本发明涉及生物样品含量检测技术领域，具体而言，涉及一种同时测定多种能量物质的方法。
背景技术：
三磷酸腺苷(atp)作为高能磷酸化合物，是体内最重要的可直接利用的能量物质，二磷酸腺苷(adp)、单磷酸腺苷(amp)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)等在atp代谢和其它能量转化过程中作为辅酶发挥关键作用。迅速而准确地测定atp等能量代谢相关物质，对于研究细胞乃至机体的生理活性和代谢过程都至关重要。
目前，国内外传统的atp检测手段主要有毛细管电泳法、分光光度法(朱建伟等(氟罗沙星葡萄糖注射液与六种药物配伍稳定性研究，中华临床医药杂志，2001，(12):48-49)、生物发光法和离子交换色谱法(邹玲莉等(离子对反相高压液相色谱法同时测定大鼠血浆和红细胞中外源性磷酸肌酸及其代谢产物和相关三磷酸腺苷，分析化学，2011，39(01):45-50)以及生物传感器(李辉彦等(基于微悬臂梁生物传感器检测三磷酸腺苷，应用化学，2015，32(3):362-366)、生物探针(王运等(水溶性阳离子荧光共轭聚合物作为荧光探针测定三磷酸腺苷，分析化学，2010，38(5):711-714)和量子点(林小峰等(atp检测方法研究进展，中国农学通报，2013，29(36):33-38)等高科技检测方法，其中：对于毛细管电泳法而言，其仪器成本低，但是不易操作，分离能力弱，重现性差。光学分析方法中的分光光度法和生物发光法虽然均可检测atp，其中分光光度法所用的试剂盒高效、专一，但是价格昂贵且操作繁杂，不适合大批量检测样品；生物发光法属于无损检测，快速、灵敏，但是所用到的荧光素酶价格昂贵，酶促反应的影响因素多，对该方法形成了制约。离子交换色谱法虽然具有较好的分离效果，但需消耗价格较贵的离子对试剂，对色谱柱及高压泵也有一定的腐蚀作用，不能成为常规的检测手段。对于诸如生物传感器、生物探针、量子点等高科技检测方法，对于技术的要求高，难以推广。
高压液相色谱法在分析领域广泛应用，其强大的分离能力，能够打破传统分析方法的局限性，重现性好，精密度高，可以作为atp的常规检测方法。文献调研发现(sumiyet.(plasmaatpisrequiredforneutrophilactivationinamousesepsismodel，shock，2014，42:142-147))，(殷平平等(高压液相色谱法分析宫颈癌和上皮内瘤样变患者血浆腺苷酸变化，现代医学,2015，43:549-552))、(徐啸翔等(咬合干扰致大鼠咬肌能量代谢产物含量变化.北京大学学报(医学版)，2017，49:25-30)、(朱会宇等(高压液相色谱法测定细胞内三磷酸腺苷及其代谢物的含量，色谱，2017，35:54-58)，采用高压液相法检测atp及其水解产物adp、amp的报道很多，检测条件也比较成熟。针对nadh、nad+等物质，采用高压液相法检测的也有报道(洪平，高压液相色谱法测定骨骼肌atp、adp、amp、nad+、nadh含量，中国运动医学杂志，2002，21(1):57-60)，但所测定的样品多为组织匀浆液，尚未发现同时测定血液或血浆中上述几种物质浓度的报道，没有发现采用同一份样品同时对atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+7种能量代谢物质进行定量分析的报道和方法。
中国专利cn104237412b，公开了一种高压液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种atp关联产物的方法，具体公开了使用带有二极管阵列检测器的高压液相色谱仪进行检测，将待测样品提取后进样到高压液相色谱仪中，梯度洗脱；根据各atp关联产物的保留时间及紫外吸收光谱，确定各色谱峰是哪一种atp关联产物，检测相应atp关联产物色谱峰面积，根据同样色谱条件下atp关联物标准工作曲线或者回归方程计算待测样品提取液中atp关联产物的含量。该技术方案中，能够同时检测atp、adp、amp和其它与atp关联的产物，但没有检测nadh、nadph、nad+和nadp+，检测过程复杂且成本较高。
技术实现要素：
鉴于此，本发明提出了一种同时检测多种能量物质的方法，旨在解决现有技术中各种能量物质难以准确、快速检测出来且检测成本较高的问题。
一个方面，本发明提出了一种同时检测能量物质的方法，包括以下步骤：步骤a，将待测生物样品置于一离心管中，必要时用水进行稀释。加入终浓度为(1％～6％)的高氯酸溶液，振荡混匀并冰浴后，在4℃下，10000×g的转速下离心5min；取一定量上清液于另一离心管中，加适量中和剂中和后得到所述待测生物样品的预处理液；步骤b，对所述待测生物样品的预处理液进行高压液相色谱分析，色谱分析的条件如下：柱温为25℃、检测波长为254nm、流速为0.6ml﹒min-1；流动相a为0.1mol﹒l-1的磷酸二氢钾溶液、流动相b为色谱甲醇；步骤c，分别制备不同浓度的能量物质atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+的标准水溶液样品，在经过与所述步骤a和所述步骤b中相同的条件处理后获得各所述能量物质的标准品的保留时间以及所述能量物质的标准品的浓度和色谱峰面积相对应的标准曲线；步骤d，根据各所述能量物质的标准品的保留时间以及各所述能量物质的标准品的浓度和色谱峰面积和相对应的标准曲线分别计算所述待测生物样品中atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+的浓度。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述待测生物样品为血液、血浆、血液中分离的白细胞和红细胞、组织液、组织培养细胞。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述组织培养细胞为利用生物学细胞培养技术获得的动物细胞。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述高氯酸溶液的终浓度为4.32％。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述中和剂为碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠或氢氧化钠中的至少一种。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，经所述中和剂中和后得到的所述待测生物样品的预处理液的ph值为5-7。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述流动相a的ph值为(5～7)。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述流动相a的ph值为6.25。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述流动相a与所述流动相b的体积比为(80:20)～(98:2)。
进一步地，上述能量物质的检测方法中，所述流动相a与所述流动相b的体积比为95:5。
本发明的有益效果在于，本发明提供的能量代谢物质的检测方法，通过将样品进行酸化和中和处理后利用特定的条件进行高压液相色谱分析，利用七种能量物质atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+的分子结构中含有共同的基团-腺苷，基于腺苷在254nm(如图1所示)附近有特征吸收峰这一特性，建立色谱分析条件，能同时实现这七种物质的分离和定量。该方法简便、快速、准确，重复性好、检测成本低。同时，该方法对待检测样品要求不高，对多种生化样品都适用，不仅能用于血浆和组织液中能量代谢物质的定量分析，也能分析细胞内这些能量物质的含量，不仅对红细胞和白细胞有效，对组织培养细胞也具有相同的效果。因而，该方法不仅简单易行成本低，而且适用范围广。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
图1为本发明实施例中atp的光吸收曲线；
图2为本发明对比例1中的atp对照品图谱；
图3为本发明对比例2中红细胞样品图谱；
图4为本发明对比例3中的红细胞样品图谱；
图5为本发明对比例4中的红细胞样品图谱；
图6为本发明对比例5中的红细胞样品图谱；
图7为本发明实施例1中血浆样品图谱；
图8为本发明实施例1中红细胞样品图谱；
图9为本发明实施例1中白细胞供试品图谱；
图10为本发明实施例1中混合对照品溶液图谱；
图11为本发明实施例2中hepg2细胞供试品图谱。
具体实施方式
为了详细说明本发明实施例提供的能量物质的检测方法的优势，下面使用具体实施例对本发明进行说明。
本发明中待测生物样品为血液、血浆、血液中分离的白细胞和红细胞、组织液、组织培养细胞。其中，血液是指血液全血，本发明实施例中对血液中的血浆、白细胞和红细胞进行分离后作为供试品，然后分别测量这三种供试品中7种能量物质的含量。分离血液中血浆、红细胞和白细胞的过程如下：
采集人体空腹状态下静脉血，静置一段时间后，在室温下，以1300×g的离心条件离心15min，分别取出上层的血浆和下层的红细胞；
吸取中间的白色薄膜层于离心管中，向其中加入洗涤液pbs，以550×g的离心条件离心5min，除去上层洗涤液，加入红细胞裂解液重悬细胞，吹打混匀，冰上裂解3min，在300×g的离心条件下离心10min，除去上层液后继续加入裂解液，直至红细胞裂解结束，再加入适量的pbs溶液洗涤至少一次，得到白细胞。
本发明中选用的组织培养细胞为利用生物学细胞培养技术获得的动物细胞，其可以分为原代或传代细胞，悬浮或贴壁细胞。本实施例中选用的为贴壁培养的传代细胞中的hepg2细胞。
分离hepg2细胞的过程为：在直径为10cm的细胞培养皿中，用含有10％血清的dmem-h培养hepg2细胞，待对数增长期时，收取细胞，用体积分数为0.25％的胰蛋白酶与体积分数为0.05％的edta混合液1ml，完全浸润细胞30s后，吸去消化液，加入4mlpbs溶液吹散细胞，收集至离心管，细胞计数后，稀释浓度至1×107个/ml，即得hepg2细胞悬液。
本实施例中血浆、红细胞、白细胞和hepg2细胞四种供试品，经过酸化、中和等过程，获得样品处理液；再经色谱分析获得对应的atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+的色谱峰。通过与上述物质的标准曲线对比，即可分别计算出血浆、红细胞、白细胞和hepg2细胞中atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+的浓度。
本发明实施例中所用的仪器为：agilent1260高压液相色谱仪，heraeusmegafuge8r型高速冷冻离心机，ms105du型电子分析天平，milli-q型纯水机，ql-901型涡旋仪。
本发明实施例中七种能量物质对照品均购自美国sigma公司，甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
对比例1
精密称取2.05mg对照品atp，置于10ml容量瓶中，加水溶解后定容，将此atp溶液用水稀释20倍后取10μl进样测量，流动相为0.1mol﹒l-1磷酸二氢钾溶液：甲醇＝88：12(v/v)；流速为0.5ml﹒min-1；柱温30℃；检测波长254nm，atp对照品色谱图如图2所示。
对比例2
取500μl血浆和红细胞样品，加入500μl超纯水后加入3％高氯酸500μl，涡旋混匀，冰浴10min后，4℃，在14000×g的离心条件下离心10min，上清液过滤后进样测量，色谱条件同对比例1所述，红细胞样品色谱图如图3所示。
对比例3
取500μl血浆和红细胞样品，加入150μl超纯水后加入3％高氯酸500μl，涡旋混匀后，冰浴10min，4℃下，在10000×g的离心条件下离心10min，取上清300μl加入3％氢氧化钾溶液350μl后，过滤进样，色谱条件同对比例1所述，红细胞样品色谱图如图4所示。
对比例4
取500μl血浆和红细胞样品，加入150μl超纯水后加入3％高氯酸360μl，涡旋混匀后，冰浴10min，4℃下，在10000×g的离心条件下离心10min，取上清液300μl加入3％氢氧化钾溶液40μl后，过滤进样，色谱条件为：流动相为0.1mol﹒l-1磷酸二氢钾溶液(加入四丁基氢氧化钠调ph至6.25以减轻对柱子的伤害)：甲醇＝95：5；流速为0.5ml﹒min-1；柱温30℃；检测波长254nm，红细胞样品色谱图如图5所示。
对比例5
取500μl血浆和红细胞样品，加入150μl水后加入终浓度为3％的高氯酸360μl，涡旋混匀后，冰浴10min，4℃下，在10000×g的离心条件下离心5min，取上清液300μl加入3％氢氧化钾溶液40μl后，过滤进样，色谱条件为：流动相为0.1mol﹒l-1磷酸二氢钾溶液(氢氧化钠调ph至6.25)：甲醇＝95：5；流速为0.6ml﹒min-1；柱温25℃；检测波长254nm，色谱图如图6所示。
实施例1
采集人体空腹状态下静脉血10ml，静置一段时间后，室温下，在1300×g的离心条件下离心15min，分别取出上层的血浆和下层的红细胞；吸取中间的白色薄膜层于2ml离心管中，加入洗涤液pbs至2ml，在550×g的离心条件下离心5min，除去上层洗涤液，加入2ml红细胞裂解液重悬细胞，吹打混匀，冰上裂解3min，在300×g的离心条件下离心10min，除去上层液后继续加入裂解液，直至红细胞裂解结束，再加入适量的pbs溶液洗涤1-2次，得到白细胞。
分别取100μl上述血浆、红细胞和白细胞样品置于三支1.5mlep管中，向三支ep管中分别加入40μl超纯水振荡混匀，再加入终浓度为4.32％高氯酸，涡旋混匀后，冰浴10min，4℃下，在10000×g的离心条件下离心5min，取上清液300μl分别加入三支1.5mlep管中，并向其中加入2mol﹒l-1的碳酸钾40μl中和样品。样品过滤后得到处理液，并对其进行高压液相色谱分析。色谱分析的条件如下：柱温为25℃、检测波长为254nm、流速为0.6ml﹒min-1；流动相a为0.1mol﹒l-1的磷酸二氢钾溶液、流动相b为色谱甲醇；流动相a的ph值为6.25、流动相a与流动相b的体积比为95：5；进样量为10μl。本实施例中血浆、红细胞和白细胞样品的色谱图分别如图7、8和图9所示。
准确称量一定量的atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+对照品，置于10ml容量瓶中，加水溶解后定容，获得含有0.6mmol/latp、0.3mmol/ladp、0.5mmol/lamp、0.2mmol/lnadh、0.3mmol/lnad+、0.3mmol/lnadph、0.4mmol/lnadp+的混合对照品储备液。然后通过稀释，获得不同浓度的混合对照品溶液。分别取不同浓度的混合对照品溶液100μl，置于不同的1.5mlep管中，采用与上述供试品同样的预处理及色谱分析条件对其进行处理和分析后，得到混合对照品的色谱图如图10所示。保留时间通过单一标准品采用同样的方法来确定。根据上述获得的混合对照品的色谱图，并以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，如下表1所示：
表1atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph、nadp+标准曲线(n＝5)
由表1可以看出，各物质的的线性关系良好。最后，利用外标法，将三种供试品溶液中atp、adp、amp、nadh、nad+、nadph和nadp+对应的峰面积带入标准曲线中，从而计算出各能量物质在三种供试品溶液中的浓度，结果见表2。
实施例2
在直径为10cm的细胞培养皿中，用含有体积分数为10％的血清的dmem-h细胞培养基培养hepg2细胞，待对数增长期时，收取细胞，用体积分数为0.25％的胰蛋白酶加体积分数为0.05％的edta混合液1ml，完全浸润细胞30s后，吸去消化液，加入4ml的pbs溶液吹散细胞，收集至离心管，细胞计数后，通过稀释，获得细胞量为1×107个/ml的细胞悬液。取0.1ml该细胞悬液，按照实施例1的方法进行样品处理和色谱分析，最终得到的hepg2细胞供试品的色谱图结果如图11所示。根据色谱图和标准曲线计算出hepg2细胞中的7种能量代谢物的含量，结果见表2。
表2各供试品溶液中能量物质的浓度
由上述实施例和对比例可以看出，在对比例1的色谱条件下，atp标准品峰型良好(如图1所示)。对比例2在对比例1的色谱条件基础上，对样品进行前处理，多个物质没有出峰。鉴于碱性条件能增大nadp+、nad+含量，利于检测，对比例3遵循对比例1的色谱条件，样品前处理中加入碱进行中和处理，但出来的各峰分离度不够理想。对比例4在对比例3的基础上，通过改变流动相比例以及用四丁基氢氧化钠来调节ph来达到较好的分离度，结果atp、adp、amp三个基础峰出成合峰。对比例5在对比例4的基础上，改变了流速及柱温以及改用氢氧化钠调节流动相ph的方式，获得了更好的分离效果。实施例1最终在对比例5的基础上，不改变色谱条件，仅对样品前处理中酸处理及碱中和的用量及浓度进行了调整，各物质能够实现有效分离，峰型良好，并能够通过外标法计算出各物质的含量，方法操作简便，可行性强。同样，实施例2中各物质也能有效分离，且峰型良好。
值得注意的是，本发明实施例提供的检测方法不仅对血浆有效，对其它组织液、器官组织的匀浆液等其它液体生物样品也有效。不仅适用于血细胞，例如红细胞和白细胞，也适用于体外培养细胞，例如hepg2中能量物质浓度的检测。不仅能有效地确定样品中atp、adp和amp的含量，还能同时检测样品中nadh、nad+、nadph和nadp+等的含量。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。