的多样性和染色方法的复杂性，使得该染色过程比较繁琐复杂，从而限制了其在临床上的大规模应用。目前市场上商业化的成套染色产品几乎没有，部分企业开发的试剂多为上述染色方法中的部分大规格试剂，如250ml和500ml包装，染色过程依赖染缸等设备，导致染色工序操作复杂、成本高，从而限制了其广泛应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种胶原纤维马松三色染色试剂盒及其制备方法和染色方法，用以解决现有技术中依赖染缸染色导致操作复杂、成本高等问题。
本发明提供了一种胶原纤维马松三色染色试剂盒，包括盒体，盒体内包括6个滴瓶，6个滴瓶内分别装有不同试剂，滴瓶的容量为5ml或10ml。
进一步的，6个滴瓶中的试剂分别为苏木素染色液，盐酸分化液，返蓝液，丽春红酸性品红液，磷钼酸液和苯胺蓝液。
本发明的另一方面提供了一种胶原纤维马松三色染色试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)试剂配制
a、苏木素染色液：称取定量的苏木精溶解于无水乙醇中，得溶液a，称取定量的硫酸铝溶于蒸馏水中，得溶液b，将溶液a和溶液b混合后加入碘酸钠和冰醋酸溶解，最后经滤膜过滤；
b、盐酸分化液：量取定量的盐酸加入乙醇中混匀；
c、返蓝液：称取定量的碳酸锂溶解于蒸馏水，混匀后经滤膜过滤；
d、丽春红酸性品红液：称取定量的丽春红和酸性品红，加入蒸馏水中，混匀后加入乙酸，最后经滤膜过滤；
e、磷钼酸液：称取定量的磷钼酸溶解于蒸馏水，混匀后经滤膜过滤；
f、苯胺蓝液：称取定量的苯胺蓝溶解于蒸馏水，加入乙酸，混匀后经滤膜过滤；
2)试剂分装
分别将步骤1)所得苏木素染色液、盐酸分化液、返蓝液、丽春红酸性品红液、磷钼酸液和苯胺蓝液按试剂盒规格分装在滴瓶中，最后将装有6种试剂的滴瓶放置于试剂盒的盒体中。
进一步的，滤膜的孔径为0.45μm。
本发明的另一方面提供一种基于胶原纤维马松三色染色试剂盒的染色方法，包括如下步骤：
1)在组织切片上滴加1-2滴苏木素染色液，染色5-10min，水洗2-3min；
2)在步骤1)所得产物上滴加1-2滴盐酸分化液，分化2-3秒，水洗2-3min；
3)在步骤2)所得产物上滴加1-2返蓝液，返蓝6-10秒，水洗2-3min；
4)在步骤3)所得产物上滴加1-2滴丽春红酸性品红液，染色5-8min，水洗1-2min；
5)在步骤4)所得产物上滴加1-2滴磷钼酸液，染色1-3min，水洗2-3min；
6)在步骤5)所得产物上滴加1-2滴苯胺蓝液，孵育5min，水洗2-3min；
7)将步骤6)所得产物置于60℃温箱中烘干，透明、封片。
采用上述本发明技术方案的有益效果是：
本发明从试剂盒的包装、试剂的配方及染色过程进行优化，进而组装成一套基于滴注法的胶原纤维马松三色染色试剂盒，可直接用于小规模组织切片的快速染色，具体为：
采用滴瓶进行试剂包装，不仅节约了染色试剂，而且打破了传统大包装的染缸染色壁垒，具有经济、实用、特效、快速等特点；
系统优化开发组装成套试剂盒，弥补了市场上部分关键染色试剂不能完成全套染色的限制，通过该套试剂盒可完成胶原纤维的完整染色和展示。
附图说明
图1为本发明胶原纤维马松三色试剂盒染色结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明提供了一种胶原纤维马松三色染色试剂盒，包括盒体，盒体内包括6个滴瓶，6个滴瓶内分别装有不同试剂，滴瓶的容量为5ml或10ml，6个滴瓶中的试剂分别为苏木素染色液，盐酸分化液，返蓝液，丽春红酸性品红液，磷钼酸液和苯胺蓝液。
本实施例提供了一种胶原纤维马松三色染色试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1)试剂配制
a、苏木素染色液：称取4g苏木精溶解于250ml无水乙醇中，得溶液a，称取36g硫酸铝溶于750ml蒸馏水中，得溶液b，将溶液a和溶液b混合后加入0.4g碘酸钠和适量冰醋酸溶解，最后经0.45μm滤膜过滤；
b、盐酸分化液：量取1ml的盐酸加入99ml乙醇中混匀；
c、返蓝液：称取1.3g碳酸锂溶解于100ml蒸馏水，混匀后经0.45μm滤膜过滤；
d、丽春红酸性品红液：称取0.7g的丽春红和0.3g酸性品红，加入99ml蒸馏水中，混匀后加入1ml乙酸，最后经0.45μm滤膜过滤；
e、磷钼酸液：称取1g磷钼酸溶解于100ml蒸馏水，混匀后经0.45μm滤膜过滤；
f、苯胺蓝液：称取2g苯胺蓝溶解于98ml蒸馏水，加入2ml乙酸，混匀后经0.45μm滤膜过滤；
2)试剂分装
分别将步骤1)所得苏木素染色液、盐酸分化液、返蓝液、丽春红酸性品红液、磷钼酸液和苯胺蓝液按试剂盒规格分装在滴瓶中，最后将装有6种试剂的滴瓶放置于试剂盒的盒体中。
本发明的另一实施例提供一种基于胶原纤维马松三色染色试剂盒的染色方法，包括如下步骤：
1)动物模型制备
含尾蚴的钉螺购自中国江苏血吸虫防止研究所，逸出尾蚴，经腹部皮肤感染balb/c小鼠，每只小鼠人工感染日本血吸虫尾蚴20条，感染后继续喂养9周，之后杀死小鼠取肝脏组织备用。
2)组织取材、固定及包埋
将离体组织放入4％多聚甲醛组织固定液中固定24h-48h，固定液体积大于组织体积4-10倍；将固定好的组织放入水中30min以洗去固定液；随后将组织放入75％乙醇2h，转移到85％乙醇2h，转到95％乙醇1h，转到100％乙醇1.5-2h；然后将组织放入二甲苯i中透明30-45min，转入二甲苯ii中透明30-45min；将组织放入63℃石蜡，浸蜡1h；转入63℃石蜡，浸蜡2h；将烘箱中溶解的石蜡倒入包埋盒中，将组织放入包埋盒包埋。
3)组织切片
将包埋盒中的蜡块放入切片机中粗修，待组织漏出后，将切片厚度调至所需大小进行切片，用尖嘴镊把切片夹住放入45℃左右温水中，待其没有褶皱，完全展开，将玻片45度插入水中，移至最佳的切片下轻轻捞起，将切片转移到玻片上；将切片装入切片架中，65℃烘箱内放置0.5-1h；将切片放入二甲苯ⅰ中脱蜡5-10min，转入二甲苯ⅱ中脱蜡5-10min；无水乙醇洗涤1-5min，95％乙醇洗涤1-5min，75％乙醇洗涤1-5min，最后水洗切片。
4)染色
a、在组织切片上滴加1滴苏木素染色液，染色5-10min，水洗2-3min；
b、在步骤a)所得产物上滴加1滴盐酸分化液，分化2-3秒，水洗2-3min；
c、在步骤b)所得产物上滴加1返蓝液，返蓝6-10秒，水洗2-3min；
d、在步骤c)所得产物上滴加1滴丽春红酸性品红液，染色5-8min，水洗1-2min；
e、在步骤d)所得产物上滴加1滴磷钼酸液，染色1-3min，水洗2-3min；
f、在步骤e)所得产物上滴加1滴苯胺蓝液，孵育5min，水洗2-3min；
g、将步骤f)所得产物置于60℃温箱中烘干，透明、封片。
图1为该实施例染色结果图，可见虫卵区肝脏纤维化明显，染色效果优良。
综上，本发明从试剂盒的包装、试剂的配方及染色过程进行优化，进而组装成一套基于滴注法的胶原纤维马松三色染色试剂盒，可直接用于小规模组织切片的快速染色；
采用滴瓶进行试剂包装，不仅节约了染色试剂，而且打破了传统大包装的染缸染色壁垒，具有经济、实用、特效、快速等特点；
系统优化开发组装成套试剂盒，弥补了市场上部分关键染色试剂不能完成全套染色的限制，通过该套试剂盒可完成胶原纤维的完整染色和展示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。