本发明涉及咖啡因的检测方法，尤其涉及一种液质联用检测中成药及保健食品中咖啡因的方法。
背景技术：
咖啡因具有促智作用，但其主要用于梅尼埃综合征、血管性头痛及脑动脉硬化，并可用于治疗急性缺血性脑血管疾病，如脑血栓、脑栓塞、一过性脑供血不足等；对高血压所致直立性眩晕、耳鸣等亦有效。但其会产生食欲不振、恶心、呕吐、口干、头痛、心悸、皮炎等副作用。
近年来，随着社会竞争压力的不断增加和老年化社会的扩大，辅助改善记忆类中成药和保健品在消费者中具有相当大的市场。然而一些不法商贩利欲熏心，在保健品中非法添加化学药物，然后再进行非法宣传，从而欺骗群众牟取暴利。多年来，药品监督管理部门从未停止对非法添加的专项整治和打击，但面对巨大的市场诱惑，不法商人仍然铤而走险，偷偷在中成药和保健食品中非法加入西药成分。目前，辅助改善记忆类保健食品可能非法添加药物，其中包括咖啡因，目前用于辅助改善记忆类中药制剂及保健食品非法添加的筛查方法较少，因此有必要对辅助改善记忆类中药制剂及保健食品中是否含有咖啡因进行检测，用来预防和监督辅助改善记忆类中成药及保健食品进入市场后导致的不良事件发生，确保安全性，有必要建立用于辅助改善记忆类中药制剂及保健食品中咖啡因的快速筛查方法。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种液质联用检测中成药及保健食品中咖啡因的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种液质联用检测中成药及保健食品中咖啡因的方法，包括以下步骤：
(1)制备对照品溶液：取咖啡因对照品与甲醇制成对照品溶液；
(2)制备待测样品溶液：取辅助改善记忆类中药制剂及保健食品采用甲醇提取，并将提取所得溶液经净化得待测样品溶液；
(3)取对照品溶液和待测样品溶液上液质联用仪对供试品溶液中的咖啡因进行定性定量测定，其中，
色谱条件：3.0mm×100mm，1.8μm，eclipsexdbc18色谱柱，流速：0.30ml·min-1，柱温：40℃，进样量：1μl；esi正模式：流动相a为0.1％甲酸溶液，流动相b为甲醇；梯度洗脱程序：0～2min，92％a、10％b；2～10min，92％～8％a、8％～92％b；10～13min，10％a、92％b；在90％a、10％b下平衡2min；esi负模式：流动相a为水，流动相b为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5min，85％a、15％b；0.5～3min，85％～10％a、15％～90％b；3～5min，15％a、85％b；在85％a、15％b下平衡2min；
质谱条件：电喷雾离子源(esi)，正负离子模式，多反应监测(mrm)扫描方式：m/z为195.1/136.1，碎裂电压121v，碰撞能18v，保留时间4.5min，干燥气温度：360℃，雾化器压力：40psi，干燥气流速：10l·min–1。
所述步骤(1)中，取咖啡因对照品用甲醇溶解配制成浓度为1mg/ml的咖啡因溶液，然后取0.5ml咖啡因溶液制量瓶中，用甲醇定容至100ml，得到咖啡因对照品溶液。
所述步骤(2)中，根据辅助改善记忆类中药制剂及保健食品的剂型不同配置方法会有所区别，具体如下：
液体制剂的配置方法：精密吸取相当一次口服剂量，置50ml量瓶中，加入20ml50％甲醇水溶液，于1130w，37khz条件下下超声处理15min，放冷，用50％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，取1ml溶液加水稀释10倍，作为供试品溶液待用。
固体制剂的配置方法：取固体制剂供试品研细，精密称取相当于一次口服剂量，置100ml锥形瓶中，精密加入50ml50％甲醇水溶液，称重，于1130w，37khz条件下下超声处理15min，放冷，用50％甲醇水溶液补足重量，取1ml上清液加水稀释10倍，作为供试品溶液待用。
软胶囊制剂的配置方法：精密称取相当于一次口服剂量软胶囊，置100ml锥形瓶中，精密加入50ml50％甲醇水溶液，称重，于1130w，37khz条件下下超声处理15min，放冷，用50％甲醇水溶液补足重量，置于4℃冰箱放置2.5h，将溶液转移至离心管，4000r·min-1离心5min，取1ml上清液加水稀释10倍，作为供试品溶液待用。
所述步骤(2)中，净化过程如下：精密量取供试品溶液1ml以1ml·min-1流速通过活化后的c18-spe柱，用2ml50％甲醇-水洗脱，合并流出液与洗脱液，并定容至5ml，用0.22μm有机滤膜过滤，即得待测样品溶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发名提供了辅助改善记忆类中药制剂及保健食品中咖啡因的液质联用检测方法，该方法采用多反应监测的方式进行检测，干扰少、灵敏度高、检测结果准确。
具体实施方式
实施例1
(1)制备对照品溶液：取咖啡因对照品用甲醇溶解配制成浓度为1mg/ml的咖啡因溶液，然后取1ml咖啡因溶液制量瓶中，用甲醇定容至100ml，得到咖啡因对照品溶液。
(2)制备待测样品溶液：液体制剂的配置方法：精密吸取相当一次口服剂量，置50ml量瓶中，加入20ml50％甲醇水溶液，于1130w，37khz条件下下超声处理15min，放冷，用50％甲醇水溶液定容至刻度，摇匀，取1ml溶液加水稀释10倍，作为供试品溶液待用。
固体制剂的配置方法：取固体制剂供试品研细，精密称取相当于一次口服剂量，置100ml锥形瓶中，精密加入50ml50％甲醇水溶液，称重，于1130w，37khz条件下下超声处理15min，放冷，用50％甲醇水溶液补足重量，取1ml上清液加水稀释10倍，作为供试品溶液待用。
软胶囊制剂的配置方法：精密称取相当于一次口服剂量软胶囊，置100ml锥形瓶中，精密加入50ml50％甲醇水溶液，称重，于1130w，37khz条件下下超声处理15min，放冷，用50％甲醇水溶液补足重量，置于4℃冰箱放置2.5h，将溶液转移至离心管，4000r·min-1离心5min，取1ml上清液加水稀释10倍，作为供试品溶液待用。
净化过程如下：精密量取供试品溶液1ml以1ml·min-1流速通过活化后的c18-spe柱，用2ml50％甲醇-水洗脱，合并流出液与洗脱液，并定容至5ml，用0.22μm有机滤膜过滤，即得待测样品溶液。
(3)取对照品溶液和待测样品溶液上液质联用仪对供试品溶液中的咖啡因进行定性定量测定，其中，
色谱条件：3.0mm×100mm，1.8μm，eclipsexdbc18色谱柱，流速：0.30ml·min-1，柱温：40℃，进样量：1μl；esi正模式：流动相a为0.1％甲酸溶液，流动相b为甲醇；梯度洗脱程序：0～2min，92％a、10％b；2～10min，92％～8％a、8％～92％b；10～13min，10％a、92％b；在90％a、10％b下平衡2min；esi负模式：流动相a为水，流动相b为乙腈；梯度洗脱程序：0～0.5min，85％a、15％b；0.5～3min，85％～10％a、15％～90％b；3～5min，15％a、85％b；在85％a、15％b下平衡2min；
质谱条件：电喷雾离子源(esi)，正负离子模式，多反应监测(mrm)扫描方式：m/z为195.1/136.1，碎裂电压121v，碰撞能18v，保留时间4.5min，干燥气温度：360℃，雾化器压力：40psi，干燥气流速：10l·min–1。
(4)线性关系考察：精密吸取5μg·ml-1咖啡因对照品溶液20，50，80，120，160，200μl，置6个10ml量瓶中，加流动相定容至刻度，摇匀，即得6个浓度水平的混合对照溶液，分别为10，25，40，60，80，100ng·ml-1，各取1μl，按上述步骤(3)的液质联用条件进样分析，平行测定2次，以峰面积(y)对质量浓度(x，ng·ml-1)进行线性回归，得到回归方程y＝52.17x+8.30和相关系数r＝0.9975，表明咖啡因在13.06～136.6ng·ml-1范围内线性关系良好。
(5)检测限将咖啡因对照品溶液逐步稀释后，按上述步骤(3)的液质联用条件测定，按s/n＝3计算各化学成分的检测限为2ng·ml-1。
(6)精密度试验：取咖啡因对照品溶液，浓度为100ng/ml，采用步骤(3)的液质联用条件进样6次，结果咖啡因的峰面积的rsd少于2.5％(n＝6)，说明仪器精密度良好。
(7)稳定性试验：取咖啡因对照品溶液，浓度为100ng/ml，分别在0，1，8，12和24h按照步骤(3)等液质联用条件进样，考察溶液稳定性，结果表明，咖啡因在24h内稳定。
(8)加样回收率试验:取1个咖啡因空白样品，加入咖啡因对照品约50μg，按待测样品溶液制备方法平行制备6份待测样品溶液，按上述步骤(3)的液质联用条件进样并测定回收率。结果显示咖啡因的加样回收率范围为98％～102％，rsd小于5％(n＝6)。
(9)样品测定：共取口服液4批、软胶囊6批，硬胶囊3批和片剂2批，按步骤(2)制备待测样品溶液，按上述步骤(3)液质条件进样检测，结果15批样品中咖啡因均未检出。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不是限制，因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。