非结合胆红素的荧光探针的开发和应用的制作方法

本申请是国际申请号pct/us2012/052395，国际申请日2012年08月24日，中国申请号201280041789.4，发明名称为“非结合胆红素的荧光探针的开发和应用”的专利申请的分案申请。相关申请的交叉参考本申请要求于2011年8月26日提交的美国临时申请号61/527,849的优先权，所述申请通过引用结合在本文中。关于联邦资助的研究和开发的声明本工作部分是由全国卫生研究所的r33dk070314号roadmap基金和r44dk073535号sbir基金支持的。因此，美国政府可以对本发明具有特定的权益。涉及序列表在说明书的最后包含序列表。发明领域本发明的领域涉及非结合胆红素的探针的鉴定和应用，所述探针为荧光标记的蛋白，在与胆红素结合时产生荧光指标的改变，并且所述探针用于测量非结合胆红素的水平。在确定非结合胆红素的水平的流体中通常存在的其他分析物的存在下，这些探针不显著结合或者进行显著的荧光改变。这些非结合胆红素的探针可以用于诊断和治疗高胆红素血症(hyperbilirubinemia)和导致高胆红素血症的疾病。发明背景胆红素是血红蛋白周转的产物，其在水中溶解性差，并且因此主要与血浆中的白蛋白缔合。然而，少部分总血浆胆红素在水相中是可溶的。该非结合或游离的级分能够透过血脑屏障，并且在升高的水平是有神经毒性的[ahlforsce，wennbergrp，ostrowjdandtiribellic.unbound(free)bilirubin：improvingtheparadigmforevaluatingneonataljaundice(非结合(游离)胆红素：改进评估新生儿黄疸的范例).clinchem(临床化学)55：1288-1299，2009]。在正常条件下，总血清胆红素通过在胆红素产生和分泌之间的调节的平衡维持在低水平。然而，在新生儿中，调节机制可能还没有充分成熟，使得产生-分泌平衡通常偏向累积，这在约60％的新生儿中产生黄疸(jaundice)的黄色[maiselsmj和mcdonaghaf.phototherapyforneonataljaundice(新生儿黄疸的光疗法).nengljmed(新英格兰医药杂志)358：920-928，2008]。在大部分情形中，这种不平衡是良性的，或者实际上可能是有益的，并且对于大部分的新生儿能够自然解决[wennbergrp，ahlforsce，bhutanivk，johnsonlh和shapirosm.towardunderstandingkernicterus：achallengetoimprovethemanagementofjaundicednewborns(了解核黄疸：改善患黄疸病新生儿的管理的挑战).pediatrics(儿科学)117：474-485，2006；gopinathanv，millernj，milnerad和rice-evansca.bilirubinandascorbateantioxidantactivityinneonatalplasma(新生儿血浆中的胆红素和抗坏血酸抗氧化剂活性).febslett(febs通信)349：197-200，1994]。然而，非结合胆红素的浓度可能升高至有神经毒性的水平，导致从可逆的听力缺陷到更严重的核黄疸神经学后遗症(sequelaeofkernicterus)范围内的缺陷，其在极少数情形中包括死亡[ahlforsce，wennbergrp，ostrowjd和tiribellic.unbound(free)bilirubin：improvingtheparadigmforevaluatingneonataljaundice(非结合(游离)胆红素：改进评估新生儿黄疸的范例).clinchem(临床化学)55：1288-1299，2009]。使用光疗法或交换输血的早期干预能够治疗新生儿中的胆红素介导的神经毒性[maiselsmj和mcdonaghaf.phototherapyforneonataljaundice(用于新生儿黄疸的光疗法).nengljmed(新英格兰医学杂志)358：920-928，2008；morrisbh，ohw，tysonje，stevensondk，phelpsdl，o′sheatm，mcdavidge，perrittrl，vanmeurskp，vohrbr，grisbyc，yaoq，pedrozac，dasa，poolewk，carlowa，duaras，laptookar，salhabwa，shankarans，poindexterbb，fanaroffaa，walshmc，rasmussenmr，stollbj，cottencm，donovanef，ehrenkranzra，guilletr和higginsrd.aggressivevs.conservativephototherapyforinfantswithextremelylowbirthweight(用于出生体重极低的婴儿的强化光疗法与保守光疗法).nengljmed(新英格兰医学杂志)359：1885-1896，2008；kuzniewiczmw，escobargj和newmantbimpactofuniversalbilirubinscreeningonseverehyperbilirubinemiaandphototherapyuse(普遍的胆红素筛查对严重的高胆红素血症和光疗法应用的影响).pediatrics(儿科学)124：1031-1039，2009]。干预的指导主要取决于总胆红素水平，也考虑孕龄和危险因素[bhutanivk，johnsonl和sivieriem.predictiveabilityofapredischargehour-specificserumbilirubinforsubsequentsignificanthyperbilirubinemiainhealthytermandnear-termnewborns(分娩前小时特异性的血清胆红素对于足月新生儿和接近足月新生儿中后继的显著的高胆红素血症的预测能力).pediatrics(儿科学)103：6-14，1999]。然而，基础尘化和增加的临床证据预测，更准确地，应该是非结合胆红素而不是总胆红素与胆红素介导的神经毒性相关[ahlforsce，wennbergrp，ostrowjdandtiribellic.unbound(free)bilirubin：improvingtheparadigmforevaluatingneonataljaundice(非结合(游离)胆红素：改进评估新生儿黄疸的范例).clinchem(临床化学)55：1288-1299，2009；wennbergrp，ahlforsce和aravkinay.interventionguidelinesforneonatalhyperbilirubinemia：anevidencebasedquagmire(新生儿高胆红素血症的干预指导：有据可依的困境).currpharmdes(当代药物设计)15：2939-2945，2009；ahlforsce，aminsb和parkerae.unboundbilirubinpredictsabnormalautomatedauditorybrainstemresponseinadiversenewbornpopulation(非结合胆红素预测各种新生儿群体中的异常的自动听觉脑干反应).jperinatol(胎儿医学杂志)29：305-309，2009；ohw，stevensondk，tysonje，morrisbh，ahlforsce，bendergj，wongrj，perrittr，vohrbr，vanmeurskp，vremanhj，dasa，phelpsdl，o′sheatm和higginsrd.influenceofclinicalstatusontheassociationbetweenplasmatotalandunboundbilirubinanddeathoradverseneurodevelopmentaloutcomesinextremelylowbirthweightinfants(临床状态对血浆总的和非结合胆红素与极低体重婴儿中的死亡或严重的神经发育结果之间的相关性的影响).actapaediatr99：673-678，2010]。因此，对于鉴别有胆红素神经毒性风险的新生儿，非结合胆红素应该优于总胆红素[ahlforsce.predictingbilirubinneurotoxicityinjaundicednewborns(在患有黄疸的新生儿中预测的胆红素神经毒性).curropinpediatr(现代儿科学观点)22：129-133，2010]。设计早产儿中的强化光疗法保持总胆红素在5mg/dl以下[morrisbh，ohw，tysonje，stevensondk，phelpsdl，o′sheatm，mcdavidge，perrittrl，vanmeurskp，vohrbr，grisbyc，yaoq，pedrozac，dasa，poolewk，carlowa，duaras，laptookar，salhabwa，shankarans，poindexterbb，fanaroffaa，walshmc，rasmussenmr，stollbj，cottencm，donovanef，ehrenkranzra，guilletr和higginsrd.aggressivevs.conservativephototherapyforinfantswithextremelylowbirthweight(用于出生体重极低的婴儿的强化光疗法与保守光疗法).nengljmed(新英格兰医学杂志)359：1885-1896，2008]。然而，morris等发现对于治疗维持总胆红素低于5mg/dl的患者和维持低于8mg/dl的那些患者，结果(死亡和神经发育损害)没有区别。然而，这些研究者的随访研究发现结果与非结合胆红素充分相关，而不是与总胆红素相关[ohw，stevensondk，tysonje，morrisbh，ahlforsce，bendergj，wongrj，perrittr，vohrbr，vanmeurskp，vremanhj，dasa，phelpsdl，o′sheatm和higginsrd.influenceofclinicalstatusontheassociationbetweenplasmatotalandunboundbilirubinanddeathoradverseneurodevelopmentaloutcomesinextremelylowbirthweightinfants(临床状态对血浆总的和非结合胆红素与极低体重婴儿中的死亡或严重的神经发育结果之间的相关性的影响).actapaediatr99：673-678，2010]。这表明，由于总胆红素的水平不与非结合胆红素(即，胆红素的毒性部分)偶联，因此使用总胆红素来确定何时递送光疗法可能是误导的。总胆红素与非结合胆红素的解偶联可能由显著干扰胆红素与白蛋白结合的分子的存在而引起。例如，即使总胆红素低至1mg/dl，但是通过干扰分子仅置换0.2％的总胆红素将导致非结合胆红素＝34nm。这是超过该水平就认为对足月新生儿有毒的非结合胆红素水平，并且通常认为对于早产儿，低得多的非结合胆红素水平也是有毒的，诸如在morris等的实验中的那些[morrisbh，ohw，tysonje，stevensondk，phelpsdl，o′sheatm，mcdavidge，perrittrl，vanmeurskp，vohrbr，grisbyc，yaoq，pedrozac，dasa，poolewk，carlowa，duaras，laptookar，salhabwa，shankarans，poindexterbb，fanaroffaa，walshmc，rasmussenmr，stollbj，cottencm，donovanef，ehrenkranzra，guilletr和higginsrd.aggressivevs.conservativephototherapyforinfantswithextremelylowbirthweight(用于出生体重极低的婴儿的强化光疗法与保守光疗法).nengljmed(新英格兰医学杂志)359：1885-1896，2008]。多种药物和代谢物能够结合白蛋白，并且结果将胆红素从其在白蛋白上的结合状态置换下来，由此不管总胆红素浓度是否增加，非结合胆红素浓度增加[spearml，stahlge，paulmh，eglerjm，pereiragr和polinra.theeffectof15-hourfatinfusionsofvaryingdosageonbilirubinbindingtoalbumin(不同剂量的15小时脂肪输注对胆红素结合白蛋白的影响).jpenjparenterenteralnutr9：144-147，1985；aminsb.effectoffreefattyacidsonbilirubin-albuminbindingaffinityandunboundbilirubininprematureinfants(游离脂肪酸对早产儿中的胆红素-白蛋白结合亲和力和非结合胆红素的影响).jpenjparenterenteralnutr34：414-420，2010]。特别重要的胆红素置换代谢物是游离脂肪酸(ffa)。ffa一直存在，但是维持在低水平，并且对健康的足月新生儿没有显著影响。然而，在应激条件下，如例如由于败血症(sepsis)，ffa水平可能显著升高[nogueiraac，kawabatav，bisellip，linsmh，valeric，secklerm，hoshinow，juniorlg，bernikmm，deandrademachadojb，martinezmb，lotufopa，caldinieg，martinse，curir和sorianofg.changesinplasmafreefattyacidlevelsinsepticpatientsareassociatedwithcardiacdamageandreductioninheartratevariability(败血症患者中血浆游离脂肪酸水平的改变与心肌损害和心率变异性减少相关).shock(休克)29：342-348，2008]。除了疾病和应激之外，nicu中的早产婴儿由于接受肠胃外营养和油乳剂如产生ffa水平的极大升高[spearml，stahlge，paulmh，eglerjm，pereiragr和polinra.theeffectof15-hourfatinfusionsofvaryingdosageonbilirubinbindingtoalbumin(不同剂量的15小时脂肪输注对胆红素结合白蛋白的影响).jpenjparenterenteralnutr9：144-147，1985；aminsb.effectoffreefattyacidsonbilirubin-albuminbindingaffinityandunboundbilirubininprematureinfants(游离脂肪酸对早产儿中的胆红素-白蛋白结合亲和力和非结合胆红素的影响).jpenjparenterenteralnutr34：414-420，2010]。ffa以与胆红素相似的高亲和力结合白蛋白。与胆红素不同，ffa具有多个高亲和性结合位点，这使得仅当可测部分的白蛋白结合位点被ffa占据时，胆红素置换才能变得明显[spearml，stahlge，paulmh，eglerjm，pereiragr和polinra.theeffectof15-hourfatinfusionsofvaryingdosageonbilirubinbindingtoalbumin(不同剂量的15小时脂肪输注对胆红素结合白蛋白的影响).jpenjparenterenteralnutr9：144-147，1985；aminsb.effectoffreefattyacidsonbilirubin-albuminbindingaffinityandunboundbilirubininprematureinfants(游离脂肪酸对早产儿中的胆红素-白蛋白结合亲和力和非结合胆红素的影响).jpenjparenterenteralnutr34：414-420，2010]。不能容易地预测哪个接受的新生儿将产生足够多量的ffa，原因在于这取决于孕龄，并且可能取决于诸如酶活性、肥胖以及其他因素[spearml，stahlge，paulmh，eglerjm，pereiragr和polinra.theeffectof15-hourfatinfusionsofvaryingdosageonbilirubinbindingtoalbumin(不同剂量的15小时脂肪输注对胆红素结合白蛋白的影响).jpenjparenterenteralnutr9：144-147，1985；aminsb.effectoffreefattyacidsonbilirubin-albuminbindingaffinityandunboundbilirubininprematureinfants(游离脂肪酸对早产儿中的胆红素-白蛋白结合亲和力和非结合胆红素的影响).jpenjparenterenteralnutr34：414-420，2010]。在脂质输注过程中监测非结合ffa的浓度(ffau)是至关重要的，原因在于升高的ffau水平可能引起免疫抑制、心肌损害和心率变异性减少，以及升高水平的非结合胆红素。另外，由于这些代谢物的非结合水平取决于多种患者特异性因素，因此只有通过在输注过程中直接监测非结合胆红素才能鉴别出那些有胆红素神经毒性风险的婴儿。由于通过增加浓度引起的升高的ffa血浆水平产生升高的非结合胆红素浓度，而不改变总胆红素浓度，因此，对于胆红素这是特别正确的。细胞内脂质结合蛋白(intracellularlipidbindingproteins，ilbp)属于低分子量单链多肽家族。存在四个公认的亚家族。亚家族i包含对维生素a衍生物如视黄酸和视黄醇特异性的蛋白。亚家族ii包含具有针对胆酸、类花生酸和血红素的特异性的蛋白。亚家族iii包含肠型脂肪酸结合蛋白(fabps)和亚家族iv包含所有其它类型的脂肪酸结合蛋白[haunerlandnh和spenerf.fattyacid-bindingproteins--insightsfromgeneticmanipulations(脂肪酸结合蛋白-遗传操作观点).proglipidres(脂质研究进展)43：328-349，2004]，包括以低亲和力结合胆红素的fabp[dipietrosm和santomeja.isolation，characterizationandbindingpropertiesoftworatliverfattyacid-bindingproteinisoforms(两种大鼠肝脂肪酸-结合蛋白异构体的分离、表征和结合特性).biochimbiophysacta1478：186-200，2000]。整个家族特征在于共有的三维折叠。不同亚家族的配体结合特性重合得相当多。亚家族i的野生型蛋白[richierigv，ogatart，zimmermanaw，veerkampjh和kleinfeldam.fattyacidbindingproteinsfromdifferenttissuesshowdistinctpatternsoffattyacidinteractions(来自不同组织的脂肪酸结合蛋白表现出不同的脂肪酸相互作用模式).biochemistry(生物化学)39：7197-7204，2000]和亚家族ii的野生型蛋白均与其天然配体一样好地结合脂肪酸。并且，单氨基酸置换能够使亚家族i和ii的蛋白的配体结合特性互换[jakobymg，millerkr，tonerjj，baumana，cheng.l，lie和cistoladp.ligand-proteinelectrostaticinteractionsgovernthespecificityofretinol-andfattyacid-bindingproteins(配体-蛋白静电相互作用调节视黄醇和脂肪酸结合蛋白的特异性).biochemistry(生物化学)32：872-878，1993]。美国专利号5,470,714，u.s.6,444,432，us7,601,510和美国公布2010/0298162通过引用结合在本文中，它们描述了产生探针的方法和用于确定非结合分析物的探针。这些探针使用来自ilbp家族的蛋白的天然形式或突变形式构建而成。如上文所讨论的，该家族包括fabps[banaszakl，wintern，xuz，bernlohrda，cowans和jonesta.lipid-bindingproteinsafamilyoffattyacidandretinoidtransportproteins(脂质-结合蛋白：脂肪酸和类视黄酸转运蛋白家族).advproteinchem(蛋白质化学进展)45：89-151，1994；bernlohrda，simpsonma，hertzelav和banaszaklj.intracellularlipid-bindingproteinsandtheirgenes(细胞内脂质-结合蛋白及其基因).annurevnutr(营养学年度综述)17：277-303，1997]。fabps是分子量约为15kda的细胞内蛋白，并且具有结合位点，所述结合位点在野生型蛋白中结合1或2ffa以及其他的代谢物。发明概述本发明的实施方案涉及高度特异性针对非结合胆红素的探针的鉴定和使用所述探针确定样品中非结合胆红素的浓度的方法，所述样品从简单的水溶液到复杂的生物学样品，包括人的液体(血液，csf，尿液，组织液)，所述方法包括一个或多个下述步骤：使用us7,601,510和us公布2010/0298162的方法和产生放射性胆红素探针的方法，使用第二游离的荧光团或连接在或包埋在固体基底或聚合物如例如蛋白、聚葡聚糖(polydextran)、或聚苯乙烯上的第二荧光团，产生探针，并且校准所述探针，以使用方程(1-3)确定解离常数，鉴定连接探针与固体基底的方法，并且描述所述探针在装置中的特性，并且描述在所述装置中准确和精确确定非结合胆红素水平的方法[要确定的特性包括：与溶液、溶液与固体测量的关系相比，探针解离的作用、白蛋白缓冲、胆红素与珠子而非探针的结合、珠子上的平衡率]，通过组合在限定水溶液中针对一组潜在干扰物的测试和进一步的突变而精制胆红素探针，所述潜在的干扰物包括常见的代谢物、药物、胆红素光致异构体和缀合的胆红素以及其他的突变，以获得与等价于小于1nm非结合胆红素或一些医学上适当水平的其他分析物贡献一致的特异性，通过检测掺加(spiked)了胆红素(以保证针对人血液样品中的非结合胆红素的特异性)的限定的人血浆中的非结合胆红素来测试定量，使用在溶液中的或结合到固体表面上的探针，并且如方程(4和5)的描述计算非结合胆红素浓度。优选的实施方案涉及基于ilbp的探针，所述ilbp诸如对应于包含一个或多个氨基酸置换和荧光团的seqidno：3的脂质结合蛋白。优选地，所述荧光团连接到赖氨酸残基，ilbp的n端氨基酸或连接到半胱氨酸置换上。优选地，所述探针与胆红素结合，但是不显著地与脂肪酸结合。在优选的实施方案中，所述探针包含下述置换：14r，18l，25c，27a，38v，60r，73f，106l，115r，117d，任选地与罗丹明b(bl22p1b11)组合。在另一个优选的实施方案中，所述探针包含下述置换：14r，18l，38v，60r，73f，106c，115r和117d，任选地与罗丹明b(l24p19c7)组合。在优选的实施方案中，所述探针对应seqidno：3的脂质结合蛋白，在选自14，18，23，25，27，31，36，38，55，60，72，73，74，78，102，104，106，115和117的位置具有一个或多个氨基酸置换。在一些优选的实施方案中，所述荧光团连接在位置22，24，25，26，27，29，30，33，54，74，76，97或98处的半胱氨酸置换上。在一些优选的实施方案中，所述荧光团连接在位置22，24，25，26，27，29，30，33，54，74，76，97或98处的赖氨酸置换上。在一些优选的实施方案中，所述探针在位置7r20r46r100r125r和130r(kr6)被置换，更优选地，在位置7r16r20r29r37r46r50r88r92r94r100r125r129r和130r(kr14)被置换。在优选的实施方案中，所述探针包含至少一个接头。所述接头可以是选自下述的一种或多种：acsggg，sagcgg，gggccg，gsggcg，dtagcg，gdcggg，gcsgag，ggdgcg，ssnscg，sdcayg，dtncgg，gsgcsg，gcgcgg，anacgg，ggacgg，gncggg，cggscg，gstscg，dggcsg，atscgg，ascgyg，dgacgg，ggsgsgsgg，gggsgggsgggtgggsgggrradaa，srawrhpqfgg，rafiasrrirrp，rlllrrlrr，riiirrirr，aas，ndn，psntnhnsnsn，shratpntsph及其组合。优选地，多核苷酸模板编码具有可切割的或不可切割的亲和标签的ilbp突变蛋白。更优选地，模板多核苷酸模板编码具有具组氨酸亲和标签的ilbp突变蛋白，并且固体基质包含固定的金属螯合物。在优选的实施方案中，ilbp突变蛋白在小于8的ph(使得所述荧光团优先与半胱氨酸侧链反应)用单个荧光团标记。优选地，所述荧光团是acrylodan，丹酰氮丙啶(danzylaziridine)，4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑酯(ianbde)，4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(ianbda)，德克萨斯红c2-马来酰亚胺，萤光黄碘乙酰胺，alexafluor680马来酰亚胺，kodakx-sight670lss染料，德克萨斯红，c5-溴乙酰胺，alexafluor750c5-马来酰亚胺或bodipy577/618。在第二优选的实施方案中，ilbp突变蛋白在大于8的ph(以使所述荧光团优先与胺如蛋白氨基端或赖氨酸侧链反应)用单个荧光团标记。优选地，所述荧光团是acrylodan或是吸收和发射较长波长的荧光团，如alexafluor染料，bodipy染料，荧光素衍生物，罗丹明衍生物，德克萨斯红，biotiumcf750se，kodakx-sight670lss染料，licorirdye680lt或licorirdye700dx。在备选的优选实施方案中，ilbp突变蛋白用第一荧光团和第二荧光团标记。优选地，一个荧光团是acrylodan，丹酰氮丙啶，4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑酯(ianbde)，或4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(ianbda)。优选地，另一个荧光团是较长波长吸收和发射的荧光团，如alexafluor染料，bodipy，荧光素衍生物，罗丹明衍生物或德克萨斯红。在一些优选的实施方案中，标记包括使半胱氨酸与第一荧光团在低于或等于8的ph下反应；并且使赖氨酸与第二荧光团在大于8的ph下反应。在其他优选实施方案中，标记包括使半胱氨酸与第一荧光团在低于或等于8的ph下反应；并且使ilbp突变蛋白的氨基端与第二荧光团在大于8的ph下反应。在本发明的一些实施方案中，通过向每个ilbp突变蛋白添加接受体蛋白或肽结构域而提供第二荧光团。优选地，所述接受体蛋白或肽结构域选自snap-标签，clip-标签和acp-标签等。在一些实施方案中，文库中的多核苷酸突变体包含编码荧光蛋白的核苷酸片段。优选地，与所述探针的ilbp突变蛋白部分相比，在暴露于胆红素时发射的荧光的强度和/或波长方面，所述接受体蛋白结构域或荧光蛋白具有零强度和/或波长或显著降低的反应。在一些实施方案中，所述第一荧光团连接到赖氨酸置换上，并且所述第二荧光团连接到半胱氨酸置换上，所述置换选自位置22，24，25，26，27，29，30，33，54，74，76，97或98。本发明的实施方案涉及具有标记有第一荧光团和第二荧光团的ilbp突变蛋白的组合物。优选地，所述第二荧光团在溶液中是游离的，或者连接在不与胆红素结合的蛋白上。优选地，第一荧光团和第二荧光团能够在相同的波长激发，并且第一荧光团和第二荧光团的发射波长是不同的。优选地，第二荧光团不受响应胆红素与ilbp突变蛋白结合的影响(不改变其发射)。优选地，第一荧光团是acrylodan，并且第二荧光团选自罗丹明b，nbd，萤光黄，德克萨斯红，bodipy染料和alexafluor染料。更优选地，第一荧光团是licor700dx，并且第二荧光团是，例如，德克萨斯红或alexafluor染料，或bodipy染料。在优选的实施方案中，在两个不同的波长处测量荧光指数比率的改变，并且用来确定非结合胆红素浓度。在优选的实施方案中，与本文所述的探针连接的荧光团的发射强度不受血液成分(诸如胆红素和血红蛋白)的吸光度的影响。在一些实施方案中，第一荧光团连接在半胱氨酸上，并且选自acrylodan，丹酰氮丙啶，4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑酯(ianbde)和4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(ianbda)，第二荧光团选自alexafluor染料，bodipy，荧光素衍生物，罗丹明衍生物和德克萨斯红。在一些实施方案中，第一荧光团连接在赖氨酸上，并且选自acrylodan，biotiumcf750se，kodakx-sight670lss染料，licorir染料680lt和licorir染料700dx，第二荧光团选自alexafluor染料，bodipy，荧光素衍生物，罗丹明衍生物和德克萨斯红。在本文所述的本发明的其他优选实施方案中，第二不同的荧光团提供为在溶液中游离的可溶分子。所述探针响应针对探针的蛋白部分的胆红素结合，具有在两个不同波长测量的荧光指数的比率改变。这允许通过使用不表现出针对胆红素显著反应的第二但是不连接的荧光团将不显示响应于胆红素结合的比率荧光指数改变的探针容易地转换为比率探针(ratioprobe)。第二游离荧光团的发射波长长于或短于第一(蛋白结合的)荧光团，但是这两种荧光团必须具有共有的激发波长。例如，在一些实施方案中，第一(蛋白连接的)荧光团是acrylodan，并且第二的实例包括但不限于罗丹明b，nbd，萤光黄和德克萨斯红，其是在溶液中游离的或连接到或包埋在另一种聚合物或固体基底上。这种安排具有下述优点：游离荧光团的浓度可以进行调节，以使得甚至当第二荧光团的最大激发波长不同于第一荧光团时，两种荧光团的发射强度仍然是相似的。使用不与探针连接的第二不同的荧光团的这种类型的比率探针消除了由另一种荧光团淬灭这两种荧光团中的一种的能量转移的问题，其在当这两种荧光团位于相同的大分子上，如蛋白上时是典型的。在一些实施方案中，第二荧光团与探针上的接受体蛋白或肽结构域连接。优选地，所述接受体蛋白或肽结构域选自snap-标签，clip标签和acp-标签。优选地，所述探针包含下述置换：7r20r46r100r125r和130r(kr6)。更优选地，所述探针包含下述置换：7r16r20r29r37r46r50r88r92r94r100r125r129r和130r(kr14)。在一些实施方案中，对于上述任一种探针，n端mafd可以置换为例如mgifd，mgcfd或mggsatgifd。在一些实施方案中，所述探针包含至少一个接头，如：acsggg，sagcgg，gggccg，gsggcg，dtagcg，gdcggg，gcsgag，ggdgcg，ssnscg，sdcayg，dtncgg，gsgcsg，gcgcgg，anacgg，ggacgg，gncggg，cggscg，gstscg，dggcsg，atscgg，ascgyg，dgacgg，ggsgsgsgg，gggsgggsgggtgggsgggrradaa，srawrhpqfgg，rafiasrrirrp，rlllrrlrr，riiirrirr，aas，ndn，psntnhnsnsn，shratpntsph其组合。本发明的实施方案涉及荧光团连接在半胱氨酸残基上的探针。优选地，所述荧光团选自acrylodan，丹酰氮丙啶，4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑酯(ianbde)，4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(ianbda)，德克萨斯红c2-马来酰亚胺，萤光黄碘乙酰胺，alexafluor680马来酰亚胺，kodakx-sight670lss染料，德克萨斯红c2-马来酰亚胺，德克萨斯红c5-溴乙酰胺，alexafluor750c5-马来酰亚胺和bodipy577/618。本发明的实施方案涉及荧光团连接在赖氨酸残基上的探针。优选地，所述荧光团选自acrylodan，alexafluor染料，bodipy，荧光素衍生物，罗丹明衍生物，德克萨斯红，biotiumcf750se，kodakx-sight670lss染料，licorirdye680lt和licorirdye700dx。在一些实施方案中，上述任一种探针可以在探针的c或n端包含两个以上的标签，以及用以与固体支持物连接的一个或多个接头。在优选的实施方案中，所述探针包含在位置25的li-cor700dx标记的赖氨酸。在一些优选的实施方案中，所述探针使用两个his-标签和两个接头连接在固体支持物上。在一些优选的实施方案中，所述探针包含一个或多个标签，优选地，所述标签选自his-标签和ps-标签。本发明的实施方案涉及包含一个或多个上文所述的探针的组合物。其他优选的实施方案包括连接在固体基底上的胆红素探针，所述固体基底包括但不限于，聚苯乙烯或胶乳珠，并且所述珠子可以固定在表面上。使用这样固定的颗粒的实例包括但不限于粘附在用于高通量测量的多孔板的底表面上或在一次性微流体装置的通道中。设计成固定在表面上的胆红素探针的实例包括通过与半胱氨酸或赖氨酸(表8的前两个基团)的化学反应与固体支持物表面上的适当的基团连接的探针以及通过非共价相互作用(表8的第三个基团和实施例6和7)连接的探针。另外，第二荧光团可以连接到或包埋在固体支持物表面中，由此使这两种荧光团分开，从而消除能量转移，并且由此获得针对胆红素结合的比率反应(ratioresponse)。另外，第二荧光团可以与另一种蛋白(如ilbp)连接，或与另一种类型的不与胆红素结合或反应的聚合物(如葡聚糖)连接。本发明的实施方案涉及包括连接到固体基底上的上述任一种探针的固体基底。优选地，所述固体基底为聚苯乙烯或胶乳珠，ni-琼脂糖珠，任选地具有铁核，和/或微流体装置或多孔板。选择连接到固体基底上的探针可以包含上述任一种单独的修饰或组合，包括但不限于，n端修饰，接头和表面赖氨酸置换(kr6和kr14)。在优选的实施方案中，探针被加标签以与固体基底连接。在优选的实施方案中，标签包括下述中的一种或多种：his-标签，生物素，flag-表位，c-myc表位，ha-标签，谷胱甘肽-s-转移酶(gst)，麦芽糖结合蛋白(mbp)，壳多糖结合结构域(cbd)，硫氧还蛋白，β-半乳糖苷酶，vsv-糖蛋白，钙调蛋白结合蛋白，聚苯乙烯(ps)疏水性标签和金属亲和标签。在一些实施方案中，所述固体基底包括第二荧光团。第二荧光团可以连接到不与胆红素结合的蛋白上。优选的实施方案涉及一种固体基底，其中探针具有标签，并且所述固体基底包括针对所述标签的受体。优选地，所述标签是聚组氨酸标签，并且所述固体基底包括固定的金属螯合物。本发明的实施方案涉及具有被荧光染料标记的单个半胱氨酸或赖氨酸的ilbp突变蛋白。优选地，在半胱氨酸/赖氨酸标记条件下具有荧光标记活性的任意表面赖氨酸或任意其他半胱氨酸被替换为另一种氨基酸，优选替换为丙氨酸或精氨酸。在使用对应seqidno：3的ilbp突变蛋白模板的优选实施方案中，位置27的赖氨酸是高度反应性的，并且被突变，典型地突变为丙氨酸。在优选的实施方案中，胆红素与诸如白蛋白、脂质结合蛋白、脂质小泡或环糊精的载体大分子复合。胆红素与所述载体大分子的复合缓冲非结合胆红素的浓度，这提供非结合胆红素水平的钳制(clamping)。在优选的实施方案中，所述载体大分子是白蛋白。在其他优选的实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白，其具有的针对胆红素的亲和力大于例如牛血清白蛋白，并且，因此，在一些实施方案中是更优选的白蛋白缓冲剂。在一些实施方案中，胆红素吸光度与胆红素探针的荧光团的激发波长重合，并且在小杯中进行校准，其中径长d足够大，足以使得内滤吸光度(innerfilterabsorbance)是显著的。在这种情形中，所以荧光团的发射强度必须针对针对胆红素探针滴定数据拟合校准方程之前或在用方程4或5确定游离的(非结合)胆红素浓度[bf]时在激发波长以及可能的在发射波长的胆红素吸光度的内滤吸光度进行校正。用于校正的发射强度的方程为：其中iλem是在波长λem的测量的荧光发射强度，bt是总胆红素浓度，∈(λex)是在激发或发射波长(λex)的胆红素消光系数，d是小杯的径长。由于方程(1)表示内滤校正需要知晓总胆红素浓度(bt)，为了确定[bf]也必须测量总胆红素浓度。内滤激发校正对于单个荧光团、非比率胆红素探针是重要的，对于其使用方程(2)进行校准。本发明的实施方案涉及校准胆红素探针的方法，所述方法通过将所述探针与胆红素水性样品混合，测量荧光，并且通过用下述方程1和2或3拟合由所测量的荧光确定校准参数：其中iλem是减去空白的样品中的探针的荧光强度，io是不存在胆红素时探针的强度，pt是总胆红素探针浓度，bt是总胆红素浓度，r是测量的荧光比率((iλ1/iλ2)，其中iλ1是第一荧光团在波长λ1的荧光强度，iλ2是第二荧光团在波长λ2的荧光强度，ro是不存在胆红素时的比率，r是不存在第二荧光团时探针的iλ2/iλ1比率，kd是解离常数。本发明的实施方案涉及测量游离胆红素[bf]浓度的方法，所述方法按照下述步骤的组合进行，其包括任选地测量样品的荧光，将探针与样品混合，并且测量荧光，任选地，从样品与探针的荧光减去样品(的荧光)，并且由测量的荧光确定[bf]浓度。在优选的实施方案中，使用下述方程4-6中的至少一个来校准探针和/或测量[bf]：其中，iλem是减去空白的样品中的探针的荧光强度，io是不存在胆红素时探针的强度，r是测量的荧光比率((iλ1/iλ2)，其中iλ1是第一荧光团在波长λ1的荧光强度，iλ2是第二荧光团在波长λ2的荧光强度，ro是不存在胆红素时的比率，r是不存在第二荧光团时探针的iλ2/iλ1比率，kd是解离常数，并且is是胆红素饱和时探针的发射强度。在一些实施方案中，所述探针具有两个荧光团或将具有一个荧光团的探针与第二荧光团组合，所述第二荧光团在溶液中是游离的或连接到不与胆红素结合的聚合物(如蛋白)上。在一些实施方案中，具有与胆红素结合或反应的一个荧光团的探针连接在固体基底上，并且第二荧光团连接另一种蛋白，所述另一种蛋白也连接在固体基底上，但是不与胆红素结合或反应。在一些实施方案中，所述探针具有单个的荧光团，并且所述方法包括一个或多个校正内滤激发的步骤。在优选的实施方案中，样品包含针对胆红素的载体大分子，如白蛋白，脂质结合蛋白，脂质小泡或环糊精。在一些实施方案中，所述探针连接在固体支持物上。在一些优选的实施方案中，微流体允许测量未稀释的血液样品。优选地，所述样品是来自于人、动物或植物的。在优选的实施方案中，所述样品来自于全血、血浆、血清、尿、csf、唾液、胃液、组织液或淋巴。在一些实施方案中，样品来自接受油乳剂静脉内输注的患者。在一些实施方案中，样品来自由于疾病或应激可能正产生将胆红素从白蛋白上置换下来的分子的患者。在一些实施方案中，样品来自进行光疗法、输液或其他减少胆红素水平的治疗的患者。本发明的实施方案涉及用于测量接受油乳剂静脉内输注的患者的血液样品中非结合ffa的浓度的方法，所述方法通过一个或多个下述步骤进行：任选地，测量样品的荧光，将所述样品与ffau探针混合。测量所述探针的荧光，并且计算ffau浓度。在一些实施方案中，基于ffau浓度确定对患者损害的风险，并且提供处理来预防、治疗或减少所述损害的风险。本发明的实施方案涉及一种试剂盒，所述试剂盒可以包括一个或多个用于收集来自患者的样品的收集装置，一个或多个上述探针，或含有在适当的载体中的一种或多种探针的组合物，以及任选地，包含已知浓度的非结合胆红素的参比标准品。本发明的实施方案涉及在表2，3，4，5，6，7，8和10的任一个中定义的探针。本发明的实施方案涉及确定接受脂肪乳剂的患者中的非结合胆红素和/或非结合ffa毒性的风险的方法，所述方法包括一个或多个下述步骤：获得来自所述患者的样品，使所述样品接触一种或多种探针，如adifab2，l19cp10c7，l138p1h8n24c，l22p5e11，l61p8b12，l4bp4b9和l119p3e5，从而确定一种或多种ffau的水平，确定非结合胆红素的水平，并且将ffau和非结合胆红素的水平与由正常群体获得的水平相比较，从而确定毒性的风险。本发明的实施方案涉及包括探针(如ilbp)的固体基底，其中脂质结合蛋白对应于具有一个或多个氨基酸置换和荧光团的seqidno：3。优选地，所述荧光团连接在赖氨酸残基，ilbp的n端氨基基团，或半胱氨酸置换上。优选地，所述探针结合脂肪酸，并且连接在固体基底上，优选地，所述固体基底是聚苯乙烯或胶乳珠，ni-琼脂糖珠，任选地具有铁核，微流体装置或多孔板。在优选的实施方案中，连接在固体基底上的探针具有修饰的n端，其中所述探针的mafd被置换为mgifd，mgcfd或mggsatgifd。优选地，连接在固体基底上的探针具有表面赖氨酸修饰，诸如置换7r20r46r100r125r和130r(kr6)，更优选地，置换7r16r20r29r37r46r50r88r92r94r100r125r129r和130r(krl4)。在优选的实施方案中，连接在固体基底上的探针包含至少一个接头，如：acsggg，sagcgg，gggccg，gsggcg，dtagcg，gdcggg，gcsgag，ggdgcg，ssnscg，sdcayg，dtncgg，gsgcsg，gcgcgg，anacgg，ggacgg，gncggg，cggscg，gstscg，dggcsg，atscgg，ascgyg，dgacgg，ggsgsgsgg，gggsgggsgggtgggsgggrradaa，srawrhpqfgg，rafiasrrirrp，rlllrrlrr，riiirrirr，aas，ndn，psntnhnsnsn，shratpntsph及其组合。在优选的实施方案中，连接在固体基底上的探针被加标签用于与固体基底连接。优选地，所述标签包括下述中的一种或多种：his-标签，生物素，flag-表位，c-myc表位，ha-标签，谷胱甘肽-s-转移酶(gst)，麦芽糖结合蛋白(mbp)，壳多糖结合结构域(cbd)，硫氧还蛋白，β-半乳糖苷酶，vsv-糖蛋白，钙调蛋白结合蛋白，聚苯乙烯(ps)疏水性标签和金属亲和标签。在一些优选的实施方案中，所述固体基底包括第二荧光团，所述第二荧光团任选地连接到不与ffau结合的蛋白上。在优选的实施方案中，连接到固体基底上的探针包含标签，并且所述固体基底具有针对所述标签的受体。优选地，所述标签是聚组氨酸标签，并且所述固体基底包括固定的金属螯合物。本发明的其他方面、特征和优点通过随后优选实施方案的详述而变得清楚。附图简述现在将参考优选实施方案的附图来描述本发明的这些和其他特征，所述优选实施方案旨在举例说明，并不限制本发明。图1a显示针对探针l24p19c7的i525/i0相对于胆红素浓度。图1b显示在存在和不存在胆红素(3μm)时针对探针l24p19c7的测量的游离胆红素浓度[bf]相对于油酸酯浓度。图1c显示针对探针l24p19c7的游离的胆红素浓度[bf]相对于添加的胆红素的增加的浓度。图2显示针对探针l24p19c7-xc的i525/i0相对于胆红素浓度，其中xc表示用acrylodan标记的不同的单个半胱氨酸位置。图3显示掺加的(spiked)成人血清中的结果。显示针对探针bl22p1b11的i525/i0相对于添加的胆红素的增加的浓度。图4显示通过用增加的总胆红素测量i525/i575比率进行的bl22p1b11-rh探针校准。用方程(3)拟合滴定曲线用来确定kd。图5显示与未缀合的胆红素的结合(kd＝16nm)相比，二牛磺酸胆红素(kd＝300nm)(缀合的胆红素的一种模型)与胆红素探针bl22p1b11-rh的结合弱约19倍。图6显示bl22p1b11-rh监测非结合胆红素随着胆红素暴露于460nm辐照的减少。这暗示bl22p1b11-rh对在460nm辐射时产生的胆红素的光氧化产物和光致异构体的存在不敏感，并且因此提供准确监测用于治疗胆红素毒性的光疗法的有效性的方法。图7显示使用bl22p1b11-rh进行的[bf]测量，在10x10mm小杯在fluorolog3(jyhoriba)(◆)或在ffaumeter(ffasciences)(○)，其通过用集中在525和580nm的发射滤光器替代发射滤光器而被改进。[bf]测量还使用[jacobsenj和wennbergrp.determinationofunboundbilirubinintheserumofnewborns(确定新生儿血清中的非结合胆红素).clinchem(临床化学)20：783，1974]的过氧化物酶方法在相同的样品上进行(▲)。结果表明所有3次测量的几乎相同的结果以及对单个人白蛋白位点的胆红素结合的测量的结果和预测的结果的良好的一致性，其中kd＝20nm。图8显示针对固定在ni-琼脂糖珠子上的探针ps19-1的胆红素淬灭结果，所述ni-琼脂糖珠子固定在一组设计用于荧光测量的微通道一次性盒的“孔”中。向所述盒中加入20μl未稀释的掺加胆红素的成人血浆样品，并且使用方程(5)将非结合胆红素的dx700荧光的淬灭与数据拟合，从而确定kd。图9显示通过随增加的总胆红素测量i525/i615比率进行的bl22p1b11-葡聚糖-德克萨斯红探针的校准。使用方程(3)拟合滴定曲线用来确定kd。优选实施方案详述尽管所述的实施方案代表本发明的优选实施方案，但是应该理解，本领域技术人员能够在不背离本发明的精神的前提下修改所述方法。为了本公开内容的目的，“分析物”是分子量约为2000da以下的分子，并且非结合分析物是在水溶液中的这些分子。这些包括在人或动物的生理或病理过程中天然存在的代谢物和生理学重要的分子，乙基药物分子及其代谢产物和营养分子及其代谢产物。取决于其溶解性，每种分析物的一部分作为单体存在于水溶液中(带电荷的或中性的)。这部分称为“游离的或非结合分析物”部分，并且包括非结合代谢物(metu)。为了本公开内容的目的，胆红素是未缀合的胆红素ixα[mcdonaghaf，vremanhj，wongrj和stevensondk.photoisomers：obfuscatingfactorsinclinicalperoxidasemeasurementsofunboundbilirubin(光致异构体：非结合胆红素的临床过氧化物酶测量中的迷惑因素)？pediatrics(儿科学)123：67-76，2009]。非结合胆红素是所述未缀合的胆红素ixα的水性单体，这与在血浆中通常发现是与白蛋白结合的胆红素不同。为了本公开内容的目的，术语“脂质”理解为具有其常用和常规的意思，并且限定在有机溶剂中最可溶但在水相中具有某种水平的溶解性(非结合部分)的化学化合物。因此，“脂质结合蛋白”包括能够与脂质结合的任意蛋白，其中脂质如本文定义。非结合分子(诸如例如胆红素，脂质，包括脂肪酸，激素和代谢产物)的水平当在适当的人或动物液体中测量时能够提供诊断健康和疾病的信息。日益明显的是，确定所述分子的非结合(也称为‘水相’或‘游离的’)浓度提供关于生理内稳定的重要信息。多种代谢物是具有低水相溶解性的疏水性分子，其非结合浓度要比其“总体”浓度低得多，其中“总体”中的大部分可能与蛋白或细胞结合。在生物流体中，通常调节非结合分子的浓度，以在正常生理条件下维持相对恒定的非结合浓度。这种调节通过所述分子与载体蛋白(诸如例如，白蛋白)的相互作用而发生。因此，大部分的分子通常结合在白蛋白或其他载体上。然而，少部分的分子可能从白蛋白上解离下来(并且重新结合到其上)进入水相中，并且这些就是所述非结合分子。为了本公开内容的目的，“胆红素探针”是在一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基处被荧光标记且当与胆红素结合时进行荧光指数改变的ilbps。胆红素探针也可以是这样的ilbp，即，在半胱氨酸残基用一种荧光团荧光标记并且在不同残基处(优选赖氨酸)用不同的荧光团荧光标记的ilbp，以使得如果在结合胆红素时只有一种荧光团的荧光改变，则在2种波长处的荧光指数的比率将不同。胆红素探针还可以包含在半胱氨酸或赖氨酸残基处用由第二荧光团提供的另外的荧光进行荧光标记的ilbp，所述第二荧光团不与探针蛋白连接。在这种情形中，如果在结合胆红素时只有一种荧光团的荧光改变，则在2种波长处的荧光指数的比率将不同。第二荧光团可以是在水溶液游离的荧光分子或可以连接到不与胆红素反应和/或结合的更大的分子(如ilbp)上，或者第二荧光团可以连接到表面上，或与第二荧光团连接的非反应性分子可以连接在表面上。所述探针可以用来特异性确定非结合胆红素的水相浓度，否则，由于其在水溶液中的溶解性特性差，并且由于存在其他代谢物，尤其是游离的脂肪酸，这是难以进行的。荧光反应比率的变化对于准确确定非结合胆红素的细胞内浓度特别重要，并且对于提高确定非结合胆红素的细胞外浓度的准确性和精确性是重要的。不幸的是，除了蛋白结构和与目的配体的共同复合物结构的可用性之外，分子理论领域的现有状态不足以从头设计具有任意需要的代谢物特异性和敏感性的探针。因此，典型地需要广泛的实验才能发现不仅以理想的特异性结合而且产生指示配体结合的需要的信号改变的突变蛋白探针。筛选甚至单个蛋白针对胆红素的结合亲和力和针对一定范围的另外的分析物的特异性需要大量时间用于蛋白纯化，开发测量不同分析物的结合的方法和测量每种分析物的结合等温线。[由于通常不具有荧光标记的突变蛋白在分析物结合时不引发可测量的信号，所以突变蛋白的系统性高通量筛选是不可能的]。当表征蛋白-分析物相互作用时，需要另外的实验进行荧光团反应化学和探针荧光反应表征。此外，通常，分析物-蛋白结合特性不同于分析物-探针相互作用的特性。因此，使用蛋白开发的、在广泛的实验之后发现具有理想的针对胆红素的特异性的探针在胆红素结合时可能不产生显著的荧光改变。相反，所需要的是快速产生和筛选数以千计得到的突变体探针的方法。美国专利7,601,510和美国公布2010/0298162，其通过引用结合在本文中，和[huberah，kampfjp，kwant，zhub和kleinfeldam.fattyacid-specificfluorescentprobesandtheiruseinresolvingmixturesofdifferentunboundfreefattyacidsinequilibriumwithalbumin(脂肪酸-特异性荧光探针及其以与白蛋白的平衡解析不同非结合脂肪酸的混合物的应用).biochemistry(生物化学)45：14263-14274，2006]描述了用于高通量产生探针的方法，所述方法允许开发具有高特异性的用于确定非结合分析物的探针。美国专利7,601,510和美国公布2010/0298162描述了胆红素特异性探针的开发。本发明涉及对美国专利7,601,510和美国公布2010/0298162中所述的胆红素技术的重大改进，其提高确定非结合胆红素水平的准确性和精确性，并且允许所述技术用于不同的仪器形式。重要的是，美国专利7,601,510和美国公布2010/0298162中所述的这些早前的胆红素探针不是比率探针。本发明涉及产生比率探针的新方法，通过使用不与连接了第一荧光团的胆红素敏感探针连接的第二荧光团进行。本发明还涉及胆红素对长波长探针的令人惊讶的淬灭。另外，本发明涉及将胆红素和ffau探针连接到固体表面的方法和在微流体装置和一次性样品盒中使用所述组合物测量非结合胆红素和ffau的方法。胆红素探针用于确定血液样品中的非结合胆红素水平，脂肪酸是血液中最丰富的代谢物，其具有与胆红素相似的特性。脂肪酸与胆红素竞争与白蛋白的结合并且具有与胆红素相似的非结合浓度。由通常具有高脂肪酸亲和力的ilbp突变蛋白起始开发胆红素探针。因此，从ilbp突变蛋白探针中发现胆红素探针的第一步是用多至11种最丰富的脂肪酸来筛选多于300,000种此类探针，以鉴定不显著与脂肪酸反应的探针。通过δr/δradifab2(美国专利7,601,510)＜0.1已经鉴定了超过10,000种此类脂肪酸不响应剂(“不响应剂文库”)。这种定量基准显示，这些探针针对脂肪酸的亲和力通常比adifab2参比探针小至少10倍。用胆红素筛选这些非响应剂探针鉴定了潜在的胆红素探针和/或模板，所述模板用于通过进一步诱变新鉴定的模板蛋白而产生新的突变蛋白探针文库。筛选这一新文库对脂肪酸和胆红素的反应，并且将鉴定的针对胆红素的反应性最大且针对脂肪酸的反应性最小的探针鉴定为胆红素探针或者可以用于更多轮数的诱变和筛选。通过这些方法鉴定的胆红素探针具有有用的特性，包括针对胆红素的显著反应，并且进一步表征了针对脂肪酸的零至低的反应性。不与ffa显著反应的探针意指对ffa的结合比对胆红素的结合小10倍。优选地，对ffa的结合比对胆红素的结合小100倍。这包括校准以确定探针的胆红素结合亲和力和荧光特征，以及监测含有胆红素和人血清白蛋白的水溶液中的非结合胆红素水平，从而鉴定与脂肪酸的潜在的竞争。可以产生非反应性探针，其中脂肪酸与探针结合但是不产生荧光的改变。在这一情形中，血液样品中的脂肪酸可能与胆红素竞争与所述探针的结合，由此导致对非结合胆红素水平的不准确的确定。通过确定加入脂肪酸是否改变胆红素探针加胆红素的荧光反应来评价与脂肪酸的竞争。通过上述方法发现的胆红素探针在具有胆红素和白蛋白的溶液中产生准确的胆红素浓度，并且不表现出可检测到的脂肪酸竞争，被选来用于人血液样品中的进一步的检测。使用来自个体供体的血浆样品以及商业来源的汇集样品来确定所述胆红素探针是否提供具有基本上未知水平的通常存在于人血液样品中的分析物的样品中的准确的血浆非结合胆红素浓度。这是这样实现的：通过确定每份样品中的白蛋白浓度，并且用胆红素滴定血液样品以获得充分定义的胆红素：白蛋白比率。然后，用所述探针检测非结合胆红素的浓度，并且将结果与下述比较：a)在具有相同的胆红素：白蛋白比率的水性胆红素-白蛋白溶液中测量的非结合胆红素浓度，和b)利用过氧化物酶测定确定的非结合胆红素浓度[jacobsenj和wennbergrp.determinationofunboundbilirubinintheserumofnewborns(确定新生儿血清中的非结合胆红素).clinchem(临床化学)20：783，1974]。探针确定的血浆非结合胆红素浓度与在胆红素-白蛋白溶液中确定的和利用过氧化物酶测定确定的那些结果的等价性证实非结合胆红素之外的血液成分对探针的性能没有可检测的影响。美国专利7,601,510和美国公布2010/0298162的一个重要的方面是其允许忽略之前必需的且非常费时的表征胆红素与蛋白结合的步骤；只表征探针本身。这是重要的，不仅是为了避免蛋白表征步骤，而且是因为通常不能从配体-蛋白结合特征来预测探针的特性。例如，不同蛋白可能具有非常相似的结合亲和力，但是其衍生的探针的荧光反应可能非常不同。之前描述的胆红素探针只用acrylodan标记，主要是在seq3：的赖氨酸27标记(美国专利7,601,510)。另外的胆红素探针用两种不同的荧光团标记，即，在seq3：的赖氨酸27的acrylodan和在n端mgcfd加合物的半胱氨酸的德克萨斯红马来酰亚胺，有两种版本：一种不具有kr14突变，另一种具有kr14突变(“kr14”是一种缩写，表示在seq3中的下述14个表面赖氨酸突变成精氨酸：7r16r20r29r37r46r50r88r92r94r100r125r)，所述kr14突变减少了多个acrylodan标记(u.s公布2010/0298162)。这些探针针对胆红素具有良好的亲和力和反应，并且不受人血液样品中的非胆红素代谢物的显著影响。然而，仅有acrylodan的探针可能受具有高胆红素浓度(在严重的新生儿高胆红素血症中的情形)的样品中的胆红素-介导的激发内滤的不利影响[bhutanivk和johnsonl.thejaundicednewbornintheemergencydepartment：preventionofkernicterus(急救室中的患黄疸的新生儿：核黄疸的预防).clinpedemergmed(临床儿科急救医学)9：149-159，2008]，并且受到血液样品中存在血红蛋白的不利影响。用acrylodan加较长波长的荧光团(如德克萨斯红)双重标记的探针，由于在acrylodan和第二荧光团之间的能量转移，能够极大地减少了acrylodan荧光强度。为了克服这些不足和可以使用胆红素探针的仪器的谱图程度，本发明描述了用于确定非结合胆红素水平的新的探针和新的测定形式。鉴定新的突变蛋白文库，其中由胆红素淬灭的荧光团标记单个半胱氨酸或赖氨酸侧链，并且发现该侧链的位置对于优化胆红素结合时的荧光改变是重要的。还鉴定了这样的胆红素探针，其中由胆红素淬灭的荧光团标记一个或多个半胱氨酸或赖氨酸侧链，但是发现一个侧链的位置对于优化胆红素结合时的荧光改变是重要的。还发现了胆红素可淬灭的荧光团，所述荧光团在长波长吸收和发射，此时应不发生型能量转移的胆红素淬灭。胆红素结合产生几乎完全的acrylodan和其他荧光团的淬灭，其发射发生在约380nm-550nm的范围内，这是可预期的，因为由acrylodan和其他荧光团的发射与胆红素吸光度的大量重合导致的高度的能量转移。完全出乎意料的是胆红素对非常长波长的荧光团的荧光淬灭，包括延长到红外线的那些荧光团(表5和7)。由于其长波长吸光度和荧光，所述荧光团不受胆红素或血红蛋白吸光度或几乎是可能存在于血液样品中的任意其他生色团的吸光度的影响。此处所述的本发明另外的实施方案是产生胆红素比率探针的方法，所述胆红素比率探针用在蛋白上的单个荧光团和用第二不同的荧光团产生，所述第二不同的荧光团：(a)在溶液中是游离的，(b)连接在不与胆红素反应和/或不与胆红素结合的较大的分子上，如聚合物，(c)包埋在树脂或聚合物中，或(d)直接或间接地连接在表面上。这样的探针响应与探针的蛋白部分的胆红素结合，在两个不同的波长测量的荧光指数的比率改变。通过使用第二但是不连接的荧光团(其不显示与胆红素的显著反应)，这允许将不显示响应胆红素结合的比率荧光指数变化的探针容易地转变成比率探针。这种类型的比率探针，一种使用独立的第二荧光团，消除了当两种荧光团位于相同的大分子(如蛋白)上时典型地观察到的荧光团之间的能量转移淬灭问题。这种淬灭极大地减少信号强度，并且由此降低非结合胆红素浓度测量的准确性和精确性。这种能量转移的避免通过不将两种荧光团连接到同一个探针分子上而实现。另外，当第二荧光团连接在同一个小蛋白上时，能量转移的避免需要通过在空间上限制所述荧光团而实现。还描述了可以连接在固体基底(如聚苯乙烯或胶乳珠)上并且所述珠子可以固定在表面上的用在一次性微流体装置中的胆红素探针。另外，第二荧光团可以连接在珠子上或包埋在珠子中，由此将两种荧光团分开，从而消除能量转移，并且由此获得针对针对胆红素结合的比率性反应。备选地，第二荧光团可以连接到ilbp上或不与胆红素反应和/或不与胆红素结合的任意其他聚合物上，并且所述ilbp或其他聚合物连接在固体基底上，使得这两种荧光团保持充分分开，以致能量转移不显著。还描述了用于校准和使用胆红素探针的分析/数学方法。校准胆红素探针来确定与需要知晓非结合胆红素浓度的样品相对应的条件下(诸如温度、ph和溶液组成)针对胆红素的结合亲和力(解离常数kd)。通过测量胆红素探针响应增加的胆红素浓度的荧光变化(滴定数据)在水溶液中进行结合等温线。用适当的方程(“校准方程”)拟合每个胆红素浓度的荧光反应组，所述方程将荧光反应正确描述为胆红素浓度、探针浓度、特异性光谱特征和kd的函数。在一些实施方案中，胆红素吸光度与胆红素探针的荧光团的激发波长重合，并且在小杯中进行校准，在所述小杯中，径长d足够大足以使内滤吸光度是显著的。在这种情形中，在拟合校准方程与胆红素探针的滴定数据之前，必须针对在激发波长以及可能地在发射波长的胆红素吸光度的内滤吸光度校正荧光团的发射强度。用于校正的发射强度的方程为：其中iλem是在波长λem的测量的荧光发射强度，bt是总胆红素浓度，∈(λex)是在激发或发射波长(λex)的胆红素消光系数，d是小杯径长。由于方程(1)表示内滤校正需要知晓总胆红素浓度(bt)，为了确定[bf]也必须测量总胆红素浓度。内滤激发校正对于单个荧光团、非比率胆红素探针是重要的，用于其的校准方程为：其中iλem是减去空白的样品(无胆红素探针的样品)中的探针的荧光强度，并且如果内滤吸光度是显著的，则必须用方程(1)的替代方程(2)中的iλem，io是不存在胆红素时探针的强度，pt是总胆红素探针浓度，bt是总胆红素浓度。内滤激发校正对于单个荧光探针是重要的，但是不影响比率胆红素探针的反应，其通过在两个波长λ1和λ2处的荧光发射比率(iλ1/iλ2)的变化响应胆红素。所述比率或r值等于iλ1/iλ2。通过下述校准方程(3)充分描述胆红素滴定比率探针来确定kd：其中r是测量的荧光比率(iλ1/iλ2)，ro是不存在胆红素时的比率，r是不存在第二荧光团时探针的iλ2/iλ1比率，bt，pt和kd同方程(2)。在通过hsa结合平衡缓冲[bf]的样品中确定游离的胆红素浓度([bf])，并且因此不受胆红素探针的存在的干扰。下述方程分别用于单个(4)荧光团和比率(5)探针：和本发明的优选实施方案涉及能够用来确定非结合分析物的浓度的荧光蛋白分子的开发。更具体地，本发明涉及：1)鉴定通过美国专利7,601，510和美国公布2010/0298162的方法产生的胆红素探针，其通过引用结合在本文中，并且还描述了这些方法的改进，2)所述探针用于临床医学和基础科学的应用，3)这些探针用于确定不同流体中非结合胆红素浓度的实例。胆红素探针是已经通过共价添加一个或多个荧光分子(荧光团)而被‘标记’的ilbp蛋白，所述荧光分子在结合胆红素时表现出荧光指数的改变。在优选的实施方案中，所述探针包含单个半胱氨酸或单个可及的赖氨酸，在其上共价连接荧光团。在其他优选的实施方案中，所述探针包含连接在半胱氨酸上的一个荧光团和连接在与胆红素结合的蛋白上的不同位点，优选是赖氨酸位点上的第二荧光团。在其他优选的实施方案中，所述探针包含连接在半胱氨酸上的一个荧光团和连接在与胆红素结合的蛋白上的不同位点，优选是末端氨基基团上的第二荧光团。在一些实施方案中，使用两种不同的荧光团，优选地连接在半胱氨酸或赖氨酸上，或连接在半胱氨酸和n端氨基基团上。这两种荧光团中的一种响应胆红素结合，即，当胆红素与探针结合时表现出荧光指数的改变。第二荧光团可以对胆红素结合敏感，但是不必要第二荧光团也响应胆红素的结合。第二荧光团提供参比点，以便在胆红素结合时观察到在两个不同波长处的荧光比率的差异。第二荧光团可以不与胆红素结合反应或者可以以与第一荧光团不同的方式反应。优选地，相对于第一荧光团，第二荧光团具有在不同波长的发射点。按照本发明可以用作第二荧光团的化学染料的实例包括，但不限于，alexafluor染料，bodipy染料，荧光素衍生物，罗丹明衍生物和德克萨斯红。在优选的实施方案中，第二荧光团是德克萨斯红。在一些实施方案中，使用两种不同的荧光团，其中一种荧光团连接在半胱氨酸或赖氨酸或n端氨基基团上，并且该荧光团响应胆红素结合，即，当胆红素与荧光标记的ilbp突变蛋白结合时表现出荧光指数的改变。第二荧光团不与ilbp突变蛋白化学连接，并且对与ilbp突变蛋白的胆红素结合不敏感。第二荧光团提供参比点，以使得在胆红素结合时观察到在两个不同波长处的荧光比率的差异。在一个实施方案中，第二荧光团是可溶的，并且以荧光标记的ilbp突变蛋白与第二可溶荧光团的确定的化学计量与荧光标记的ilbp突变蛋白混合物在一起。该混合物可以保持在溶液中或干燥或冻干，然后在需要时重建。该混合物组成通过在两种不同波长处的荧光比率的差异而响应的胆红素探针。由于第二较长波长荧光团的吸光度光谱可以与第一较短波长荧光团的发射重合，所以具有可溶的第二荧光团的这种构型的胆红素探针是有利的。当二者化学连接在同一个ilbp蛋白上时，这可以显著地淬灭第一荧光团的荧光，并且由此降低探针反应的信号质量。另一个优点在于，与取决于第一和第二荧光团与ilbp突变蛋白的两个分开的化学反应的化学计量相比，第一与第二荧光团的化学计量更容易调节并且制备更简单。优选地，相对于第一荧光团，第二荧光团在较长的波长处具有发射点。可以用作第一荧光团的化学染料的实例包括，但不限于，acrylodan，丹酰氮丙啶，4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基]-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑酯(ianbde)或4-[n-[(2-碘乙酰氧)乙基]-n-甲基氨基-7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(ianbda)。按照本发明可以用作第二荧光团的化学染料的实例包括，但不限于，alexafluor染料，bodipy染料，荧光素衍生物，罗丹明衍生物和德克萨斯红。在优选的实施方案中，第一荧光团是在半胱氨酸或赖氨酸处acrylodan标记的，并且第二荧光团是罗丹明b。备选地，所述蛋白可以被“加标签”，以使其以高亲和力与固体支持物结合。这包括，但不限于，用下述进行标记：生物素，flag-表位或c-myc表位或ha-标签，谷胱甘肽-s-转移酶(gst)，麦芽糖结合蛋白(mbp)，壳多糖结合结构域(cbd)，硫氧还蛋白，β-半乳糖苷酶，vsv-糖蛋白，钙调蛋白结合蛋白，聚苯乙烯(ps)疏水性标签或金属亲和标签，如6xhis标签。亲和标签与固体支持物材料的特异性缔合促进在平面表面构型中的非结合胆红素测量，所述平面表面构型包括，但不限于，多孔板和微流体装置。由于其连接在固体支持物上，所述探针可以集中在限制性的有效的二维区域中。这允许测量在样品溶液的薄层(允许流过探针)中的非结合胆红素，所述薄层限制有效的二维区域。这有效地允许前表面荧光测量，其减少由胆红素和血红蛋白导致的荧光，并且促进在全血中的测量。这种构型还允许通过使样品连续流过二维限定的探针而重复的、样品与洗液推注(washbolus)的交替、或连续测量非结合胆红素的可能性。亲和标签可以融合在nh2-或cooh-末端或同时融合在两个末端，例如如在表8中所示。在优选的实施方案中，6x组氨酸标签融合在fabpnh2-或cooh-末端或同时融合在两个末端，而没有显著改变所述蛋白的胆红素结合特性。在优选的实施方案中，融合蛋白由在探针cooh末端的两个分开的组氨酸区域组成。此外，在优选的实施方案中，所述探针固定在固体支持物上，包括但不限于，有或无铁核的ni-聚苯乙烯珠。铁核促进在多孔板、微流体丛(microfluidicgrove)或与来自有效的二维区域的荧光测量相容的其他装置的有效的二维区域中磁力集中探针-珠子。在一些实施方案中，固定在固体支持物蛋白上的胆红素探针是两种用不同荧光团标记的蛋白的组合，所述两种不同荧光团在相同的波长激发但是在两种不同的波长发射。两种蛋白中的一种响应胆红素结合，即，其在胆红素与所述蛋白结合时表现出荧光指数的改变。用不同荧光团标记的第二蛋白可以对胆红素结合敏感，但是第二蛋白不必要响应胆红素的结合。第二蛋白的荧光团提供参比点，从而在胆红素结合时观察到在两种不同波长处的荧光比率的差异。在优选的实施方案中，第一胆红素敏感的蛋白用700dx标记，并且第二胆红素不敏感蛋白用德克萨斯红、bodipy染料或alexafluor染料标记。使用探针在本发明优选的实施方案中，用于确定非结合胆红素的样品是来源于人、动物或植物的流体样品。优选地，所述流体是全血、血浆、血清、尿、csf、唾液、胃液、组织液或淋巴。在其他实施方案中，通过将所述探针显微注射或另外转染到细胞中在细胞的细胞质中进行非结合胆红素的确定，或者在细胞的胞外介质中进行。由健康群体确定非结合胆红素的正常范围，并且偏离该正常范围可能指示疾病。校准非结合胆红素探针，并且用于利用方程1-5测量[bf]，如在[huberah，zhub，kwant，kampfjp，hegyit和kleinfeldam.fluorescencesensorforthequantificationofunboundbilirubinconcentrations(用于定量非结合胆红素浓度的荧光传感器).clinchem(临床化学)58：869-876，2012]中所述。非结合胆红素探针用于测量有风险患有胆红素介导的毒性的患者中的[bf]，诸如60％的新生儿，他们的肝功能不足以清除过量的胆红素[maiselsmj和mcdonaghaf.phototherapyforneonataljaundice(用于新生儿黄疸的光疗法).nengljmed(新英格兰医学杂志)358：920-928，2008]。非结合胆红素探针用于测量接受油乳剂静脉内输注的患者中以及在患有由于降低胆红素针对白蛋白的结合亲和性而能够增加[bf]的疾病的患者中的[bf]，所述疾病如败血症(sepsis)，其在早产的新生儿中常见并且增加ffa水平[nogueiraac，kawabatav，bisellip，linsmh，valeric，secklerm，hoshinow，juniorlg，bernikmm，deandrademachadojb，martinezmb，lotufopa，caldinieg，martinse，curir和sorianofg.changesinplasmafreefattyacidlevelsinsepticpatientsareassociatedwithcardiacdamageandreductioninheartratevariability(败血症患者中血浆游离脂肪酸水平的改变与心肌损害和心率变异性减少有关).shock29：342-348，2008]。非结合胆红素探针用于测量接受光疗法、输血或其他设计降低胆红素毒性的治疗的患者中的[bf]。由于不是总胆红素而是非结合胆红素是毒性的，所以在光疗法过程中应该监测非结合胆红素而非总胆红素，以确保非结合胆红素显著减少。尽管已经表明总胆红素响应光疗法而减少，但是，在存在胆红素置换分子如ffa时，总胆红素和非结合胆红素可以几乎完全被解偶联。在这些条件下，可能需要总胆红素的几乎完全的破坏，以将非结合胆红素水平降至认为无毒性的水平。因此，可能需要这样的总胆红素水平，所述总胆红素水平要比目前甚至对于强化治疗获得的水平低得多。并且，在光疗法过程中不能利用过氧化物酶测定来监测非结合胆红素，原因在于这种检测不能区分光合产物(和缀合的胆红素)与“天然的”未缀合的ix-α异构体。相反，用本申请所述探针测量的非结合胆红素对于天然未缀合的ix-α来说是特异的。目前用于确定非结合胆红素的唯一的方法是基于胆红素的辣根过氧化物酶氧化[jacobsenj和wennbergrp.determinationofunboundbilirubinintheserumofnewborns.(确定新生儿血清中的非结合胆红素).clinchem(临床化学)20：783，1974]。使用fda核准的仪器(arrowsltd，osaka，日本)实施所述过氧化物酶测定是可行的。由于使得非结合胆红素的准确确定变得复杂化的arrows方法的问题，采用这种方法进行黄疸新生儿的一般筛查已经受到限制[ahlforsce.measurementofplasmaunboundunconjugatedbilirubin(血浆非结合非缀合的胆红素的测量).analbiochem(分析生物化学)279：130-135，2000；ahlforsce，vremanhj，wongrj，bendergj，ohw，morrisbh和stevensondk.effectsofsampledilution，peroxidaseconcentration，andchlorideiononthemeasurementofunboundbilirubininprematurenewborns(样品稀释、过氧化物酶浓度和氯离子对早产新生儿中的非结合胆红素的测量的影响).clinbiochem(临床生物化学)40：261-267，2007]。最重要的是，多的、相对大的样品体积，需要测量来确定平衡的非结合胆红素浓度，并且对于干扰物和样品稀释液需要使用arrows法进行校正。本发明的实施方案提供一种新的用于测量非结合胆红素的方法，所述方法克服过氧化物酶-arrows方法的缺点。这种新方法使用允许直接监测平衡的非结合胆红素浓度的荧光标记的脂肪酸结合蛋白(非结合胆红素探针)。所述探针特异性针对未缀合的胆红素并且以高亲和力结合胆红素。并且，非结合胆红素探针对非结合胆红素是高度特异性的，并且不与血液中存在的游离的脂肪酸(ffa)、其他代谢物和药物显著反应或不与其显著结合。所述非结合胆红素探针用于确定黄疸患者中的非结合胆红素水平，所述患者包括诊断有潜在的胆红素神经毒性的新生儿，并且由此准确地指导治疗，以预防此类毒性的后果。实施例下述定义参照seqidno：3。“kr6”是指下述6个表面赖氨酸突变为精氨酸：7r20r46r100r125r130r。“kr14”是指下述14个表面赖氨酸突变为精氨酸：7r16r20r29r37r46r50r88r92r94r100r125r129r130r。“mgi”是指mafd的野生型nh2-末端序列突变为mgifd。在每种情形中，n端甲硫氨酸被细胞去除从而产生成熟的蛋白。“mgcfd”是指mafd的野生型nh2-末端序列突变为mgcfd。在每种情形中，n端甲硫氨酸被细胞去除从而产生成熟的蛋白。“mggsatgifd”是指mafd的野生型nh2-末端序列突变为mggsatgifd。在每种情形中，n端甲硫氨酸被细胞去除从而产生成熟的蛋白。实施例1l24p19c7胆红素探针来源于大鼠肠脂肪酸结合蛋白(ri-fabp)，如之前在us7,601,510、美国公布2010/0298162和[huberah，zhub，kwant，kampfjp，hegyit和kleinfeldam.fluorescencesensorforthequantificationofunboundbilirubinconcentrations(用于定量非结合胆红素浓度的荧光传感器).clinchem(临床化学)58：869-876，2012；huberah，kampfjp，kwant，zhub和kleinfeldam.fattyacid-specificfluorescentprobesandtheiruseinresolvingmixturesofdifferentunboundfreefattyacidsinequilibriumwithalbumin(脂肪酸特异性荧光探针及其在解析与白蛋白平衡的不同的非结合游离脂肪酸混合物中的应用).biochemistry(生物化学)45：14263-14274，2006]中关于非结合ffa(ffau)探针所述。首先利用组合诱变来产生并筛选响应ffau的突变体探针。在这些探针中，约10％不显著响应ffau，并且进一步筛选其对未缀合的胆红素的响应。从这一筛选选择击中(hits)用于进一步的诱变，以增加其对非结合胆红素的亲和性和选择性。这些方法的结果的实例是acrylodan标记的l24p19c7，相对于seq3，其具有下述突变：14r18l38v60r73f106c115r和117d(表5)。在ph9.3的acrylodan反应主要在k27侧链标记l24p19c7。l24p19c7在22℃用水性胆红素校准，并且通过用方程(5)拟合产生22nm的kd，并且在接近饱和的胆红素浓度几乎完全淬灭(剩余部分强度(qs)＝0.0042)(图1a)。l24p19c7不响应游离的脂肪酸(ffa)。在存在或不存在胆红素的条件下，用非结合油酸酯滴定l24p19c7没有引起其荧光或等价地非结合胆红素浓度的改变(图1b)。图1b中非结合油酸酯(人血浆中最丰富的ffa)的ffa浓度是人血浆中的浓度的10倍高。除了其缺乏对ffa的反应，l24p19c7也不与人血浆中存在的其他代谢物反应。在6份不同的掺加了胆红素的成人血浆样品中测量非结合胆红素表明，在不存在胆红素时，非结合浓度低于1nm，并且非结合胆红素的增加遵循对胆红素和血清白蛋白之间的平衡预测的行为。实施例2l24p19c7-xc合成l24p19c7的突变体，其中在22-30之间的侧链位置置换单个半胱氨酸，以产生具有稳定的、基本上独特的acrylodan标记位点的探针，并且优化胆红素与所述探针的相互作用(图2)。结果表明，胆红素结合的kd在19-89nm的范围内，并且淬灭acrylodan荧光(qs)的程度在约1.7-6％的范围内。使用在位置25或26的半胱氨酸获得最优的探针性能。这证明在已经鉴定了其基本结构后，调整探针性能需要最少的实验。实施例3：bl22p1b11bl22p1b11是一种胆红素探针，其仅用单个荧光团标记，在这种情形中，由于去除了14个表面赖氨酸(kr14)，acrylodan在位置25，赖氨酸在27，并且相对于l24p19c，半胱氨酸在106。因此，相对于seq3，bl22p1b11具有下述结构：mgi-kr14-14r18l25c27a38v60r73f106l115r117d。除了具有独特的单个荧光标记之外，bl22p1b11具有特别大的针对胆红素的亲和力(kd＝16nm)，并且在胆红素饱和所述探针时表现出几乎完全的acrylodan荧光淬灭(qs＝0.006)(图3)。bl22p1b11几乎不具有针对脂肪酸的反应，对于最丰富的ffa的kds在3-75μm的范围内(表1)。还与l24p19c7类似，bl22p1b11仅检测人血浆中的胆红素，并且在掺加胆红素的血浆中，通过bl22p1b11确定的[bf]与由胆红素-白蛋白平衡预测的变化相一致(例如，参见图5)。表1结合bl22p1b11的kdskd(nm)胆红素16二十二碳六烯酸酯22∶6(n-3)4300花生四烯酸酯20∶4(n-6)28600亚麻酸酯18∶3(n-3)3460亚油酸酯18∶2(n-6)3120油酸酯18∶1(n-9)2510硬脂酸酯18∶075500棕榈油酸酯16∶1(n-7)3140棕榈酸酯16∶03200肉豆蔻酸酯14∶023400实施例4：胆红素比率探针bl22p1b11-rh和bl22p1b11-葡聚糖-德克萨斯红bl22p1b11提供水溶液中的准确的[bf]值，所述水溶液包括人血液样品，具有低总胆红素的样品。然而，随着总胆红素浓度增加，由于胆红素引起的激发和发射内滤吸光度可能显著增加(方程(1))，并且因此，不精确知晓总胆红素浓度和吸附几何学(方程(1)中的“d”)，表观[bf]可能是显著错误的。为了克服这种来源的不确定性，并且为了消除确定总胆红素浓度的需要，使用单波长探针的比率形式，如bl22p1b11。这通过添加第二荧光团而实现，所述第二荧光团在与所述单一波长探针相同的波长激发，并且其发射是在与所述单一波长探针不同的波长。对于用acrylodan标记的bl22p1b11，适当的水溶性荧光团是罗丹明b，其能够在与acrylodan相似的波长激发，如在375nm激发，并且其发射显著长于acrylodan，从而罗丹明在575nm发出荧光并且对于在525nm处的acrylodan荧光贡献可忽略。因此，测量强度的1525/i575比率用来确定[bf](方程(5))。由于胆红素激发的内滤吸光度对于acrylodan和罗丹明b是相同的，并且由于i525和i575强度总是作为比率出现，因此，只要胆红素吸光度允许充分的传播(其几乎总是可以通过充分减小径长“d”而实现)，激发内滤吸光度不影响[bf]测量。除了消除胆红素引起的激发内滤吸光度之外，测量525和575nm处的强度比率有效地消除由于血红蛋白和胆红素引起的发射内滤。这种类型的比率探针是通过这样制备的：以确定的分子比率混合bl22p1b11与罗丹明b，然后将混合物冷冻干燥，保存在-20℃以下，或者制备这种类型的比率探针并且作为溶液保存在4℃。在每种情形中，确定ro，即，不存在胆红素时的荧光比率，准确地确定bl22p1b11/罗丹明b分子比率。通过用增加的总胆红素测量i525/i575比率进行bl22p1b11-rh探针探针的校准。用方程(3)拟合滴定曲线用来确定kd，并且图4所示的结果表明bl22p1b11-rh探针的kd(16nm)与bl22p1b11的相同，这表明罗丹明的存在对胆红素-探针相互作用没有影响。比率探针还通过混合bl22p1b11与确定量的德克萨斯红标记的葡聚糖(lifetechnologies，d-3329)而产生。将新的比率探针校准并冻干(图9)，并且在重悬于hepes缓冲液中后校准。通过用增加的总胆红素测量i525/i615比率进行校准。如在图9中观察到的，对于bl22p1b11-葡聚糖德克萨斯红比率探针的kd是16nm，这与对于bl22p1b11和bl22p1b11-rh的相同。因此，第二荧光团可以是溶液中游离的(bl22p1b11-rh)或连接到较大的惰性聚合物上(bl22p1b11-葡聚糖德克萨斯红)，而不显著改变探针-胆红素相互作用。通过测量二牛磺酸胆红素对bl22p1b11-rh的结合亲和力而估测缀合的胆红素对胆红素探针的潜在的干扰。测量通过测量用增加浓度的二牛磺酸胆红素滴定的bl22p1b11-rh的荧光反应的变化进行。对所有浓度计算r-值，并且用方程(3)拟合结合等温线，从而对于二牛磺酸胆红素与bl22p1b11-rh的结合获得301±9nmol/l的kd(图5)。通过用bl22p1b11-rh测量来自已经暴露于460nm的光增加的时间的胆红素溶液的样品中的bf来评估光漂白(光氧化合/或光致异构化)对使用胆红素探针确定bf的影响。bf值使用方程(6)确定。使用测量的r值用方程(6)计算总胆红素浓度(bt)：结果表明bf减少78％(图6)，并且显示bl22p1b11-rh对光氧化或更丰富的光致异构化产物具有很少或者没有敏感性。实施例5：用bl22p1b11-rh测量掺加胆红素的人血浆中的[bf]将汇集的[白蛋白]为620μm的人血浆(goldenwestbiologicals)掺加胆红素，以产生具有约0-0.9的胆红素/白蛋白比率的血浆样品。使用bl22p1b1-rh在fluorolog3(jyhoriba)中用10x10mm小杯或在ffaumeter(ffasciences)中进行[bf]测量，其通过用集中在325和380nm的发射滤光器替代发射滤光器而被改进用于测量非结合胆红素。还使用jacobsen和wennberg的过氧化物酶方法[jacobsenj和wennbergrp.determinationofunboundbilirubinintheserumofnewborns(确定新生儿血清中的非结合胆红素).clinchem(临床化学)20：783，1974]对相同的样品进行[bf]测量。结果表明对于所有3次测量几乎相同的结果和关于胆红素与单个人白蛋白位点的结合的测量结果与预测结果的良好的一致性，kd＝20nm(图7)。这些结果证明胆红素探针的响应完全是由于与胆红素的相互作用，胆红素探针不响应人血液样品中存在的其他代谢物。并且，与过氧化物酶方法和与胆红素-白蛋白平衡预测的一致性还证明所述探针产生准确的非结合胆红素浓度。实施例6：标记珠子的实例，对bf测量的解离和影响产生胆红素探针突变体，用于用alexafluor680和li-cor700dx的标记优化，并且固定在聚苯乙烯或胶乳珠上。突变体来源于胆红素探针，即bl22p1b11，用于用适用于血浆或全血胆红素测定的荧光染料进行标记。在多个标记位置包含单个半胱氨酸的突变体上检测alexafluor680染料，在位置25c的标记在胆红素结合时表现出最大荧光淬灭(～40％)。对于探针固定在聚苯乙烯或胶乳珠上，开发与在位置25c的alexafluor680染料相对处具有单个或多个反应性赖氨酸残基的突变体(表6)。在优选的实施方案中，li-cor700dx(li-corbiosciences)用来标记在多个标记位置包含单个赖氨酸的突变体，并且在位置25k的标记在胆红素结合时表现出最大荧光淬灭(≥60％)(表6)。对于探针固定在聚苯乙烯或胶乳珠上，开发与在位置25k的li-cor700dx染料相对处具有单个或多个反应性半胱氨酸残基的突变体。使用两种基于亲和的方法，双his-标签和ps-标签(聚苯乙烯结合肽)实现固定的进一步改善，以将li-cor700dx-标记的胆红素探针固定在聚苯乙烯或胶乳珠上(表8)。发现一种具有通过由11个氨基酸残基组成的接头(srawrhpqfgg)分开的c端双his-标签的突变体(bl22p1b11_25k_c2x)具有针对ni-偶联的dyna聚苯乙烯或胶乳珠(lifetechnologies)的高结合亲和力和可接受的由胆红素引起的淬灭(～50％)。另一种在其c端在his-标签后紧接着ps-标签(ps19-1，rafiasrrirrp)的突变体(bl22p1b11_25k_ps19)也表现出比具有单一his-标签的模板(bl22p1b11_25k)高的亲和力。产生以高亲和力结合在聚苯乙烯或胶乳珠上的探针的其他ps标签包括ps19-6l(rlllrrlrr)和ps19-6i(riiirrirr)(表8)。此外，bl22p1b11_25k_ps19探针在游离溶液中和在珠子上都表现出最高的胆红素淬灭(＞60％)，这可能是由于另外的ps-标签的存在。这两种探针产生与来自标准荧光计的曲线相似的胆红素淬灭曲线。在一个更优选的实施方案中，通过基于li-cor700dx-标记bl22p1b11_25k_c2x模板构建并筛选接头文库而产生胆红素突变体探针(表8)。新的突变体探针具有更高的蛋白表达；没有多个标记，在n端很少或没有胺标记，较高的探针产量和针对聚苯乙烯或胶乳珠的高亲和力。例如(表4)，在hepes缓冲液中温育60min后，约12％的ps19探针从珠子上解离，如在[huberah，kampfjp，kwant，zhub和kleinfeldam.fattyacid-specificfluorescentprobesandtheiruseinresolvingmixturesofdifferentunboundfreefattyacidsinequilibriumwithalbumin(脂肪酸特异性荧光探针及其在解析与白蛋白平衡的不同的非结合游离脂肪酸混合物中的应用).biochemistry(生物化学)45：14263-14274，2006]中所述。该解离的探针约占总荧光强度的60％(表4)。c2xffa3p1h11探针具有特有的3-氨基酸接头(aas)，所述接头插在bl22p1b11_25k和第一个his-标签之间，并且在第一和第二his-标签之间新的11-氨基酸(shratpntsph)接头替换bl22p1b11_25k_c2x中原始的接头。与ps19和bl22p1b11_25k_c2x相比，两种克隆的检测表现出显著的改善(表2-4)。这两种突变体具有下述特性，使得其成为大规模探针生产和商业化的理想选择：高蛋白表达产率，700dx对n端胺的低反应性或可及性，高探针产率，在标记后用edta～100％从ni-珠子上洗脱下来，与ps19等价或更好的高胆红素淬灭，对于固定在聚苯乙烯或胶乳珠上的探针与在游离的溶液中相同的700dx荧光的探针胆红素淬灭，珠亲和力是ps-19的10倍高(～5％游离的探针强度相对于～60％)和独特的接头和间隔体。在不同的两天进行固定在ni-偶联的dyna聚苯乙烯或胶乳珠上的c2xffa3h11，c2xffa3b3和ps19的时程，并且显示在表2-4中，其中通过胆红素-白蛋白复合物以约0.9的总胆红素/白蛋白调节licor700dx荧光。表2：c2xff3h11-700dx表3c2xffa3b3-700dx表4ps19-1-700dx实施例7：在一次性盒中用固定的胆红素探针测量掺加的血浆探针ps19-1是用licordx700标记的bl22p1b11_25k，并且除了6xhis标签外还在c端具有ps-标签rafiasrrirrp(表8)，将该探针固定在ni-琼脂糖珠上。这些标记的珠子又固定在一组设计用于荧光计测量的微通道一次性盒的“孔”中。将未稀释的20μl掺加胆红素的成人血浆样品添加到该盒中，并且对于样品用增加的[bf]值确定非结合胆红素对dx700荧光的淬灭。这些测量用来确定固定的ps19-1的kd，并且用来评估所述胆红素探针在所述盒中的重复性。由这些测量确定的kd与由游离的bl22p1b11-rh探针获得的值相一致(图8)，这表明固定不影响探针与胆红素-白蛋白相互作用之间的平衡。并且，使用在制备后保存大于2月的盒获得几乎相同的结果。实施例8：单半胱氨酸探针表5：所有的残基号参照模板序列seqid3。表5续：所有的残基号参照模板序列seqid3。实施例9：单荧光标记的赖氨酸探针表6：所有的残基号参照模板序列seqid3。表6续：所有的残基号参照模板序列seqid3。实施例10：二荧光团胆红素探针表7：所有的残基号参照模板序列seqid3。实施例11：固定的胆红素探针表8：所有蛋白均基于seq3，并且因此在c端具有另外的6his标签。n端修饰序列替代模板序列的n端甲硫氨酸(即，序列x由mgifd变为x-gifd)。c端修饰序列替代模板序列的c端六个组氨酸标签(即，序列y由rrdrghhhhhh变为rrdrg-y)。衍生在25k上的荧光团包括表3的acrylodan，biotum，kodakx-sight和licorir染料。表8续：所有蛋白均基于seq3，并且因此在c端具有另外的6his标签。n端修饰序列替代模板序列的n端甲硫氨酸(即，序列x由mgifd变为x-gifd)。c端修饰序列替代模板序列的c端六个组氨酸标签(即，序列y由rrdrghhhhhh变为rrdrg-y)。衍生在25k上的荧光团包括表3的acrylodan，biotum，kodakx-sight和licorir染料。实施例12在从用脂肪乳剂以3-3.5g/kg/天治疗的5名极低出生体重(＜2000g)新生儿获得的血液样品(否则其将被丢弃)中进行非结合胆红素和非结合ffa的测量。使用bl22p1b11-rh在25倍稀释在hepes缓冲液中的血浆样品中进行非结合胆红素测量。在50倍稀释在hepes缓冲液中的血浆中确定ffau浓度，并且如[huberah，kampfjp，kwant，zhub和kleinfeldam.fattyacid-specificfluorescentprobesandtheiruseinresolvingmixturesofdifferentunboundfreefattyacidsinequilibriumwithalbumin(脂肪酸特异性荧光探针及其在解析与白蛋白平衡的不同的非结合游离脂肪酸混合物中的应用).biochemistry(生物化学)45：14263-14274，2006]中所述进行测量。如[huberah，kampfjp，kwant，zhub和kleinfeldam.fattyacid-specificfluorescentprobesandtheiruseinresolvingmixturesofdifferentunboundfreefattyacidsinequilibriumwithalbumin(脂肪酸特异性荧光探针及其在解析与白蛋白平衡的不同的非结合游离脂肪酸混合物中的应用).biochemistry(生物化学)45：14263-14274，2006]中关于ffau所述使用ffaumeter测量荧光强度，并且对于bf，修改相同的计量(meter)用于在525和575nm发射。使用方程(6)由525/575nm荧光比率确定非结合胆红素浓度。如[cantorwj，hoekimh，jollys，moeg，bursteinjm，mendelsohna，kleinfeldam和fitchettd.b-typenatriureticpeptideandserumunboundfreefattyacidlevelsaftercontemporarypercutaneouscoronaryintervention(现代经皮冠状动脉介入治疗干预后b型利钠肽和血清非结合游离脂肪酸水平).journalofinvasivecardiology(介入心脏病学杂志)20：186-188，2008]所述使用adifab2进行非结合ffa的测量。使用[richieri，g和kleinfeld，am，unboundfreefattyacidlevelsinhumanserum(人血清中的非结合游离脂肪酸水平).journaloflipidresearch(脂质研究杂志)36：229-240，1995]的方法对于输注估测ffau种类的分布。表9患者非结合胆红素非结合ffanmnm133352920394127048060053054尽管已知能够增加总ffa并且因此增加非结合胆红素，但是，实施例12的结果证明非结合ffa(ffau)能够以比总ffa大得多的因素增加。该结果是因为总ffa与白蛋白的比率线性增加(在amin的研究中约10倍[aminsb.effectoffreefattyacidsonbilirubin-albuminbindingaffinityandunboundbilirubininprematureinfants(游离脂肪酸对早产婴儿中胆红素-白蛋白结合亲和性和非结合胆红素的影响).jpenjparenterenteralnutr34：414-420，2010])，而ffau在大的ffa：白蛋白比率基本上以指数增加，在表9中大于1000倍。在实施例12中，两名患者具有600和1200nm的ffau水平，而正常水平为1-2nm[applefs，kleinfeldam和adamsje.unboundfreefattyacidconcentrationsareincreasedincardiacischemia(在心肌缺血时非结合游离脂肪酸浓度增加).clinicalproteomics(临床蛋白组学)1：41-44，2004]。在甚至比600nm低得多的水平，许多研究已经证明了ffa(或ffau)的毒性作用，包括心脏毒性，阻断免疫反应以及对多种细胞功能的有害影响[kleinfeldam和okadac.freefattyacidreleasefromhumanbreastcancertissueinhibitscytotoxict-lymphocyte-mediatedkilling(从人乳腺癌组织的游离脂肪酸释放抑制细胞毒性t-淋巴细胞介导的杀伤).jlipidres(脂质研究杂志)46：1983-1990，2005；olivermf.suddencardiacdeath：thelostfattyacidhypothesis(心脏猝死：消失的脂肪酸假说).qjm99：701-709，2006]。只有通过在输注过程中监测ffau水平才能鉴定处于ffau毒性风险的那些婴儿。由产生的主要(＞75％)ffa种类是亚油酸、油酸、棕榈酸和亚麻酸ffa。由于adifab2对硬脂酸最有特异性，对于硬脂酸，仅包含1.5-5.5％，因此，具有针对亚油酸、油酸、棕榈酸和亚麻酸ffa的特异性的ffau探针将提供对由于水解引起的血浆ffau升高的更准确和敏感的检测。已经使用美国专利7,601,510和美国公布2010/0298162以及在[huberah，kampfjp，kwant，zhub和kleinfeldam.fattyacid-specificfluorescentprobesandtheiruseinresolvingmixturesofdifferentunboundfreefattyacidsinequilibriumwithalbumin(脂肪酸特异性荧光探针及其在解析与白蛋白平衡的不同的非结合游离脂肪酸混合物中的应用).biochemistry(生物化学)45：14263-14274，2006]中所述的方法制备了所述ffau探针(表10)。敏感性ffau探针是在滴定早期检测患者中ffau水平升高所必需的，这对于防止非结合胆红素和ffau达到毒性水平是关键的。表10：用于测量治疗的患者中的ffau水平的ffau探针本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的精神的前提下可以进行多种且不同的修改。因此，应该清楚地理解，本发明的形式仅是举例说明的，并且不意欲限制本发明的范围。当前第1页12