本发明涉及食品毒素的检测领域，具体涉及一种河豚毒素的快速检测方法。
背景技术：
河豚体内含有河豚毒素，河豚毒素具有极高毒性，随着河豚及其相关加工产品需求的增加，为确保消费者的食用安全，各检测机构需要在最短的时间内完成大量的检测工作，建立一种河豚毒素的快速检测方法是有必要的。国内外类似的快速检测方法未见报道。
技术实现要素：
为了解决河豚毒素快速检测的问题，本发明提供了一种溶剂萃取后省去固相萃取的前处理步骤、直接上机的测定方法，该方法简单、方便、快捷，回收率高。
本发明所采用的技术方案是：一种河豚毒素的快速检测方法是以乙酸水为提取剂对待测样品进行提取，再用正己烷和乙腈分别除去脂肪和蛋白，然后直接上机测定。
所说的以乙酸水为提取剂进行提取，是以0.1%乙酸水为提取剂与样品混合，进行超声提取、涡旋混合和离心分离，取得离心分离后的清液。
所说的用正己烷和乙腈分别除去脂肪和蛋白，是指上述离心分离后的清液加入正己烷依次进行涡旋混合、离心分离，下层清液为去脂肪清液。去脂肪清液中再加入乙腈，并依次进行涡旋混合、离心分离，上层清液过滤后直接用于液相色谱-质谱进行分析。
本发明将本发明所述的内容，即通过乙酸水萃取-正己烷去脂-乙腈去蛋白的方法去杂质的净化方法（a），与固相萃取小柱-免疫亲和柱（b）、固相萃取小柱-c18小柱（c）、固相萃取小柱-pep小柱（d）去杂质的净化方法的效率进行了对照分析如下。
（a）本发明乙酸水萃取-正己烷去脂-乙腈去蛋白法的对照分析是这样实现的：称取已均质的烤鱼片样品2g于15ml塑料离心管中，在50ml离心管中加入400ng河豚毒素标准物质，静置15min，用移液管移入0.1%乙酸水10ml。依次进行超声、涡旋、离心，时间分别设定10min、3min、3min。取10ml塑料离心管a加入离心后的清液5ml和正己烷2ml，依次进行涡旋、离心，时间分别设定3min、5min。取10ml塑料离心管b加入离心后吸出正己烷的清液和乙腈均1ml，依次进行涡旋、离心，时间分别设定1min、5min。取离心后的清液过0.22μm滤膜，待测。
（b）乙酸水萃取-免疫亲和柱洗脱法的对照分析是这样实现的：称取已均质的烤鱼片样品2g于50ml塑料离心管a中，在50ml离心管中加入400ng河豚毒素标准物质，静置15min，用移液管移入0.1%乙酸水10ml。依次进行超声、涡旋、离心，时间分别设定10min、3min、3min。于50ml塑料离心管b加入经过离心后的清液3.5ml和pbs缓冲溶液14ml，纤维滤纸过滤后，ph调到7左右，取滤液10ml上小柱，弃去流出液，将小柱内溶液完全抽干后，用蒸馏水10ml进行洗涤除去残留杂质。用移液枪移取2ml2%乙酸甲醇作洗脱液，洗脱小柱，将洗脱液进行氮吹（吹至近干）。吸取甲酸溶液（0.1%）-乙腈溶液（1+1）1ml以溶解残留物质，涡旋振荡至混匀，过0.22μm滤膜，待测。
（c）乙酸水萃取-正己烷去脂-c18小柱洗脱-乙腈去蛋白法的对照分析是这样实现的：称取已均质的烤鱼片样品2g于50ml塑料离心管中，在50ml离心管中加入400ng河豚毒素标准物质，静置15min，用移液管移入0.1%乙酸水10ml。依次进行超声、涡旋、离心，时间分别设定10min、3min、3min。取10ml塑料离心管加入离心后的清液5ml和正己烷2ml，依次进行涡旋、离心，时间设定3min、3min。清液吸出正己烷后，全部过小柱。c18小柱的活化：先后加入甲醇和水均5ml对小柱进行活化，后将上述样液全部过小柱，收集样液（弃去最开始流出的1ml样液）。取10ml塑料离心管加入收集样液和乙腈均1ml，依次进行涡旋、离心，时间设定1min、5min。清液过0.22μm滤膜，待测。
（d）乙酸水萃取-正己烷去脂-pep小柱洗脱-乙腈去蛋白法的对照分析是这样实现的：称取已均质的烤鱼片样品2g于50ml塑料离心管中，在50ml离心管中加入400ng河豚毒素标准物质，静置15min，用移液管移入0.1%乙酸水10ml。依次进行超声、涡旋、离心，时间分别设定10min、3min、3min。取10ml塑料离心管加入离心后的清液5ml和正己烷2ml，依次进行涡旋、离心，时间分别设定3min、5min。清液吸出正己烷后，全部过小柱。pep小柱的活化：先后加入甲醇和水均5ml对小柱进行活化，后将上述样液全部过小柱，收集样液（弃去最开始流出的1ml样液）。取10ml塑料离心管中加入收集样液和乙腈均1ml，依次进行涡旋、离心，时间分别设定1min、5min。清液过0.22μm滤膜，待测。
不同净化方法回收率的结果见表1。由表1中数据可知，免疫亲和柱的回收率最高，其它三种方法回收率相当。本发明的内容乙酸水萃取-正己烷去脂和乙腈去蛋白的方法回收62.0%，能满足分析的要求，同时费用低，步骤简单快捷。
表1不同净化方式的回收率
具体实施方式
1.样品前处理方法取15ml离心管1支，10ml离心管2支。在15ml离心管中加入准确称取的2g均质均匀的待测样品，用移液管移入0.1%乙酸水10ml。依次进行超声、涡旋、离心，时间分别设定10min、3min、3min，得到离心清液。取第1只10ml离心管，加入经过离心后的15ml离心管中的离心清液5ml，再加正己烷2ml，依次进行涡旋、离心，时间分别设定3min、5min。取第2只10ml离心管加入第1只10ml离心管经过离心后除去正己烷的清液1ml，再加乙腈1ml,依次进行涡旋、离心，时间分别设定3min、5min，取经离心后清液过0.22μm滤膜，待测。
2.色谱条件的选择根据gb5009.206-2016选用tsk-gelamide-80色谱柱作为分析柱，其保留效果明显，受其他杂质的影响小。河豚毒素的结构比较特殊所以其理化性质也存在特异性，在其结构中的胍基基团易在酸性溶液中质子化。根据这一特点，流动相首选酸性溶液。通过试验得出，当用0.1%甲酸水-乙腈溶液作为流动相时河豚毒素的离子化效率和响应值均明显高于其他的溶液，所以0.1%甲酸水-乙腈溶液是最合适的流动相。河豚毒素标准样品的质谱图如图1所示。
3.提取条件的选择本实验选择0.1%和1%的乙酸水溶液，0.1%和1%的乙酸乙腈溶液，0.1%和1%的乙酸甲醇溶液，以及10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90;10共9种不同比例的0.1%乙酸水与0.1%乙酸甲醇的混合溶液作为提取剂进行提取效率的比较，结果如图2和图3所示。图2为不同0.1%乙酸水与0.1%乙酸甲醇混合液比例对提取效率的影响图。图3为提取试剂对提取效率的影响图。由如图2、3可知，采用乙酸水的效果最好，0.1%和1%两个浓度的乙酸水无明显区别，乙酸乙腈的提取效果最差。0.1%乙酸水与0.1%乙酸甲醇的混合溶液在乙酸水含量较低时，其提取效果也不理想，随着乙酸水的比例增加，提取效率逐渐升高，这是由于在酸性条件下，河豚毒素呈离子态，在水中溶解度增大，导致提取效率增大的缘故，在比例大于4:6时变化几乎不明显。综合考虑试剂的制备与成本等因素本方法最终选择0.1%乙酸水作为提取试剂。
4.基质效应基质效应（me）的公式为me=基质曲线斜率/标准曲线斜率×100%，且计算数值在85%到115%间为无明显的基质效应。按照本发明内容所述的几种净化方法，称取空白样品，制得空白基质样品溶液，利用空白基质样品溶液，配置一系列浓度点，制得基质匹配标准曲线，得到的标准曲线方程和线性关系以及基质效应的计算结果见表2。由表2可以看出河豚毒素经免疫亲和柱提取制得的空白基质样液不存在明显的基质效应，而经c18小柱、pep小柱提取制得的空白基质样液与直接用正己烷去脂、乙腈去蛋白不经小柱净化制得的空白基质样液都存在明显的基质效应。由此，免疫亲和柱对河豚毒素提取净化的效果是最佳的，但是其检测成本较高且检测的效率无法满足大批量检测任务的要求。c18小柱、pep小柱和不经过固相萃取小柱直接用正己烷去脂肪，乙腈去蛋白的基质效应相差不大，表明样液在经过正己烷去脂肪、c18小柱和pep小柱的净化、乙腈去蛋白后效果不明显，因此可以省略固相萃取步骤，可经正己烷去脂、乙腈去蛋白后直接过滤上机。由于其处理后的样液与标准溶液存在明显的基质效应，所以在定量的过程中需要通过基质匹配标准曲线或基质加标曲线定量。采用这样的前处理不但简化前处理的步骤使得效率明显提高，而且降低了检测所需的费用。
5.方法学验证(1)线性测定:通常为了消除基质效应和提取过程中的影响，采用基质加标曲线来进行定量。基质加标曲线绘制：称取7个空白样品，各2g，加入7个浓度点8、20、50、100、200、500和1000ng，按照本发明所述的乙酸水萃取-正己烷去脂-乙腈去蛋白法进行样品预处理后，上机检测，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，绘制河豚毒素基质加标曲线，结果见表3。由表3中数据可知，该方法得到的基质加标曲线线性良好。(2)检出限和定量限:空白烤鱼片样品中加入河豚毒素标准品，按照本发明所述的乙酸水萃取-正己烷去脂-乙腈去蛋白法进行样品预处理后，上机检测。信噪比为3和10时的浓度分别设为检出限和定量限，详细参数见表3。空白烤鱼片样品、检出限和定量限谱图如图4、5、6所示。图4为空白样品液相色谱-质谱图。图5为检出限液相色谱-质谱图。图6为定量限液相色谱-质谱图。由图4可以看出，在空白基质中河豚毒素保留值附近无干扰物质存在。由表3中数据，本方法的检出限为1.2μg/kg，定量限为4μg/kg，与gb5009.206-2016中的检出限为1μg/kg，定量限3μg/kg相当，因此采用该简便方法完全满足检测要求。(3)回收率和精密度:称取均质好的烤鱼片样品2g共称取18份，每6份为一个浓度共3个浓度，按4，8，40μg/kg三个浓度水平进行加标实验。如表4所示平均回收率的范围在96.5%到102.6%之间，相对标准偏差（rsd）为4.2%到5.6%，数据显示本方法的回收率和精密度都具有较高水平，得出的结果可信度也较高。
6.实际样品的测定利用该方法对市售的7份烤鱼片进行了检测，结果发现所有样品中河豚毒素的阳性率为14.3%。有1份烤鱼片检出河豚毒素，河豚毒素的含量11.8μg/kg，一份烤鱼片的阳性样品图如图7所示。图7阳性样品的液相色谱-质谱图。
本发明与传统分析方法的不同之处在于（1）简化了前处理步骤，提高了分析效率，降低了检测成本；（2）方法学验证数据显示本发明所涉及的检测方法回收率和精密度都具有较高水平，能满足分析的要求，得出的结果可信度也较高。
表2基质效应的影响
表3基质效应的影响
表4河豚毒素加标回收率和标准偏差
说明书附图说明
图1为河豚毒素标准样品的质谱图
图2为不同0.1%乙酸水与0.1%乙酸甲醇混合液比例对提取效率的影响图
图3为提取试剂对提取效率的影响图
图4为空白样品液相色谱-质谱图
图5为检出限液相色谱-质谱图
图6为定量限液相色谱-质谱图
图7为阳性样品的液相色谱-质谱图