一种鉴别杨树型蜂胶与杨树胶的方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种鉴别杨树型蜂胶与杨树胶的方法。
背景技术：
：蜂胶是蜜蜂从植物幼芽及树杆上采集来的树脂，并混入自身上腭分泌物和蜂蜡等形成的一种具有芳香味的粘性胶状固形物质，它不仅是蜜蜂封闭整个蜂箱的建筑材料，也是蜜蜂防止外来入侵者的“化学武器”。现代研究发现，蜂胶具有多种生理功能，其包括抗氧化，抑菌，消炎，抗病毒，抗癌、保肝及辅助治疗糖尿病等作用，特别是对于糖尿病的辅助治疗效果显著。目前世界上产量最大的蜂胶是杨树型蜂胶，中国蜂胶也是属于杨树型蜂胶。杨树型蜂胶是蜜蜂采集杨树芽表面分泌的杨树树脂制作而成的。蜜蜂在采集杨树芽表面的树脂的过程中，并不会破坏杨树芽的表皮细胞，不会导致杨树芽内部的成分分泌出来，混入最终的蜂胶之中。杨树胶，则是人为采集杨树树芽，通过人工熬制提取等加工工艺得到的提取物。杨树胶具有同杨树型蜂胶提取物相似的物理性状，如色泽，气味等；而且二者的化学组分也基本一致。因此，杨树胶通常会被造假者冒充蜂胶，或者掺入蜂胶中，进而牟取暴利。杨树胶在制取的过程中，剧烈的提取工艺会破坏杨树芽的表皮细胞，因此会导致杨树芽内部的成分进入最终的杨树胶中。找出杨树型蜂胶和杨树胶的标志性成分，则可解决判断杨树型蜂胶品质的难题。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别蜂胶真伪的方法，所述方法为通过测定9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和/或9-羰基-反,反-共轭亚油酸(9-oxo-ODA)含量，来鉴别蜂胶中是否掺入了杨树胶。所述的9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和9-羰基-反,反-共轭亚油酸(9-oxo-ODA)的化学分子式分别为：优选地，本发明所述鉴别蜂胶真伪的方法中，所述方法为通过检测蜂胶中的9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和/或9-羰基-反,反-共轭亚油酸(9-oxo-ODA)的含量与蜂胶中固有物质的含量之比，来判断所述蜂胶中是否含有杨树胶；优选地，所述蜂胶中固有物质为3,4-二羟基苯甲醛、咖啡酸、香兰素、p-香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、苯甲酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、5-甲氧基短叶松素、槲皮素、山姜素、山奈酚、亚桂皮乙酸、芹菜素、异鼠李素、松属素、咖啡酸苄酯、短叶松素-3-乙酸酯、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、p-香豆酸苄酯、阿魏酸苄酯、咖啡酸肉桂酯、球松素、柚木柯因、p-香豆酸肉桂酯、肉桂酸肉桂酯、4-甲氧基肉桂酸肉桂酯的一种或几种；更优选地，所述固有物质为短叶松素。优选地，本发明所述的鉴别蜂胶真伪的方法中，所述9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和/或9-羰基-反,反-共轭亚油酸(9-oxo-ODA)的含量与短叶松素比值D小于1，则所述蜂胶中不存在杨树胶；比值D大于等于1，则所述蜂胶中含有杨树胶。表1判断标准D值判断D值＜1不含有杨树胶D值≥1含有杨树胶优选地，本发明所述鉴别蜂胶真伪的方法中，所述的蜂胶包含蜂胶毛胶、精制蜂胶或蜂胶制品。优选地，本发明所述鉴别蜂胶真伪的方法中，所述蜂胶毛胶为从蜂箱上直接收集而来，并没有进行任何处理加工的蜂胶；精制蜂胶，为对蜂胶毛胶进行一系列加工处理，纯化得到的蜂胶提取物；蜂胶制品，为在成分表或配料表中标注含有蜂胶的所有产品。优选地，本发明所述鉴别蜂胶真伪的方法中，所述方法还包括以下预处理步骤：①提取液收集：准确称取0.5g蜂胶样品，将其置于干燥容器中，向其中加入5ml的75％食用乙醇；将所得物于40℃、100r/min水浴摇床中提取2h，后40℃超声2h；然后，置于离心机中以400g离心5min，收集获得蜂胶提取液。②上样液制备：取1ml上述蜂胶提取液，向其中加入2ml甲醇，经混匀，过0.22μm滤膜，即得到HPLC上样液。优选地，本发明所述鉴别蜂胶真伪的方法中，所述9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,反-共轭亚油酸(9-oxo-ODA)和短叶松素的检测方法为高效液相色谱法(HPLC)，包括但不仅限于此方法。优选地，本发明所述的高效液相色谱法(HPLC)的色谱条件为：流动相A为水(含0.02％乙酸)；流动相B为甲醇(含0.02％乙酸)；总流速为0.7ml/min；紫外检测波长为280nm；分离柱为C18柱，(150×4.6mm,5μm)；上样体积为10μl；150min梯度洗脱。优选地，本发明所述鉴别蜂胶真伪的方法中，所述9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,反-共轭亚油酸(9-oxo-ODA)和短叶松素的含量的测定采用外标法，包括但不仅限于此方法。优选地，本发明所述鉴别蜂胶真伪的方法中，所述蜂胶为杨树型蜂胶。本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)本发明基于对标志性成分9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和/或9-羰基-反,反-共轭亚油酸(9-oxo-ODA)含量的检测，检测结果准确率高；2)对所检测的样品要求低，适用于几乎所有的样品检测，检测对象范围广；3)检测方法操作方便、稳定性好、安全性高，能够满足广大企业和第三方检测机构的需求，便于推广应用。本发明经过多次验证，检测准确率100％，具有很好的稳定性。上述鉴别蜂胶真伪的方法为真假蜂胶的鉴别提供了一个新的思路，为企业购买蜂胶原材料的品质提供了一个保障，为维护购买蜂胶产品的消费者的合法权益提供了一个保障，同时提高了真蜂胶的价格，从而给广大的蜂农带了直接的经济效益，促进养蜂业的蓬勃发展。附图说明图1为本发明一个实施例的蜂胶固有物质HPLC分析图；图2为本发明一个实施例的蜂胶固有物质HPLC分析图；图3为本发明一个实施例的蜂胶固有物质HPLC分析图；具体实施方式下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1蜂胶毛胶(该蜂胶毛胶为未添加杨树胶的真正蜂胶原料)：购自于中国农业科学院蜜蜂研究所。操作方法：①按预处理方法处理蜂胶毛胶，得到HPLC上样液；②按HPLC方法对上样液进行定性定量分析；如图1所示，其中各个吸收峰的物质分别为1.3,4-二羟基苯甲醛2.咖啡酸3.香兰素4.p-香豆酸5.阿魏酸6.异阿魏酸7.苯甲酸8.3,4-二甲氧基肉桂酸9.肉桂酸10.4-甲氧基肉桂酸11.5-甲氧基短叶松素12.短叶松素13.槲皮素14.山姜素15.山奈酚16.亚桂皮乙酸17.芹菜素18.异鼠李素19.松属素20.咖啡酸苄酯21.短叶松素-3-乙酸酯22.柯因23.咖啡酸苯乙酯24.高良姜素25.p-香豆酸苄酯26.阿魏酸苄酯27.咖啡酸肉桂酯28.球松素29.柚木柯因30.p-香豆酸肉桂酯31.肉桂酸肉桂酯32.4-甲氧基肉桂酸肉桂酯33.9-oxoOLCA34.9-oxoOLCE。③采用外标法确定9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和短叶松素的标准曲线，按照标准曲线进行定量分析，分别获得9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和短叶松素含量值如下；④按照上述表1中D值的计算方法进行计算，D值＝(0.343+1.762)/8.828＜1，即9-oxoOLCA和/或9-oxoOLCE的含量与短叶松素的比值小于1，蜂胶毛胶中未添加杨树胶。实施例2精制蜂胶(该蜂胶精制胶为未添加杨树胶的真正蜂胶原料)：购自于中国农业科学院蜜蜂研究所。操作方法：①按预处理方法处理精制蜂胶，得到HPLC上样液；②按HPLC方法对上样液进行定性定量分析；如图2所示，其中各个吸收峰的物质分别为1.3,4-二羟基苯甲醛2.咖啡酸3.香兰素4.p-香豆酸5.阿魏酸6.异阿魏酸7.苯甲酸8.3,4-二甲氧基肉桂酸9.肉桂酸10.4-甲氧基肉桂酸11.5-甲氧基短叶松素12.短叶松素13.槲皮素14.山姜素15.山奈酚16.亚桂皮乙酸17.芹菜素18.异鼠李素19.松属素20.咖啡酸苄酯21.短叶松素-3-乙酸酯22.柯因23.咖啡酸苯乙酯24.高良姜素25.p-香豆酸苄酯26.阿魏酸苄酯27.咖啡酸肉桂酯28.球松素29.柚木柯因30.p-香豆酸肉桂酯31.肉桂酸肉桂酯32.4-甲氧基肉桂酸肉桂酯33.9-oxoOLCA34.9-oxoOLCE。③采用外标法确定9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和短叶松素的标准曲线，按照标准曲线进行定量分析，分别获得9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和短叶松素含量值如下；④按照上述表1中D值的计算方法进行计算，D值＝(0.293+1.055)/5.802＜1，即9-oxoOLCA和/或9-oxoOLCE的含量与短叶松素的比值小于1，精制蜂胶中未添加杨树胶。实施例3中国农业科学院蜜蜂研究所对采购的某知名企业生产的正规蜂胶制品(未添加杨树胶成分)人为掺入杨树胶后进行检测。操作方法：①按预处理方法处理掺入杨树胶的蜂胶制品，得到HPLC上样液；②按HPLC方法对上样液进行定性定量分析；如图3所示，其中各个吸收峰的物质分别为1.3,4-二羟基苯甲醛2.咖啡酸3.香兰素4.p-香豆酸5.阿魏酸6.异阿魏酸7.苯甲酸8.3,4-二甲氧基肉桂酸9.肉桂酸10.4-甲氧基肉桂酸11.5-甲氧基短叶松素12.短叶松素13.槲皮素14.山姜素15.山奈酚16.亚桂皮乙酸17.芹菜素18.异鼠李素19.松属素20.咖啡酸苄酯21.短叶松素-3-乙酸酯22.柯因23.咖啡酸苯乙酯24.高良姜素25.p-香豆酸苄酯26.阿魏酸苄酯27.咖啡酸肉桂酯28.球松素29.柚木柯因30.p-香豆酸肉桂酯31.肉桂酸肉桂酯32.4-甲氧基肉桂酸肉桂酯33.9-oxoOLCA34.9-oxoOLCE采用外标法确定9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和短叶松素的标准曲线，按照标准曲线进行定量分析，分别获得9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)、9-羰基-反,顺-共轭亚油酸(9-oxo-ODE)和短叶松素含量值如下；④按照上述表1中D值的计算方法进行计算，D值＝(6.95+4.24)/2.52＞1，即9-oxoOLCA和/或9-oxoOLCE的含量与短叶松素的比值大于1，属于添加了杨树胶的蜂胶制品。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3