基于近红外光谱和聚类分析技术的甘草快速鉴别方法与流程

本发明属于中药材鉴定
技术领域：
，涉及中药材的光谱鉴别方法，特别是涉及基于近红外光谱和聚类分析技术的甘草快速鉴别方法。
背景技术：
：甘草为豆科植物甘草（又称乌拉尔甘草）glycyrrhizauralensisfisch.、胀果甘草glycyrrhizainflatabat.或光果甘草glycyrrhizaglabral.的干燥根和根茎，甘，平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。素有“十方九草”之称。此外，甘草还被作为食品等使用。在我国，甘草分布范围最广，主要分布在西北、东北和华北地区，以内蒙古、宁夏、甘肃、新疆等西部地区所产的西甘草品质最佳。近年来，甘草作为药材、食品及烟草添加剂，其市场需求量急剧增加，野生资源遭到过度采挖，蕴藏量已不足50万吨，被列入《国家重点保护野生药材物种名录》二级保护野生药材。2000年国务院发布的《关于禁止采集和销售发菜制止滥挖甘草和麻黄草有关问题的通知》，明令禁止对甘草的掠夺性采挖。目前，市售甘草以人工栽培为主。但是由于栽培与野生药材之间存在质量差异，对二者进行准确鉴别，有利于指导临床及生产合理区分使用，提高临床疗效。中药鉴定旨在研究中药的品种、质量，保证临床疗效。目前，对于中药鉴定研究除传统的基原鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别外，以指纹图谱研究较多。其次，分子鉴定也已逐步开展。指纹图谱虽然可以反映药材的内在质量，但是需要考虑产地、采收期等因素对化学成分的影响，且需要对药材进行前处理；分子鉴定专属性强，但是其操作复杂，成本高。近红外光谱作为一种快速、价廉、无损分析方法，广泛应用于农业、食品、化学和石油化工等领域的定性和定量分析，已被欧美药典纳入附录内容。近红外光谱分析技术在中药材真伪、掺伪、产地、同属中药品种和中成药的鉴定及含量测定等方面已有相关研究报道。目前，野生甘草的自然分布区已大面积开展人工栽培，药材市场同时存在野生和栽培甘草。野生和栽培甘草成分空间分布格局、形态组织学、质量特征及市场销售价格均存在差异。目前对于甘草的鉴定主要集中在不同产地、不同品种来源的鉴定。如：中国专利号cn105543373a公开了一种快速鉴定不同品种来源甘草的方法；cn103293213a公开了一种乌拉尔甘草和胀果甘草种子的鉴定方法。但是，有关野生和栽培甘草的鉴别方法，特别是快速、准确鉴别野生和栽培甘草方法的研究报道，目前相对较少。狄天云，高晓娟，张霞等人采用hplc和紫外光谱法测定9批野生甘草和14批栽培甘草中甘草苷、甘草酸和总黄酮的含量并采集其近红外光谱信息。结果显示，基于指标成分定量的色谱鉴别无法有效鉴别宁夏野生和栽培甘草，近红外光谱结合聚类分析和主成分分析能够直观、快速、有效鉴别宁夏野生和栽培甘草样品，为甘草生长方式的鉴别及应用研究提供有效方法。同时，为甘草的品种、产地及规格等方面的鉴别提供了研究思路（狄天云,高晓娟,张霞,等.基于指标成分与近红外光谱对宁夏野生和栽培甘草的比较鉴别研究[j].中国中药杂志,2017,42(3):536.）。但是，该方法仅适用于宁夏野生和栽培乌拉尔甘草的鉴别，且未公开详细操作过程及技术参数。到目前为止，尚缺乏快速准确鉴别不同基原的野生及栽培甘草的系统、完整方法。技术实现要素：为克服现有技术的不足，针对目前无法快速、准确鉴别不同基原的野生及栽培甘草的问题，本发明的目的是提供基于近红外光谱和聚类分析技术的快速、准确鉴别不同基原的野生及栽培甘草的方法，用于指导临床或生产合理区分使用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种快速鉴别甘草基原及生长条件的方法，所述基原为豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch.、胀果甘草glycyrrhizainflatabat.、光果甘草glycyrrhizaglabral.中任意一种的干燥根和根茎，所述生长条件包括野生及栽培，其特征在于，包括如下步骤：sa1、甘草模型药材粉制备：取已知基原及生长条件符合《中国药典》2015年版一部“甘草”项下规定的甘草模型药材，同一基原野生和栽培甘草模型药材至少各取五批，分别除去杂质，粉碎，过180目筛，得到特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉。sa2、扫描获取特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉的近红外光谱图：分别称取特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉1g，用傅利叶变换近红外光谱仪扫描获得近红外光谱。sa3、利用聚类分析方法建立特定基原野生甘草模型及栽培甘草模型定性鉴别分析标准模型：将测得的各批次特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉近红外光谱数据导入opus5.5软件，采用一阶导数和矢量归一化预处理方式，对各批次特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉近红外光谱进行预处理后，设置平滑点为13，采用opus5.5软件进行聚类分析，特定基原野生甘草模型及栽培甘草模型分别聚类，建立近红外定性鉴别分析标准模型，保存，备用。sa4、供试品分析：取供试品，粉碎，过180目筛，称取1g，用傅利叶变换近红外光谱仪扫描获得近红外光谱，将测得的近红外光谱数据按步骤sa3方法处理，进行聚类分析，参照已保存的定性鉴别分析标准模型判定供试品的基原及生长条件。进一步，在步骤sa1中，所述同一基原野生和栽培甘草模型药材可使用对照药材。进一步，在步骤sa2中，所述用傅利叶变换近红外光谱仪扫描近红外光谱的测试条件为：分辨率8cm-1；样品累积扫描次数32scans；背景累积扫描次数32scans；光谱范围12000～4000cm-1；每个样品平行测定6次，取平均值作为该样品的原始光谱。进一步，在步骤sa3中，所述保存，包括保存所有过程数据及图谱。进一步，在步骤sa3中，建立定性鉴别分析标准模型后，可以通过分析已知基原及生长条件，且未参与建立近红外定性鉴别分析标准模型的甘草药材，评价标准模型的准确率。进一步，所述步骤sa4的另一种操作方法为：供试品分析：取供试品，粉碎，过180目筛，称取1g，用傅利叶变换近红外光谱仪扫描获得近红外光谱，将测得的供试品近红外光谱数据按步骤sa3方法进行预处理后，和保存的定性鉴别分析标准模型数据进行聚类分析，根据供试品的聚类情况判定供试品的基原及生长条件。在此基础上，进一步的技术方案是，一种快速鉴别甘草基原及生长条件的简化方法，所述基原为豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch.、胀果甘草glycyrrhizainflatabat.、光果甘草glycyrrhizaglabral.中任意一种的干燥根和根茎，所述生长条件包括野生及栽培，其特征在于，包括如下步骤：sb1、甘草模型药材粉制备：取已知基原及生长条件符合《中国药典》2015年版一部“甘草”项下规定的甘草模型药材，同一基原野生和栽培甘草模型药材至少各取五批，分别除去杂质，粉碎，过180目筛，得到特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉。sb2、扫描获取特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉的近红外光谱图：分别称取特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉1g，用傅利叶变换近红外光谱仪扫描获得近红外光谱。sb3、供试品分析：取供试品，粉碎，过180目筛，称取1g，用傅利叶变换近红外光谱仪扫描供试品获得近红外光谱，将测得的供试品近红外光谱数据与各批次特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉近红外光谱数据一同导入opus5.5软件，采用一阶导数和矢量归一化预处理方式，对各批次特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉近红外光谱进行预处理后，设置平滑点为13，采用opus5.5软件进行聚类分析，根据供试品的聚类情况判定供试品的基原及生长条件。本发明的有益效果。1、本发明基于近红外光谱技术，无损、价廉、快速、准确鉴别不同基原的野生及栽培甘草。2、在通过步骤sa3建立定性鉴别分析标准模型后，对已知基原及生长条件，且未参与建立近红外定性鉴别分析标准模型的甘草药材样本的检测结果显示，该方法对不同基原的野生及栽培甘草定性鉴别的准确率为100%。3、该方法用于不同基原的野生及栽培甘草定性鉴别非常简便、快捷，一般在10分钟内即可完成，准确度高，符合药品食品监督管理对快检的要求；由于检测过程中不使用任何试剂或标准品，成本低廉。附图说明图1是本发明实施例提供的105个不同产地的野生及栽培甘草glycyrrhizauralensisfisch.的干燥根和根茎的近红外聚类分析结果。图2为基于定性鉴别分析标准模型对甘肃产野生甘草glycyrrhizauralensisfisch.的干燥根和根茎验证样本g30w的定性鉴别图谱。图3为基于定性鉴别分析标准模型对内蒙产栽培甘草glycyrrhizauralensisfisc.的干燥根和根茎验证样本m47c的定性鉴别图谱。具体实施方式下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的内容并不局限于此。实施例：一种快速鉴别甘草基原及生长条件的方法，所述基原为豆科植物甘草glycyrrhizauralensisfisch.的干燥根和根茎，生长条件包括野生及栽培。包括如下步骤：s101、甘草模型药材粉制备：取已知基原及生长条件符合《中国药典》2015年版一部“甘草”项下规定的甘草模型药材，共从甘肃、宁夏、内蒙、新疆甘草产区收集样本130批，具体样本信息见表1，从中随机选取105批样本作为甘草模型药材，生长条件包括野生及栽培，且均超过5批；分别除去杂质，粉碎，过180目筛，得到105批特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉。表1从甘肃、宁夏、内蒙、新疆甘草产区收集甘草glycyrrhizauralensisfisch.的干燥根和根茎样本序号代码生长条件产地1d1c栽培吉林省齐齐哈尔市2d2c栽培黑龙江省黑河市嫩江县3g1c栽培甘肃白银市景泰县4g2c栽培甘肃酒泉市金塔县5g3c栽培甘肃酒泉市瓜州县6g4c栽培甘肃酒泉市瓜州县7g5c栽培甘肃张掖市高台县8g6w野生甘肃庆阳市环县9g7w野生甘肃庆阳市环县10g8w野生甘肃酒泉市金塔县11g9c栽培甘肃酒泉市玉门市12g10c栽培甘肃酒泉市玉门市13g11c栽培甘肃酒泉市玉门市14g12w野生甘肃酒泉市玉门市15g13w野生甘肃酒泉市玉门市16g14c栽培甘肃酒泉市玉门市17g15w野生甘肃天水市甘谷县18g16w野生甘肃平凉市庄浪县19g17w野生甘肃定西市临洮县20g18w野生甘肃酒泉金塔县21g19w野生甘肃庆阳市合水县22m1w野生内蒙阿拉善盟阿拉善右旗23m2w野生内蒙阿拉善盟阿拉善左旗24m3w野生内蒙阿拉善盟阿拉善左旗25m4w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗26m5w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗27m6w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗28m7w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗29m8w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗30m9w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗31m10w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗32m11w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗33m12w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗34m13w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗35m14w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗36m15w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗37m16w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗38m17w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗39m18w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗40m19c栽培内蒙鄂尔多斯市杭锦旗41m20c栽培内蒙鄂尔多斯市杭锦旗42m21w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗43m22w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗44m23w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗45m24w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗46m25w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗47m26w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗48m27w野生内蒙赤峰市奈曼旗49m28w野生内蒙赤峰市奈曼旗50m29w野生内蒙赤峰市奈曼旗51m30w野生内蒙赤峰市奈曼旗52m31w野生内蒙赤峰市熬汉旗53m32w野生内蒙赤峰市熬汉旗54m33w野生内蒙赤峰市熬汉旗55m34w野生内蒙赤峰市熬汉旗56m35w野生内蒙赤峰市荣生堂饮片厂57m36w野生内蒙赤峰市荣生堂饮片厂58m37w野生内蒙赤峰市荣生堂饮片厂59m38w野生内蒙赤峰市荣生堂饮片厂60m39w野生内蒙赤峰市荣生堂饮片厂61m40w野生内蒙赤峰市荣生堂饮片厂62m41c栽培内蒙通辽市扎鲁特旗63m42w野生内蒙通辽市扎鲁特旗64n1c栽培宁夏吴忠市同心县65n2c栽培宁夏吴忠市同心县66n3w野生宁夏吴忠市盐池县67n4w野生宁夏吴忠市盐池县68n5w野生宁夏吴忠市盐池县69n6w野生宁夏吴忠市盐池县70n7w野生宁夏吴忠市同心县71n8w野生宁夏吴忠市盐池县72n9c栽培宁夏吴忠市盐池县73n10c栽培宁夏吴忠市盐池县74n11c栽培宁夏吴忠市盐池县75n12c栽培宁夏吴忠市盐池县76n13c栽培宁夏吴忠市盐池县77n14c栽培宁夏吴忠市盐池县78n15c栽培宁夏吴忠市盐池县79n16c栽培宁夏吴忠市盐池县80n17c栽培宁夏吴忠市盐池县81n18c栽培宁夏吴忠市盐池县82n19c栽培宁夏吴忠市盐池县83n20c栽培宁夏吴忠市盐池县84n21c栽培宁夏吴忠市盐池县85n22w野生宁夏吴忠市盐池县86n23w野生宁夏吴忠市盐池县87n24w野生宁夏吴忠市盐池县88n25w野生宁夏吴忠市盐池县89n26w野生宁夏固原市隆德县90x1w野生新疆阿克苏区91x2w野生新疆阿勒泰市福海县92x3w野生新疆塔城市额敏县93x4w野生新疆塔城市额敏县94x5w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县95x6w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县96x7w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县97x8w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县98x9w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县99x10w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县100x11w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州库尔勒焉耆县101x12w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州库尔勒焉耆县102x13c栽培新疆巴音郭楞蒙古自治州和硕县103x14w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和硕县104x15w野生新疆伊犁哈萨克自治州新源县105x16w野生新疆伊犁哈萨克自治州新源县106g20c栽培甘肃白银市景泰县107g21c栽培甘肃酒泉市瓜州县108g22c栽培甘肃酒泉市瓜州县109g23c栽培甘肃酒泉市瓜州县110g24c栽培甘肃酒泉市瓜州县111g25w野生甘肃张掖市高台县112g26w野生甘肃酒泉市玉门市113g27w野生甘肃天水市甘谷县114g28c栽培甘肃张掖市甘州区115g29c栽培甘肃兰州市永登县116g30w野生甘肃酒泉金塔县117m43w野生内蒙阿拉善盟阿拉善左旗118m44w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗119m45w野生内蒙鄂尔多斯市杭锦旗120m47c栽培内蒙通辽市扎鲁特旗121m48w野生内蒙通辽市扎鲁特旗122m49c栽培内蒙通辽市扎鲁特旗123n27c栽培宁夏吴忠市盐池县124n28c栽培宁夏吴忠市盐池县125n29w野生宁夏吴忠市盐池县126n30w野生宁夏固原市隆德县127x17w野生新疆阿勒泰市福海县128x18w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州和静县129x19w野生新疆巴音郭楞蒙古自治州库尔勒焉耆县130x20w野生新疆伊犁哈萨克自治州新源县其中，序号1-105为建模集样本批次，序号106-130为验证集样本批次。s102、扫描获取特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉的近红外光谱图：分别称取105批特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉各1g，利用brukermatrix-f型傅里叶近红外光谱仪扫描各样本近红外光谱。分辨率8cm-1；样品累积扫描次数32scans；背景累积扫描次数32scans；光谱范围12000～4000cm-1；每个样品平行测定6次，取平均值作为该样品的原始光谱。s103、利用聚类分析方法建立特定基原野生甘草模型及栽培甘草模型定性鉴别分析标准模型：将测得的各批次特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉近红外光谱数据导入opus5.5软件，采用一阶导数和矢量归一化预处理方式，对各批次特定基原野生甘草模型药材粉及栽培甘草模型药材粉近红外光谱进行预处理后，设置平滑点为13，采用opus5.5软件进行聚类分析，特定基原野生甘草模型及栽培甘草模型分别聚类，建立近红外定性鉴别分析标准模型，保存，备用。如图1所示，不同基原野生和栽培甘草模型药材的近红外光谱可以明显的聚为两类，说明可以用近红外光谱建立定性鉴别分析模型来区分不同基原的野生及栽培甘草。s104、供试品分析：取供试品，粉碎，过180目筛，称取1g，用傅利叶变换近红外光谱仪扫描获得近红外光谱，将测得的近红外光谱数据按步骤sa3方法处理，进行聚类分析，参照已保存的定性鉴别分析标准模型判定供试品的基原及生长条件。s105、模型准确度评价：利用opus5.5软件，基于已建立的不同基原的野生及栽培甘草近红外定性鉴别分析标准模型，取130批样本中的剩余25批已知基原及生长条件，且未参与建立近红外定性鉴别分析标准模型的甘草药材作为验证样本，通过扫描近红外光谱，结合聚类结果及其真实来源进行分析，评价标准模型的准确率。结果显示，基于已建立的不同基原的野生及栽培甘草近红外定性鉴别分析标准模型，25批已知基原及生长条件，且未参与建立近红外定性鉴别分析标准模型的甘草药材通过近红外光谱聚类分析均能正确鉴别，准确度为100%。如图2及图3所示，分别列示了基于定性鉴别分析标准模型对甘肃产野生甘草glycyrrhizauralensisfisch.的干燥根和根茎验证样本g30w及内蒙产栽培甘草glycyrrhizauralensisfisc.的干燥根和根茎验证样本m47c的定性鉴别图谱。其中，图2左起第一个为验证样本g30w的图谱，图3左起第一个为验证样本m47c的图谱。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非用以限制本发明的权利范围。任何以本申请专利范围所涵盖的权利范围实施的技术方案，或者任何熟悉本领域的技术人员，利用上述揭示的方法内容做出许多可能的变动和修饰的方案，均属于本发明的保护范围。当前第1页12