本申请要求于2016年3月15日提交的、发明名称为“便携式变应原检测系统”的美国临时申请序列号号62/308,376和2016年3月15日提交的、发明名称为“变应原检测试剂和方法”的美国临时申请序列号号62/308,377的优先权;所述申请的内容通过引用的方式全部并入本文。
参考序列表
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发明领域
本发明涉及用于检测测试样品中靶变应原例如食物样品中的食物变应原的存在和/或不存在的系统、装置、适体、信号传导多核苷酸(spn)、检测试剂和方法。
背景技术
过敏(例如,食物过敏)是影响全世界数百万人的常见医学病症。据估计,在美国,高达2%的成年人和高达8%的儿童,特别是3岁以下儿童,患有食物过敏(约1500万人),而且患病率被认为不断增加。在过敏反应期间,免疫系统错误地将变应原视作威胁并攻击它。过敏反应可能影响皮肤、消化系统、胃肠道、呼吸系统、循环系统和心血管系统;在一些过敏反应中,多器官系统受到影响。过敏反应范围从轻微到严重或危及生命。严重的症状可能包括呼吸困难、低血压、胸痛、意识丧失和过敏反应。目前患有过敏症的人们通过避免任何可能含有特定变应原的食物来控制其过敏反应。这些限制对患者的生活质量有重大影响,并且仍然没有有效的方法来评估食物中真正变应原的含量。在美国,每三分钟就有人因食物过敏症状被送到急诊室。确定变应原存在的快速、灵敏和准确的方法将是非常有益的。使患者能够测试他们的食物并准确及时地确定变应原含量的便携式设备将有助于做出是否消费的明智决定。
研究人员已经尝试开发出合适的装置和方法以满足这种需求。本领域公开了许多检测食物样品中变应原含量的装置和系统,包括mckay的美国专利号5,522,587,其教导了由吸收材料形成的餐垫和施加在所述垫子上隔离区域的小斑点化学试剂,以检测食物变应原;jungle等的美国专利申请公开号2008/0182339和美国专利号8,617,903,其教导了用微流体芯片处理样品以检测变应原的方法,所述微流体芯片被配置用于分析一种或多种变应原指示剂,用一个或多个检测单元检测变应原指示剂,并用一个或多个显示单元显示结果;scott等的美国专利申请公开号2010/0210033,其教导了一种用于检测食物变应原的便携式装置,包括壳体、样品入口、用于指示样品中潜在变应原存在的装置、以及使用标记抗体检测潜在变应原的变应原检测芯片;royds的美国专利号7,527,765,其教导了一种用于识别食物样品中有害污染物(包括变应原)存在的食品检测装置,包括一次性样品容器、包括刀片组件的机械液化器、具有试剂的试剂供应室,所述试剂对有害污染物具有亲和力,能够检测液化食品中的有害污染物,并在识别出有害污染物时产生视觉提示;和suni等人的美国专利号9,201,068,其教导了结合有抗体的用于食物过敏检测的生物电子舌。
为了实现食物样品中灵敏且准确的变应原检测,能够快速识别变应原的特定检测器对于测试结果至关重要。目前,在食品工业中以及对于具有食物过敏的顾客,通常采用免疫测定进行食物变应原的检测。特定的变应原蛋白可以通过免疫测定法测量,例如elisa、ria(放射免疫测定)、乳胶凝集检测或蛋白质印迹。在这些测定中,需要对靶变应原具有特异性的抗体。现有技术中公开了许多检测特定食物变应原的免疫测定法,例如,美国专利号8,377,696公开了检测甲壳纲动物原肌球蛋白的免疫测定;8,361,460教导了使用针对大豆变应原的抗体的elisa,从而为食物过敏患者提供安全;8,349,620,涉及用于检测多种变应原的免疫测定系统;以及6,441,142,其公开了花生变应原的免疫测定法。然而,大多数免疫测定耗时、需要训练有素的人员来读取测试结果、难以小型化、未完全标准化。此外,免疫测定受到干扰,其通常归因于基质效应和交叉反应性。因此,免疫测定方法经常导致假阳性结果。
除了特异性结合变应原的抗体之外,在若干个专利和专利申请中公开了例如适体的核酸分子、以及利用它们的装置和方法,以用于检测样品(例如食物样品)中蛋白质,包括rasooly等人的美国专利号8,614,466,其教导了采用被称为“电渗透”(通过随机电阻网络的电流)的物理原理的方法和系统,其中采用适体作为捕获分子在半导体中电检测生物分子结合;lowery,jr.等人的美国专利号8,563,298,其教导了用于收集和检测分析物的nmr系统和方法;lieber等人的美国专利号8,232,584,其教导了用于检测分析物的基于荧光的纳米级线生物传感器装置和方法,其中适体可以相对于纳米级线间接固定;hornbeck等人的美国专利号7,977,462,其教导了侧向流动装置,其采用适体对在癌和/或白血病中鉴定出的新的酪氨酸磷酸化位点进行检测和定量;gordon等人的美国专利号7,855,057,其教导了检测样品中少量蛋白质异构体(例如,由于选择性剪接,或不同的疾病蛋白异构体或降解产物)的方法、试剂和装置,包括采用捕获剂的组合,其中捕获剂可以是适体;brunner等人的美国专利号8,618,046,其教导了一种采用基于适体的抗cetp-抗体诱导抗原治疗动脉粥样硬化的方法;yokota等人的美国专利号8,507,458,其教导了一种通过利用内源乳糜微粒来递送核酸以抑制靶基因表达的系统,其中核酸可以是适体;和vukicevic等人的美国专利号7,850,964,其教导了骨形成蛋白(bmp)的核酸生物传感器,用于诊断和治疗骨和软组织缺陷和病症(上述每一个的内容通过引用的方式并入本文)。在蛋白质检测中使用适体的其他公开内容也包括在pct专利公开号wo2009/019007、wo2009/040113、wo2010/108657和wo2013/104540中;它们通过引用的方式并入本文。
在核酸试剂中,适体衍生的分子信标(mb)是研发最多的检测试剂,其为包含荧光团和猝灭剂基团的发夹形寡核苷酸,并且起到开关作用。当处于闭合状态时,荧光团和猝灭剂位在一起并通过共振能量转移淬灭(“关闭”)荧光。当构象变化打开发夹结构并且荧光团和猝灭剂被分离时,猝灭剂不再猝灭并且荧光恢复(“开启”)。mb在要求探针具有高灵敏度和优异的分子识别特异性的检测装置和诊断测定中特别有用;它们是高度靶特异性的,只忽略仅存在少至单个核苷酸差异的核酸靶序列。作为检测器的mb可以允许实时监测,并且用于“无需分离的检测”,其中不可能或不希望将探针-靶杂交物与过量的未杂交探针分离。mb环-茎结构提供的特异性已被证明适用于各种生物环境。
示例性的分子信标在leung等人,2011(nucleicacidsresearch,2012,40(3):941-955)中进行了综述,并在litman等人的美国专利号8,188,255中进行了描述,其教导了与癌症相关的microrna(mirna)序列,以及使用适体和分子信标对它们进行检测;meyers等人的美国专利号7,282,360,其整体上公开了使用适体或分子信标检测新蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、脯氨酰寡肽酶、胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和遍在蛋白羧基末端水解酶家族成员;和kapeller-libermann等人的美国专利号6,730,491,其整体公开了使用适体或分子信标检测三种所声称的新蛋白激酶家族成员;以上通过引用的方式并入本文。
本发明的发明人已经开发了基于适体的信号传导多核苷酸(spn),其对不同的变应原蛋白具有高度特异性。所述信号传导多核苷酸(spn)被设计成具有与分子信标类似的闭合茎-环结构。spn在多核苷酸的一端用荧光团标记,在另一端用荧光猝灭剂标记。所述闭环结构使荧光团和猝灭剂结合在一起,并且在变应原与spn结合时,闭环结构打开并且使荧光团从猝灭剂释放。测量变应原结合之前和之后的荧光强度变化并用于检测样品中的变应原含量。2014年7月18日提交的共同拥有的美国专利申请序列号号62/026,361、2014年6月10日提交的62/009,958、2014年5月9日提交的61/991,068、2014年2月11日提交的61/938,528、2013年10月28日提交的61/896,399以及2014年10月28日提交的pct专利申请序列号pct/us2014/062656,发明名称均为“变应原检测”;以及2015年4月29日提交的美国专利申请序列号62/154,200、2016年4月21日提交的pct专利申请序列号pct/us2016/029356,发明名称为“变应原检测的组合物和方法”(这些申请的全部内容通过引用的方式并入本文),讨论了这些信号传导多核苷酸的序列、结构和检测方法。
本发明人设计了检测系统、采用所述spn作为检测试剂检测测试样品中的变应原的装置。检测系统在共同拥有的于2015年3月16日提交的美国临时申请序列号62/133,632和于2015年6月22日提交的美国临时申请序列号62/182,900中讨论;其全部内容通过引用的方式并入本文。
在本发明中,发明人进一步修饰了特异性结合靶变应原的适体的核酸序列,以开发出新的spn和变应原检测试剂。经鉴定的可以特异性结合变应原的适体在核酸序列的5'和3’端被修饰,并在多核苷酸的一个末端用荧光团标记。在一些实施方案中,当靶变应原与该信号传导多核苷酸(spn)结合时可以测量荧光偏振(fp)变化,该fp信号将用于指示食物样品中变应原的存在和/或不存在。
本发明的发明人进一步开发了检测系统和装置,其包括独立的采样器,一次性容器和检测器,采用基于适体的信号多核苷酸(spn),快速且准确地检测样品中的变应原。spn的荧光偏振的变化可以通过该检测装置测量并用于指示样品中的变应原含量。该检测装置/设备可以是小型化的,便携式的和手持式的装置,用于检测样品中的食物变应原。
技术实现要素:
本发明提供了用于各种类型样品、特别是食物样品中的变应原检测的系统、装置、检测容器和方法。还提供了检测试剂,例如对变应原蛋白具有特异性的核酸适体以及衍生自适体的信号传导多核苷酸(spn)。
本发明的一个方面是用于检测样品中一种或多种变应原的存在和/或不存在的变应原检测系统,该系统包括:(a)至少一个采样器,用于收集测试样品;(b)至少一个检测容器,用于接收和处理测试样品,并分析测试样品中的变应原与检测试剂之间的相互作用;和(c)检测装置,用于检测测试样品中的变应原。
在一些实施方案中,采样器具有称重的装置,以确保获取了特定量的测试样品。在一些方面,采样器是食物获取取芯器,其配置用于测量食物样品的一定尺寸的部分和/或对收集的食物样品进行预处理。所述食物取芯器具有在远端设置有取芯器顶帽的远端部分,设置有收集管的近端部分,用于操作与所述收集管连接的取芯器的把手,位于收集管内的柱塞,其具有连接至顶帽的远端和近端柱塞头,其中近端柱塞头可以突出于收集管,用于获取食物样品。作为非限制性示例,食物获取取芯器还可包括弹簧,以指示所获取的食物样品的量。
在一些实施方案中,检测容器是一次性的,适用于一种特定的变应原。检测容器包括至少一个发生检测反应的反应室。在一些实施方案中,检测容器是一次性测试杯或杯状容器。该一次性测试杯或杯状容器可以设计为分析模块,测试样品在其中被处理,并且通过与检测试剂的相互作用检测测试样品中所关注的变应原。在一些方面,测试杯或杯状容器包括杯体和杯盖。杯盖具有若干个端口,用于容纳采样器(例如食物获取取芯器)、均质器组件和用于供经处理的测试样品溶液流动的装置。杯体可以包括一个容器,或者可以分成两个独立但连接的部分。
反应室可以被配置在测试杯内的不同位置,包括但不限于,杯盖组件或杯体的底部和/或侧面,或分开的杯体的一部分。在一些实施方案中,杯盖组件可包括一个或多个反应室。在一些方面,反应室可以被配置包含约10ul至约200ul的体积。
本发明的检测装置包括(a)外壳,其为检测装置的部件提供支撑;(b)第一部分,在实施变应原检测测试时可以打开以插入检测容器(例如,一次性测试杯或杯状容器);(c)集成用于运行变应原检测测试的装置,和(d)用于携带检测装置的可选系绳和用于供电的可选插头。
根据本发明,检测装置的第一部分可以是抽屉组件,其可以从壳体中拉出并滑回壳体中。该抽屉组件可以被配置成具有在实施变应原检测测试时用于容纳一次性检测容器(例如,测试杯或杯状容器)的孔/端口。在其他方面,该第一部分可以是门,其可以被提升并打开所述孔/端口以插入检测容器(例如,测试杯或杯状容器)。
根据本发明,集成用于运行变应原检测测试的检测装置的部件包括(i)用于处理测试样品的装置,包括均质器;(ii)驱动和控制均质化的装置;(iii)在变应原检测过程中驱动和控制经处理的样品流动的装置;(iv)用于检测反应信号的光学子系统;(v)用于可视化检测结果的装置,包括转换和数字化检测信号的装置和显示窗口;和(vi)电源。
在一些实施方案中,均质器被优化用于对测试样品进行低功率、高速的均质化。一方面,均质器包括位于定子内部的转子,所述转子的近端具有叶片,定子近端的轴线上具有一个或多个槽。均质器的转子和定子连接至马达,该马达可以驱动和控制转子和定子的运动,从而使测试样品均质化。
在一些实施方案中,用于驱动液体流动和控制流速的装置可以是泵或外部压力。泵可以是气体泵或空气泵,或其等同物。经处理的样品溶液流入被配置在检测容器(例如,测试杯或杯状容器)内的反应室中。
在一些实施方案中,光学子系统可以是光学组件,在变应原检测测试期间其可以检测所产生的荧光信号。在一些实施方案中,荧光信号是荧光偏振(fp)变化。光学子系统可包括光源、滤光器和控制光的平面偏振的偏振器;和一个光电检测器。
在一些实施方案中,印刷电路板(pcb)直接或间接连接到反应室和光学子系统,用于显示测试读数。结果可以显示为数字、图标、颜色和/或字母、或其他等同物。
在一些实施方案中,本检测装置的电源可以是可充电或可更换的电池。在其他实施方案中,检测设备可以包括扩展坞和/或usb充电器。在进一步的实施方案中,检测装置可以被配置为直接连接到诸如ac/dc转换器的电源。
在一些实施方案中,检测系统可以包括可由软件应用程序访问和控制的用户界面。该软件可以由诸如智能手机、平板电脑、个人计算机、笔记本电脑、智能手表和/或其他设备的个人设备上的软件应用程序运行。在某些情况下,该软件可以由互联网浏览器运行。在一些实施方案中,软件可以连接至称为云的远程和本地化服务器。
本发明的另一方面提供了适体、spn,其可作为检测试剂以确定样品中变应原的存在和/或不存在。在一些实施方案中,检测试剂可以是衍生自适体的spn。本发明的spn可包括适体,所述适体具有特异性结合靶变应原的核酸序列、在多核苷酸的5’端或3’端的经修饰的核酸序列,和标记在多核苷酸的一个末端的荧光团标记,所述经修饰的核酸序列被设计为维持单个开放结构。
在一些实施方案中,本发明的spn可包含表1和表2中所示的核酸序列。
在一些实施方案中,本发明的spn包含核心核酸序列,该核心核酸序列选自seqidno.:2、6、13、27、35、44、57、61、65、71、78、84、98、110、119、126、132、137、150、158、168、178、190、194、204、215、220、228、237、247、251、255、259、263、267、271、279、296、308、316、332、334、336、338、340和341-353的多核苷酸序列。
在其他实施方案中,本发明的spn包含核酸序列,所述核酸序列选自seqidno.:3、4、7-11、14-25、28-33、36-42、45-55、58、59、62、63、66-69、72-76、79-82、85-96、99-108、111-117、120-124、127-130、133-135、138-148、151-156、159-166、169-176、179-188、191-192、195-202、205-213、216-218、221-226、229-235、238-245、248、249、252、253、256、257、260、261、264、265、268、269、272-277、280-294、297-306、309-314和317-330的多核苷酸序列。
在一些实施方案中,本发明的spn在5’端或3’端用荧光分子标记,当靶变应原结合时,可以检测荧光偏振(fp)的变化。一方面,荧光分子是德克萨斯红。
本发明的另一方面涉及用于检测样品中变应原含量的变应原检测测定,其包括以下步骤:(a)获得怀疑含有所关注的变应原的样品,(b)用提取缓冲液处理(a)的样品,(c)使经处理的样品与检测检测接触,(d)用激发装置处理经接触的样品并测量荧光偏振,和(e)使检测试剂和变应原的相互作用可视化。
在一些实施方案中,本检测方法可包括以下步骤:(a)使用取样器获得怀疑含有所关注的变应原的测试样品,(b)采用均质化组件,在提取缓冲液中处理和消化所获得的样品,(c)将经处理的样品与对所关注的变应原具有特异性的检测试剂混合,(d)用荧光激发装置处理步骤(c)的混合物并检测检测试剂发出的荧光信号,和(e)将检测到的信号数字化,并使检测试剂和变应原之间的相互作用可视化。检测试剂可以是基于适体的spn,其可以特异性结合特定的变应原。用荧光分子探针标记spn。可以优化提取缓冲液以有效提取变应原蛋白。在一些方面,荧光信号可以是荧光偏振变化。
根据以下描述,本发明的其他特征和实施方案将是显而易见的。
附图的简要说明
参照附图所示,以下对本发明特定实施方案的描述将使前述和其他目的、特征和优点显而易见。附图仅出于描述本发明的示例性实施方案的目的,并不旨在将本发明的范围限制于示例性的实施方案。附图中类似的附图标记用于在不同附图中表示相同或相似的元件。
图1a显示了本发明检测系统的一个实施方案,其包括检测装置100,作为采样器的示例的独立的食物取芯器200,作为检测容器的示例的一次性测试杯300,和可选的系绳50。图1b显示了在实施变应原检测测试过程中图1a所示检测系统的组装。
图2a和图2b显示了食物取芯器200的各部件。图2c是经组装的食物取芯器200,作为采样器的示例。
图3a是经组装的一次性测试杯300,其具有杯盖组件210和杯体220;一次性测试杯300是检测容器的示例。图3b至图3g显示了一次性测试杯300的分解图。图3b示出了标签/最终流体密封件211。图3c示出了光学窗口/流体密封件216。图3d示出了均质器转子240。图3e示出了杯盖组件210。图3f示出了流动管221,以及流动管帽和过滤器组件224。图3g示出了杯体220。
图4a显示了盖组件210上的均质器转子240的另一替代结构,其通过膜密封件250连接至转子端口212,而没有均质器定子230。图4b示出了位于盖组件210顶部的反应室的另一替代结构。
图5a是位于杯体220底部的反应室223的替代实施方案的侧视图。图5b是从测试杯300的底部观察的视图,显示了阀228,用于控制流体流向反应室223和/或另外的对照室225(未示出)。
图6a和图6b描绘了两种不同形状的杯体220’(图6a,左面板的侧视图和右面板的顶视图)和220”(图6b,左面板的侧视图和右面板的顶视图),分为两个独立但连接的部分。图6c和图6d分别示出了经组装的测试杯300,其具有分开的杯体220,和在该替代设计中的杯盖组件210的分解图。
图7a至图7d描绘了反应室223的形状和布局的其它示例。图7a是杯体220的顶视图,图7b-7d是杯体220的侧视图。
图8a和图8b示出了过滤器组件的其他实施方案。图8a示出了可以设置在杯体220底部的与杯底222具有一定距离的替代过滤膜226。图8b示出了另一替代方案,其中过滤膜226与杯壁平行对齐,并且小腔室227可以连接至杯体220,用于接收经过滤的样品溶液。
图9a和图9b描绘了杯体220内的过滤膜226的替代设计。图9a示出了所提供的单个过滤膜226;图9b示出了提供的双滤膜226。
图10a和图10b示出了检测装置100的外部部件。图10a示出了壳体10。图10b示出了抽屉组件20。
图11示出了本发明的检测系统的替代组件,其具有爪状旋转门410或摆动壳体配置。
图12a和图12b示出了检测装置100的组装。图12a示出了检测装置100的各个部件。图12b示出了配置在外壳10(没有显示)内的检测装置100的部件。
图13a示出了经组装的试验板(breadboard)均质器组件570及其部件。图13b-13e示出了齿轮头610,耦合器630,均质器定子230和均质器转子240。
图14示出了马达梭710和马达510组件。
图15a和图15b示出了连接到泵540的齿轮系(geartrain)/驱动台板530。图15a是齿轮系/驱动台板530的底视图,图15b是齿轮系/驱动台板530的顶视图。
图16示出了光学子系统520的一个实施方案。
图17示出了光学子系统520的一个替代方案。
图18示出了连接到光学子系统520的印刷电路板(pcb)550。主控pcb包含马达和泵/致动器控制电子器件。
具体实施方式
在下文中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。尽管与本文所述类似或等同的任何材料和方法可用于本发明的实践或检测,但此处描述了优选的材料和方法。根据说明书,本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。在说明书中,除非上下文另有明确规定,否则单数形式也包括复数。除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在冲突的情况下,以本说明书为准。
使用分析装置来确保食品安全尚未达到履行其承诺的程度。特别是,在检测范围极广的各种已知的变应原中,尚未开发出基于简单但准确、灵敏和快速检测方案的便携式装置。对涉及食品安全控制的基于适体的分析的一份近来的综述表明,虽然已经开发了多种用于变应原检测的商业分析工具,但大多数依赖于免疫测定。进一步表明,正在对该组成分的适体进行选择(amaya-gonzález等,sensors2013,13,16292-16311,其内容通过引用整体并入本文)。
本发明提供了可以在各种食物样品中特异性检测低浓度变应原的检测系统、装置和试剂。本发明的检测系统、装置和方法采用基于适体的信号多核苷酸(spn)作为检测试剂。如本文所用,术语“变应原”是指在受试者中导致、引起或引发免疫反应的化合物、物质或组合物。变应原也可称为抗原。测量荧光信号如荧光偏振(fp)以指示样品中的变应原含量。
在一个实施方案中,本发明的检测系统和/或设备是小型化的、便携式和手持式产品,其旨在具有紧凑的尺寸,增强其便携性和谨慎操作。用户可携带本发明的检测系统和装置,并在食用食物之前对食物样品中一种或多种变应原的存在和/或不存在进行快速且实时的测定。根据本发明的检测系统和设备可以由用户在任何地点使用,例如在家中或在餐馆中。
在本发明的一个实施方案中,该检测系统和/或设备将测试结果显示为标准读数,并且任何用户可以根据如何操作该检测系统和设备的简单说明书来实施检测。
在一些实施方案中,该检测系统和设备被设计用于简单、快速、灵敏的一步操作。变应原检测测试可在不到5分钟内完成。
根据本发明,该检测系统和设备可以涉及整合了电子工程、机械工程和计算工程的机电一体化设计过程,以实现和控制变应原检测测试的过程,其包括可充电或可更换的电池、用于处理测试样品的马达驱动器、用于控制使经处理的样品溶液流向检测装置的不同部件的泵或致动器,以及连接和集成不同部件以进行快速变应原测试的连接器。本发明的检测系统和装置还包括光学系统,该光学系统被配置用于检测测试样品中所关注的变应原的存在和浓度,并将检测信号转换成可读信号;机械部件,为检测装置的其他部件提供支撑,并将不同部件集成在一起作为功能产品。
在一些实施方案中,该检测系统和/或设备被设计成使得一个或多个特定变应原独有的一次性容器(例如,一次性测试杯或杯状容器)用于接收和处理测试样品,并进行检测测定,其中包装有所有溶液。因此,所有溶液可以被限制在一次性杯子或杯状容器中。作为非限制性示例,用户可以采用一次性谷蛋白测试杯以检测任何食物样品中的谷蛋白并在测试后丢弃。因此,检测装置可以是干燥装置,并且溶液被包装为一次性用品。这样的设计避免不同变应原测试间的交叉污染。
在一些实施方案中,提供了可以测量测试样品并确定其大小的单独采样器。一方面,采样器可以进一步对测试样品进行预处理,例如将样品切成小块、混合、刮擦和/或研磨,以使样品适于变应原蛋白质提取。
在一些实施方案中,本发明的检测试剂包含spn,其特异性识别靶变应原并产生荧光偏振的变化作为检测信号。spn可以包含适体序列,通过对靶变应原具有高特异性和亲和力的选择过程来鉴定所述适体序列。
检测系统
通常,本发明的变应原检测系统包括至少一个用于收集测试样品的采样器,至少一个用于实施变应原检测测试的一次性检测容器,以及用于检测和可视化检测结果的检测装置。
如图1a和图1b所示,本发明的检测系统的一个实施方案包括检测装置100,其被配置用于处理测试样品,实施变应原检测测试,以及检测所测定的结果,作为采样器示例的独立食物取芯器200,以及作为检测容器示例的一次性测试杯300。可选地,可以包括系绳50,用于携带检测装置100。本文中,一次性测试杯300可以是杯子或杯状容器。检测装置100包括外壳10和抽屉组件20,外壳10为检测装置100的部件(如图12a-12b、13a、14、15a-15b和16-18所示)提供支撑,抽屉组件20包括抽屉框架22和用于容纳一次性测试杯300的抽屉孔/端口23。在抽屉框架22的前部,可以添加抽屉把手21以供使用者操作抽屉组件进出壳体10。外壳10还为按钮提供表面空间,所述按钮使得用户可以操作该设备。可以包括允许用户执行变应原检测测试的执行/动作按钮40和允许用户打开和/或关闭检测装置100的开/关滑块30。还可以包括显示窗口60(图1b中示出)和用于外部充电的可选插头(未示出)。可选地,可以在外壳10的外表面上包括用于连接可选系绳50的系索51。
在实施变应原检测测试的过程中,将获取样品的食物取芯器200插入一次性测试杯300中,并将一次性测试杯300插入检测装置100的抽屉孔/端口23中,如图1b所示。
图1a和图1b中所示的检测系统的组装不是限制性的。组装一次性测试杯300、食物取芯器200和检测装置100的其他方式也在本发明的范围内。一个示例包括,检测装置100可以被配置为从测试杯300的侧面或顶部抓住一次性测试杯300,例如图11中所示的替代组件。另一方面,检测装置100可以被配置为具有可被提升的门,用于将检测装置100与一次性测试杯300和食物取芯器200连接。
检测系统-采样器
收集合适尺寸的样品是实施变应原检测测试的重要步骤。在本发明的一些实施方案中,提供了用于获取和收集测试样品(例如食物样品)的单独的取样器。一方面,本文公开了用于获取和收集食物样品的取芯-包装-柱塞概念。所述结构可以测量和收集测试样品的一个或几个不同尺寸的部分,并提供预处理步骤,例如切割、研磨、刮擦和/或混合,以有利于测试样品中变应原蛋白的均质化和提取或释放。根据本发明,独立的食物取芯器200被设计用于获取不同类型的食物样品并收集一定尺寸的测试样品。
如图2a至图2c所示,食物取芯器200具有在其远端具有取芯器顶帽110的远端部分(图2a)、具有样品收集管140的近端部分(图2b)、用于操作食物取芯器200的连接至收集管140的手柄120(图2b),以及位于样品收集管140内的柱塞130(图2a),该柱塞130具有连接至取芯器顶帽110的远端和可以突出于样品收集管140的近端柱塞头150,该近端柱塞头150直接接触测试样品并获取一定尺寸部分的测试样品(图2a-2c)。近端柱塞头150的形状可以被配置用于预处理收集的样品。食物取芯器200的近端可以进一步具有按扣(snap)等,其在将经收集的测试样品从食物取芯器200转移到测试杯300时减少样品溢出的发生。
食物取芯器200的部件可以设计成易于操作的任何形状,例如三角形、正方形、八边形、圆形、椭圆形等。
在一些实施方案中,食物取芯器200的尺寸设计成装配在位于杯盖组件210顶部的取芯器端口213中(图3a)。在其他实施方案中,食物取芯器200可进一步具有用于称量被获取的测试样品的装置,例如弹簧、刻度或其等同物。作为非限制性示例,食物取芯器200可具有称重张力模块。
可选地,可以设计其他样品获取器用于获取和收集不同类型的测试样品。样品获取器的其他设计可以包括切割取芯器(bisectingcorer),在注射器的直径上具有刀片(例如,x-acto刀片)的注射器取芯器;或者,直接放置在x-acto刀片顶部的注射器取芯器。刀片可以有助于将被取芯的样品分成两个或更多个小块,使它们更容易处理和均质化。
食物取芯器200和柱塞130可以由塑料材料制成,包括但不限于,聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚酯(pet)、聚丙烯(pp)、高密度聚乙烯(hdpe)、聚氯乙烯(pvc)、热塑性弹性体(tpe)、热塑性聚氨酯(tpu)、缩醛(pom)、聚四氟乙烯(ptfe)或任何聚合物,以及它们的组合。可以采用耐热、防水和防uv光等的任何材料将柱塞130密封到取芯器上,例如,丁腈橡胶(buna-n)、含氟弹性体、硅酮、乙烯丙烯二烯单体(epdm)弹性体、氯丁橡胶、聚氨酯(pu)和ptfe。检测系统-一次性检测容器
根据本发明,提供至少一个独立的检测容器作为检测系统的一部分。检测容器是一次性的并用于特定的变应原。一次性检测容器被设计用于处理测试样品,从测试样品中提取变应原蛋白,储存反应溶液和检测试剂,使测试样品与检测试剂接触/混合;和/或提供用于荧光信号测量的光学窗口。本发明的一次性检测容器包括一个或多个反应室,在其中进行分析检测测定。即,一次性检测容器仅在样品的变应原测试中使用一次,因此可以由低成本塑料材料制成,例如,透明高密度聚乙烯(hdpe)、聚碳酸酯(pc)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚丙烯(pp)、聚氯乙烯(pvc)、聚苯乙烯(ps)、聚酯(pet)或其他热塑性塑料。因此,可以针对任何特定的所关注的变应原设计一次性检测容器。在一些实施方案中,这些一次性容器可以被设计用于仅针对一种特定的变应原,这可以避免与其他变应原反应的交叉污染。在其他实施方案中,这些一次性容器可以设计用于平行检测测试样品中的两种或更多种不同的变应原。在一些方面,一次性容器可以设计用于平行检测两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种不同的变应原。
如图3a所示,一次性检测容器可以是一次性测试杯300或杯状容器。根据测试杯的一个实施方案,如图3a所示,组装的一次性测试杯300包括杯盖组件210和用于接收测试样品、处理测试样品和使经处理的样品与检测试剂(例如,信号多核苷酸(spn))接触/混合的杯体220。图3b至图3g示出了一次性测试杯300的分解图。图3b示出了标签/最终流体密封件211,其可以告知用户测试杯要检测哪些变应原。图3c示出了具有测试杯端口214的光学窗口/流体密封件216。光学窗口/流体密封件216可以与检测装置100的光学子系统520(图16和图17)对准,以允许信号检测期间光通过。图3d示出了均质器转子240。均质器转子240可以通过端口212插入测试杯300中。图3e示出了杯盖组件210。图3f示出了流动管帽和过滤器组件224。图3g示出了杯体220。除了闭合一次性测试杯300之外,杯盖组件210还具有多种功能(图3a)。如图3a、图3e和图6d所示,杯盖组件210具有三个端口:用于容纳均质器转子240和均质器定子230的转子端口212;用于接收食物取芯器200和接收测试样品的食物取芯器端口213;以及用于将一次性测试杯300连接到流量控制部件(例如,真空或压力导管)的测试杯端口214;以及当将杯盖组件210与杯体220组装在一起形成测试杯300时用于对准和稳定杯盖组件210的装置218(如图6d所示)。
测试杯300包括一个或多个反应室223。所有分析反应都发生在反应室223中。反应室223是经处理的样品与预先存储在测试杯300内的检测试剂混合并生成可检测信号(例如,荧光信号)的地方。一些方面,反应室223可以设计为对照室,根据所实施的检测方法,测量测试样品中的总蛋白质含量。其他方面,根据测定的类型和所测量的检测信号,反应室223可以被设计适于测量其他背景信号。或者,在测试杯的任何部分设置另外的对照室225,例如在杯盖组件210上,如图4b所示。多个反应室223可以设置在测试杯300内的不同位置,包括但不限于,杯盖组件210(图3a、图3e和图4a-4b)、杯体220的侧面或底部(图5a和图5b)、分开的杯体220的单独部分(图7a-7d)。多个反应室223可以具有不同的形状并且彼此不同地定向(图3a,4b,5a和7a-7d)。
在检测系统的一个实施方案中,反应室223包括在杯盖组件210中(图3a-3g和图4a-4b)。在该实施方案中,杯盖组件210还包括流体通道215,用于将经提取的样品溶液带到两个反应室223内(图3a-3g)。通过食物取芯器端口213,经食物取芯器200收集的测试样品可以被投入杯体220中,从而均质化和提取变应原蛋白。通过用于将一次性测试杯300连接到检测装置100的流量控制部件的测试杯端口214,从测试样品中提取的变应原蛋白可以被泵出或压出杯体220并流经流动管221进入流体通道215,然后进入两个反应室223。光学窗口/流体密封件216提供液体密封和光学通路到两个反应室223。标签/最终流体密封件211提供最终的液体密封和识别杯组件(例如,指定谷蛋白表明一次性测试杯300用于检测谷蛋白变应原)。一方面,提供流动管帽和过滤器组件224以防止存储在两个反应室223中的固体试剂变潮湿,以及从均质化的蛋白质和/或缓冲溶液中过滤大颗粒。
在如图3a和图4b所示的一个优选实施方案中,在杯盖组件210中提供两个独立的反应室223,包括一个用于变应原检测反应的分析室,其中提供了对所关注的变应原具有特异性的检测试剂,并且在其中发生变应原检测反应;以及一个用于测量背景信号的对照室,其中提供了用于测量测试样品中的背景信号的化学溶液(如果需要的话)。杯盖组件210顶部的两个反应室223连接到流体通道215,通过该流体通道215将提取的蛋白质溶液流泵入或压入两个反应室223中。对变应原具有特异性的检测试剂和测量反应室223中的背景信号的化学溶液可以是干粉,并且可以与从流动管221和流体通道215流到反应室223的经处理的样品溶液混合。或者,检测试剂和化学溶液可以被重悬于适当的缓冲液中。两个反应室223可以被配置成平行或顺序地接收经处理的样品溶液,但优选为平行。来自变应原分析室的荧光信号(例如,荧光强度和荧光偏振)和来自对照室的背景信号由检测装置100的光学子系统(例如,图16和图17所示的光学子系统520)检测。在一些实施方案中,多于一个的变应原分析室被配置在杯盖组件210的顶部,例如两个,或三个,或四个,或五个,或六个,或七个,或八个,或者更多的变应原分析室,在每个变应原分析室中可以提供对不同变应原具有特异性的检测试剂。在用户对多种变应原过敏的情况下,这种多重设计将允许用户同时检测测试样品中的若干种变应原。一些方面,这些反应室设计用于平行检测反应。也就是说,所有反应可以平行发生。
如上所述并且如图4b所示,在杯盖组件210的顶部可以设计多于两个的反应室223,这在本发明的范围内。在某些实施方案中,在杯盖组件210的顶部可以设计三个或更多个室。在一个特定实施方案中,提供三个室,包括两个反应室223和一个另外的对照室225,其可用于测量来自变应原检测测定的非特异性背景信号。图4b示出了位于杯盖组件210顶部的三个室(两个反应室223和一个对照室225)的示例性配置。本领域技术人员可以理解,该特定配置被显示用于表达非限制的概念。每个室的位置可以根据杯盖组件210的设计而变化,并且数字指示也不是限制性的。每个室可以被指定为分析室,用于检测来自检测试剂和测试样品中所关注的变应原之间的相互作用的信号,或者用于测量从测试样品中分离的总蛋白质的室,或者用于测量检测测定的非特异性背景信号的对照室。三个室可以连接到流体通道215,接收一部分流经流动管221的经处理的测试样品溶液。为了避免不同室之间的干扰(可能导致错误检测结果),可以在流体通道215内添加一个或多个通气孔217(图4b)以防止液体在反应室223之间流动。
在本发明的范围内,一个或多个反应室223和任选的对照室225并不是必须设计在杯盖组件210的顶部。一个或多个反应室223和任选的对照室225可以位于测试杯或杯状容器300的任何部分。除了图3a和图4b所示的配置外,还可以提供替代实施方案。如图5a和5b所示,一个或多个反应室223和/或任选的对照室225(图5a和图5b中未示出)可以位于杯体220的底部,直接接收经过滤膜226过滤之后的测试样品溶液(图5a)。图5b进一步示出了从测试杯300的底部观察的视图。根据该特定实施方案,光学窗口/流体密封件216用于密封反应室223和/或任选的对照室225以提供读取检测信号的窗口。另外,可以提供阀228,允许对经处理的样品溶液的流动进行控制。阀228可以是伞形阀、鸭嘴阀、其他单向阀、易碎密封件等。例如,内部易碎密封件可用于实现样品溶液的受控释放。
或者,一次性测试杯300的杯体220可以分成两个独立的部分(图6a-6d和图7a-7d),一个部分被配置用于接收和处理由食物取芯器200或其他类型采样器收集的测试样品,并从测试样品中提取变应原蛋白,另一个被配置包括一个或多个反应室223和/或任选的对照室225。分开的杯体220的每个部分的形状可以不同。作为非限制性示例,图6a示出了替代的杯体设计220’,其具有用于处理测试样品的三角形部分和用于容纳反应室的矩形部分。图6b示出了另一种替代的杯体设计220”,其具有用于处理测试样品的圆形部分和用于容纳反应室的矩形部分。
如上所述并且如图7a至7d所示,反应室223和任选的对照室225可以被配置在杯体220的两个独立部分之一处。图7a至7d示出了位于杯体220的独立部分之内的反应室223和/或可选对照室225的一些布置示例。反应室223(和任选的对照室225)可以被配置成任何布局,例如,并排(side-by-side)(图7a,从杯子顶部看),如图7b所示的叠加定向,前和后(图7c),或对角线定向(图7d)。
在这方面,测试杯300的杯盖组件210的形状可以与杯体220的形状相匹配。如图6c和6d所示,其杯体220具有两个独立部分的经组装的测试杯300的杯盖组件210包括三个端口212、213和214。也可以包括用于对准和稳定所述组件的装置218。在反应室被容纳在分开的杯体的一个部分内的实施方案中,包括通气孔217和真空端口密封件219的真空垫圈840可以插入杯盖组件210的下面,如图6d的分解图所示。
在一些实施方案中,反应室223和任选的对照室225可以是任何形状,包括但不限于圆形、三角形、矩形和楔形。
为了形成可操作的检测容器即测试杯300,杯盖组件210和杯体220组装在一起。可以包括用于对准和稳定组件的装置(例如,如图6d所示的特征218)。标签/最终流体密封件211连接至经组装的测试杯,例如在杯盖组件210的顶部。标签指示使用测试杯300测试的目标变应原。在一个示例中,当反应室223容纳在杯盖组件210内时,标签/最终流体密封件211连接在光学窗口/流体密封件216的顶部,如图3c所示。在另一个示例中,当反应室223位于杯体220的底部(图5a)或杯体220的两个独立部分之一(图7a-7d)时,标签/最终流体密封件211直接连接到杯盖组件210并且用作测试杯300的最终密封件。
在一些实施方案中,均质器转子240可以连接到杯盖组件210上的转子端口212,如图4a所示。在该特定实施方案中,焊接到转子端口212的如图3a和图3e所示的均质器定子230并不是必需的。均质器转子240可以通过膜密封件250直接连接到杯盖组件210内侧的转子端口212。密封材料可以包括但不限于热塑性聚氨酯(tpu)、热塑性弹性体(tpe)、热固性材料如硅酮、橡胶(如丁腈橡胶(buna-n)、氯丁橡胶(neoprene)和山都平(santoprene))。可以使用二次注塑成型来制造连接的两个部分,其可以由具有不同热塑性和硬度的材料构成。均质器转子240和转子端口212之间的连接也可以使用二次注射成型(over-moldinginjectionmolding)、热焊接、超声波焊接和/或胶合工艺或任何其他适当的模制技术来生产。
测试杯300可以进一步包括过滤器,该过滤器对流入反应室223和任选的对照室225进行变应原检测测试之前的经处理的样品溶液进行过滤。在一些实施方案中,如图3a和图3f所示,流动管帽和过滤器组件224可以连接到流动管221,在递送至反应室223和任选的对照室225之前,对经处理的测试样品进行过滤。或者,流动管帽和过滤器组件224可以用简单的过滤膜226代替,如图5a-5b,8a-8b和9a-9b所示。在一些方面,过滤膜226可以与杯体220的杯底222平行对齐,与杯底222具有一定距离(图8a)。过滤膜226和杯底222之间的空间允许容纳经过滤的样品溶液。在其他方面,过滤膜226可以插入杯体220中,与杯体220的壁平行,并与壁保持一定距离,从而允许足够的空间以在递送(例如,通过泵送或抽真空)至反应室223和任选的对照室225之前容纳经过滤的样品溶液。或者,可以提供从杯体220的侧壁突出的小室227,其中安装有过滤膜226;在递送到反应室223和任选的对照室225之前,小室227用于容纳经过滤的样品溶液(图8b)。
在反应室223和任选的对照室225容纳在分离的杯体220的独立部分中的实施方案中,单个过滤膜226可以插入杯体220底部,位于阀228之下,如图9a所示。然后在流入容纳在杯体220独立部分中的反应室223和任选的对照室225之前对经处理的样品溶液进行过滤。
一些方面,两个或更多个过滤膜226被插入杯体220中。过滤膜226被组装以形成过滤阶段。在图9b所示的一个示例中,一个过滤膜226可以位于杯体220的中间,以在被驱动通过阀228之前过滤经处理的样品溶液;另一个过滤膜226配置在杯体的底部,从而在流入反应室223和任选的对照室225之前对经处理的样品溶液进行再过滤。一些方面,顶部过滤膜226的孔径可以大于位于底部的滤膜226的孔径。
过滤膜226可以是尼龙、pes(聚醚砜)、porextm、或膜聚合物例如混合纤维素酯(mce)、醋酸纤维素、ptfe、聚碳酸酯等。它可以是具有高孔隙率的薄膜(例如,150μm厚)。一些方面,过滤膜226的孔径可以在20μm至300μm的范围内,或位于之间的任何尺寸。例如,孔径可以是20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、100μm、150μm、200μm、250μm或300μm。
杯盖组件210可由热塑性材料构成,包括但不限于聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚苯乙烯(ps)、聚碳酸酯(pc)、聚酯(pet)、聚丙烯(pp)、高密度聚乙烯(hdpe)和聚氯乙烯(pvc)、或其组合。
杯体220用于接收来自食物取芯器200的测试样品,进行均质化以提取变应原蛋白质,并且可具有连接到杯盖组件210的更宽的远端和杯底222(图3g)。在某些实施方案中,杯体220含有一定体积的提取缓冲液,用于提取和消化测试样品。提取缓冲液的体积可以为约100μl至约500μl,或约500μl至约2.5ml。在杯中,消化体积应为500μl-5ml。在检测室中,其应在10μl至300μl的范围内。在一些实施方案中,缓冲液的体积可以是100μl、或200μl、或300μl、或400μl、或500μl、或1ml、或1.2ml、或1.4ml、或1.6ml、或1.8ml、或2.0ml、或2.5ml。
在本发明的其他实施方案中,变应原检测反应可以发生在杯体220中,并且荧光信号将由检测装置100的光学子系统(例如,光学子系统520)检测。因此,杯体220可包括特异性结合待测的一种或多种变应原的检测分子(例如,spn)。检测试剂可以被限制在杯体220的任何局部区域中,例如在杯底222的底部,释放到杯体中并与提取的蛋白质溶液混合用于检测测定。可以将变应原和检测试剂混合物泵送或压入反应室223和任选的对照室225中进行信号分析。
通常,一次性测试杯300具有适合于约0.25-5g样品的容量。旨在用于使测试样品在提取缓冲液中分解/均质化的杯体220可具有约0.5ml-10ml的容量。
在其他实施方案中,杯体220可以由柔软材料制成。在这种情况下,在插入测试样品之后,可以通过外部压力,例如来自检测装置100的压力,将包括内部溶液的杯体220压入杯盖组件210顶部的一个反应室223中。所述压力,压缩或搅拌也可用于处理测试样品。
如本领域技术人员所预期的,本发明的一次性检测容器,例如,如本文所公开的测试杯300,不限于其在本检测系统中的使用。可以进一步改进检测容器以在其他类似的分析物检测系统(例如,蛋白质、核酸和其他分子)中操作。
检测系统-检测装置
在一些实施方案中,检测装置100可以被配置为两个部分:外壳,其为检测装置100的部件提供支撑表面;和可以打开检测装置100以插入一次性测试杯300和食物取芯器200的部分。根据本发明的变应原检测装置100的一个实施方案如图1a-1b,10a-10b,11和12a-12b所示。如图1a和图1b所示,检测装置100包括外壳10,外壳10提供支撑以将检测装置100的部件容纳在一起并将它们集成为用于实施变应原检测测试的功能性整体;抽屉组件20,其可以从外壳10中拉出并滑回外壳10。外壳10可以由塑料或其他合适的支撑材料制成。
如图10a所示,外壳10可包括壳盖310和壳底座320,在壳底座320上有用于执行/操作按钮40的按钮端口40a,以及用于开/关滑块30的开/关滑块端口30a。另外,对准装置340可以位于外壳10的顶部前端上的对准部位340a中,当实施变应原检测测试时使一次性测试杯300与检测装置100对准。在壳底座320的底部的每侧具有凹槽330用于使抽屉组件20滑动。抽屉组件20(图10b)可包括抽屉框架22和供插入一次性测试杯300的抽屉孔/端口23,抽屉框架22的前部具有抽屉把手21,其被配置用于在检测测试期间供用户操作抽屉组件20。在抽屉框架22的每一侧设置有滑板(或凸边)350,使抽屉组件20沿着壳底座320的凹槽330滑动。
当检测装置100未被使用时,抽屉组件20被推回到壳体10中,因此检测装置100被关闭并且易于携带或存储在包(例如,手提包)中。
或者,可以根据本发明设计可实现的允许抽屉孔/端口23容纳一次性测试杯300的其他结构。作为非限制性示例,爪状旋转门410可以连接到外壳10(如图11所示)。具有爪状旋转门410的检测装置100可以放置在一次性测试杯300上方,在操作期间在杯子上方闭合。作为另一个非限制性示例,可以设计一个能够提升的铰链门,用于在变应原检测测试期间打开外壳10。
为了实施变应原检测测试,检测装置100设置有均质器,该均质器被配置使测试样品均质化并从提取缓冲液中的测试样品中提取变应原蛋白;操作均质器的装置(例如马达)以及将马达和均质器连接的必需连接件;在变应原检测测试过程中驱动和控制经处理的样品溶液的流动的装置;光学子系统,用于提供荧光激发和对发射的荧光进行过滤;用于检测测试样品中的变应原和检测试剂之间的检测反应所发出的荧光以及对照室的背景信号的装置;用于可视化检测信号的装置,包括转换和数字化检测到的信号;显示测试结果的用户界面;和电源。在一些实施方案中,用不能结合靶变应原的荧光团染料(例如,随机适体)探针标记的分子可以储存在对照室中。该非结合分子提供了对粘度和温度影响进行校正的手段。通过测量读数值和预期值之间的差异并用它来衡量活性反应室的测量值。
在本发明的一个实施方案中,如图12a和12b所示,集成在一起进行检测测试的检测装置100的部件包括可以连接至组装在杯体220(未示出)内部的均质器组件570的马达510,连接至一次性测试杯300内的反应室223(未示出)的光学子系统520,在变应原检测测试的均质化期间驱动转子的齿轮系/驱动台板530,控制和调节流速的泵540,pcb550和电源560。所述部件容纳在抽屉组件20内,抽屉组件20可以具有抽屉把手21。检测装置由壳盖310和壳底座320包围。图12a示出了检测装置100的不同部件,而图12b示出了当不同部件与食物取芯器200和测试杯300一起被组装和集成成功能装置时的检测装置100的视图。
根据本发明,均质器设计得足够小以适合一次性测试杯300。另外,可以优化检测装置100的均质器,以增加样品均质化和变应原蛋白质提取的效率。
图13a示出了位于杯体220内的经组装的的试验板均质器组件570及其部件。图13b-13e示出了齿轮头610、耦合器630、均质器定子230和均质器转子240。均质器转子240和均质器定子230通过杯盖组件210顶部的转子端口212组装(未示出,见图3a)在一起。均质器转子240的远端具有顶部转子帽660,其近端包括一个或多个转子叶片670或其等同物(图13e)。转子帽660可以连接至转子端口212(未示出),并且均质器转子240通过转子端口212(未示出)插入杯盖组件210(未示出)中。均质器转子240被配置在均质器定子230内部旋转,并将测试样品从食物取芯器200(未示出)带入处理室690的底部。均质器定子230的远端设置有定子帽64,其近端包括一个或多个小定子槽650(图13d),所述定子槽延伸到杯体220中。通过定子帽640,均质器定子230被安置在杯盖组件210的转子端口212内(未示出)。在处理期间,测试样品被径向地推出通过均质器定子230近端的定子槽650。均质器定子230作为流动断路器,从而极大地防止样品旋转,并且将大的机械能引入小空间。位于均质器远端的耦合器630(图13c)将均质器转子240连接至齿轮头610(图13b),齿轮头610是齿轮系或驱动器的一部分,用于连接到马达510(未示出,参见图12b和图14)。齿轮头610降低电动机510的速度并增加液体中的扭矩,耦合器630将致动器轴620连接至均质器转子240。均质器的近端部分(即,转子叶片670和定子槽650)在杯体220内旋转,以在均质器定子230的固定齿和均质器转子240的旋转齿之间的液体中产生剪切(图13a)。涡流大大减小,并且在转子和定子之间的剪切间隙中引入更多的能量。通过撞击锋利的边缘,在转子叶片的边缘和定子槽之间剪切,颗粒的尺寸被降低。
在一些方面,可以提供加热系统(例如电阻加热或珀耳帖加热器)以提高均质化的温度,因此增加样品解离的有效性并缩短处理时间。温度可以升高到60℃至95℃之间,但低于95℃。升高的温度还可以促进检测分子和被检测的变应原之间的结合。可选地,可以提供风扇或珀耳帖冷却器以在实施测试之后快速降低温度。
转到图14,在本发明的一些实施方案中,马达510可通过马达梭710连接至均质器组件570(未示出),以使均质器转子240(未示出)和均质器定子230(未示出)接合。穿过马达梭710上的销端口680a的穿梭垂直导引销680将均质器组件570的齿轮头610和致动器轴620导引至马达510。马达梭升降销720通过升降销端口720a可进一步对准和升高/降低马达梭710和马达510。
在样品处理杯体220中,预装在杯中的提取缓冲液和从食物取芯器200中投入的测试样品混合。在马达510的驱动下,均质器组件570将提取缓冲液中的测试样品均质化,并分离/提取变应原蛋白。经处理的样品溶液可以通过流动管221被泵送或压入杯盖组件210上的流体通道215,然后流至反应室223之一的分析室中,其中经处理的样品溶液与预装的检测分子(例如,spn)混合进行检测测试。平行地,将一部分经处理的样品溶液泵送或压入另一个对照室,该另一个对照室是杯盖组件210顶部的反应室223之一,在其中测量提取溶液作为背景信号。
在一些实施方案中,在提取液流入反应室223之前,经处理的测试样品可以通过能够推动经处理的样品溶液通过过滤膜的装置(例如,连接至均质器组件570的过滤装置)进一步过滤。一个示例是图3f中所示的流动管帽和过滤器组件224。过滤器孔可以在0.2u至300u之间。过滤器可以由任何低粘合材料制成,包括但不限于,pes(聚醚砜)、pcte(聚碳酸酯)或pvdf(聚偏二氟乙烯)。
在一些实施方案中,在耦合器630在耦合器630的每端具有不同的尺寸,或在耦合器630的每端具有相同尺寸。
与具有类似结构设计的其他均质器(例如,美国专利号6398402)相比,本发明的定制刀片芯旋转、拉动、迫使食物进入定制帽的齿形表面。定制o形圈使定制帽和定制杯之间密封,可以清楚地显示均质化进程和结果。均质器转子可以由任何热塑性塑料制成,包括但不限于,聚酰胺(pa)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(abs)、聚碳酸酯(pc)、高抗冲聚苯乙烯(hips)和乙缩醛(pom)。
在一些实施方案中,均质器组件570可以针对不同类型的测试样品的不同均质化机制进行设计和修改,以满足特定要求,例如添加机械帮助以分解食物,包括研磨、切割、混合、刮擦或混合动作。在一些方面,均质器可包括提高均质器搅拌的装置(例如,定子和取芯器)。均质器可具有“星形旋钮”式手柄,其可被扭动以帮助取芯。定子/取芯器的手柄可以设计为草药研磨机(边缘周围具有纹理带);或药丸破碎机(带3个花形(flowerette)旋钮);或药丸破碎机(带两个翼状旋钮)。在其他方面,定子/取芯器可以是物理定子(objectstator)(例如,1mm厚)、ppe注射器取芯器、细微平面(microplane),粗微平面和粉碎机,珠磨研磨器(beadbeating)(大理石搅拌器或钢球搅拌器)。在其他实施方案中,均质器可以是具有混合工艺的混合物,以分离测试样品,例如通过研磨和混合。
在一些实施方案中,马达510可以是市售马达,例如,maxon马达系统:maxonre-max和/或maxona-max(maxonmotorag,sanmateo,ca,usa)。
在一些实施方案中,齿轮系或驱动器可用于将马达510连接至均质器组件570。齿轮系和/或驱动器使得马达510被包装,由此不会干扰食物取芯器200将食物样品引入均质器组件570的能力,同时使得均质器定子230从上方被驱动,在操作期间不需要液体密封。标签/最终流体密封件211在邻近定子帽640周围的区域设置有施加的标签或其他可移除密封件。齿轮系或驱动器还可允许来自马达510的动力进行两个直角转弯,因此其对于检测装置100的用户体验和一次性测试杯300的功能要求的特定组合是至关重要的。
测试样品在提取缓冲液中处理,用于蛋白质提取和变应原回收。在一些实施方案中,可以优化提取缓冲液以提高蛋白质的提取。提取缓冲液可以包含用于不同测试样品的不同试剂,例如申请人的pct申请系列号pct/us2014/062656中所公开的,其内容通过引用整体并入本文。
根据本发明,提供了一种驱动和控制经处理的样品溶液的流动并将所述提取溶液与一种或多种检测信号分子混合的装置。在一些实施方案中,该装置可以是真空系统或外部压力。作为非限制性示例,该装置可以是台板(例如,焊接塑料翻盖),其被配置成多功能的,因为其可以支撑齿轮系的轴,其可以提供从泵施加至一次性测试杯300的杯盖组件210上的测试杯端口214的真空提供管道(密封的空气通道)。
参见图15a和图15b,齿轮系/驱动台板530可具有下部,泵(例如,压电微泵(piezomicropump))540连接到该下部;设置有真空导管850的顶部,该真空导管850连接至一次性测试杯300的杯盖组件210(未示出)顶部上的测试杯端口214(如图3c所示);和空气通道860。齿轮系/马达端口810被配置连接至齿轮系或驱动器,所述齿轮系/驱动器连接至马达510(未示出)和均质器组件570(未示出)。在齿轮系/驱动台板530边缘处的齿轮系/杯端口830被真空垫圈840围绕,真空垫圈840为杯盖组件210顶部的测试杯端口214(图3c中所示)和齿轮系/杯端口830之间的连接提供密封。通过来自光学子系统520(未示出,如图16和图17所示)的主动反馈,或通过流体机械装置,例如小孔或疏水膜,流动控制端口820对提取蛋白质溶液从杯体220(未示出)至反应室223(未示出)的流动提供控制。
泵540,例如压电微泵(takasagoelectric,inc.,nagoya,japan)可用于控制并自动调节流动至目标流量。通过改变驱动器电压或驱动频率可以调节泵的流量。图15a中所示的泵540是目前市场上的压电泵的图示,其规格指示了它们适于将过滤的样品溶液带入两个反应室223和任选的对照室225所需的等分功能。泵540可以是真空泵或设计用于实验室用途的其他小型泵,例如kbf泵(knfneuberger,trenton,nj,usa)。
真空垫圈840为齿轮系/驱动台板530和位于杯盖组件210顶部的测试杯端口214之间提供密封。在一些实施方案中,真空垫圈840也可以结合至一次性测试杯300,以增加检测装置100的可靠性。空气通道860也可以用分散的管和配件来实现。样品流动管221与流体通道215和反应室223分开,使得缓冲溶液的蒸发不会通过诸如帽、鸭嘴阀、伞形阀、锥形阀、x-fragm(minivalve)或类似装置过早地溶解反应物。必须控制任何所述阀的开启压力,从而在操作期间打开,但在储存/运输期间不会因为杯中空气的膨胀而打开。在一些方面,真空垫圈840直接位于杯盖组件210的下方,如图6d所示。真空垫圈840包括食物取芯器端口213和转子端口212,它们与盖的相应端口对齐;一个或多个通气孔217和用于密封盖的测试杯端口214的真空端口密封件219。
本发明的检测装置100包括光学子系统,其检测由样品中的变应原和检测试剂(例如,spn)之间的相互作用所产生的信号(例如,荧光信号)。取决于待检测的荧光信号的类型,光学子系统可包括不同的组件和可变的配置。光学子系统邻近检测容器,例如上文讨论的测试杯300的反应室223和任选的对照室225,并且与之对齐。这样,光学子系统可以邻近反应室223的光学窗口/流体密封件216并与之对齐(如图3c所示)。
根据本发明,由检测试剂和测试样品中的变应原之间的相互作用产生的可检测信号可以是荧光信号,包括但不限于吸光度、荧光强度、发光、时间-分辨荧光(trf)和荧光偏振(fp)。一方面,当变应原蛋白与荧光团探针标记的spn结合时,来自测试样品中的变应原与检测试剂之间的结合相互作用的可检测信号可以是荧光探针例如荧光团标记的信号传导多核苷酸(spn)的荧光偏振(fp)的变化。因此,组装光学子系统以测量荧光偏振(fp)。
如本文所用,术语“荧光偏振(fp)”是指与如下观察有关的现象:如果荧光分子被偏振光激发,如果该分子在激发和发射之间保持静态,则随后发射的光也将在固定平面内偏振。大化合物(例如,蛋白质)与荧光标记的试剂的结合改变了荧光分子的旋转,导致荧光寿命期间荧光偏振的变化,荧光寿命是指激发光子吸收和光子通过荧光发射之间的时间段。(checovich等,fluorescencepolarization-anewtoolforcellandmolecularbiology,nature,1995,375:254-256;其内容通过引用整体并入本文。)荧光分子的荧光偏振的测量已经在生物医学领域中广泛应用,其中基于fp技术开发了许多用于测定特定生物化合物的各种测定法。该方法快速,灵敏,准确。
根据本发明,如图16和图17所示,可以包括被配置用于测量荧光偏振的光学子系统520作为检测装置100的检测器。多于一个的偏振滤光器(即偏振器)包括在光路中。
图16示出了用于测量fp信号的光学子系统的配置。检测装置100的光学子系统520与反应室223和任选的对照室225连接。光学子系统520包括激发光路,其包括容纳在led外壳(未示出)中的发光二极管(led)或二极管激光器910(例如luxeonrebelled的avagoled)、激发滤光器920、激发偏振滤光器930;发射光路,包括发射滤光器940,可选的分束器970,一对发射偏振滤光器或膜960,和一对光电二极管或光电倍增管(pmt)(光电检测器)950。激发光路和发射光路与杯盖组件210或杯体220内的反应室223和可选的对照室225对准。激发和发射光路都包含光束整形和准直光学系统。
led或二极管激光器910通过激发滤光器920所提供的光的激发波长适于激发信号传导多核苷酸的荧光团。led可具有不同的形状,例如灯泡或盘状。然后通过使光通过激发偏振滤光器930使其平面偏振。所得到的平面偏振激发光被引导到反应室223和任选的对照室225中。光led或二极管激光在垂直或水平方向上被偏振。荧光团探针标记的检测试剂被激发,并重新发射荧光,顺序通过发射滤光器940,可选的分束器970和发射偏振滤光器或膜960,并由光电检测器950检测。发射滤光器940只允许反应室223所发出的荧光中的所关注的波长通过,从而光电检测器950检测,并在检测之前阻断光散射和非特异性荧光。一对发射偏振滤光器或膜960和光电二极管或光电倍增管(pmt)(光电检测器)950彼此以90°角布置。该对发射偏振滤光器或膜960以每个光电检测器950的相反方向使反应室223重新发出的光偏振。或者,可以在发射光被检测之前将分束器970插入发射光路中。来自检测器(例如,光谱仪和照相机)的信号可以被转换为数字信号或作为模拟信号处理,并且对应于该信号的变应原的量在相应的显示窗口60中指示(未示出,参见图1b),其用作用户界面屏幕。
在如图17所示的替代配置中,用于fp测量的光学子系统包括相同的光学部件:容纳在led外壳(未示出)中的发光二极管(led)或二极管激光器910(例如,luxeonrebelled的avagoled)、激发滤光器920、激发偏振滤光器930、挡板1120、发射滤光器940、一对发射偏振滤光器或膜960和一对光电二极管或光电倍增管(pmt)(光电检测器)950。该对发射偏振滤光器或膜960和光电检测器950平行设置。
如本文所用,术语“偏振器或偏振滤光器”是指光学滤波器(例如,棱镜),其使特定偏振的光通过并阻挡其他偏振的波。它可以将未定义或混合偏振的光束转换为具有明确偏振的偏振光束。通常使用的偏振器包括线性偏振器和圆形偏振器。线性偏振器可以分为两大类:吸收偏振器,其中不需要的偏振态被装置吸收,和分束偏振器,其中非偏振光束被分成具有相反偏振态的两个光束。
在一些实施方案中,发射光路中的两个偏振器可以是交叉偏振器,如图17所示。交叉偏振器是两个线性偏振器,其透射方向呈直角放置以消除所有光。
集成到光学子系统520中的led可以是avagoled(avagotechnologies,sanjose,ca,usa),或luxeonrebelled(luxeonled,ontariocanada)。
上述光学子系统520是某些实施方案的说明性示例。在一些实施方案中,它们可以具有不同的配置和/或不同的部件。在一些实施方案中,光学组件或替代光学组件可以与吸光度测量组件配置在一起。在这种配置中,某些部件,例如反应室,激发源(led或二极管激光器);检测器(例如光电二极管或pmt),滤光器和/或其他部件可由组件共享。
如图18所示,印刷电路板(pcb)550连接至光学子系统520和分析室(即反应室223)。pcb550可以被配置为紧密结合检测装置100的尺寸,同时可以提供足够的空间来显示测试结果。
因此,可以使用背光图标(backliticon)、led或lcd屏、oled、分段显示器或在连接的移动电话上显示测试结果。用户可以看到指示器,表明样品正在处理、样品被完全处理(总蛋白质指示剂)和测试结果。用户还可以查看电池的状态以及他/她放在装置中的盒子类型(盒子或led组件上的条形码)。测试结果将显示为例如1)实际ppm或mg数;或2)二进制结果是/否;或3)风险分析-高/中/低或高/低,存在风险;或4)小于1/1-10ppm/大于10ppm的ppm范围;或5)小于1mg/1-10mg/大于10mg的mg范围。结果也可能显示为数字、颜色、图标和/或字母。根据本发明,检测装置100还可以包括其他特征,例如用于提供电源的装置和用于提供对过程的控制的装置。在一些实施方案中,提供一个或多个开关以将马达、微型泵和/或齿轮系或驱动器连接至电源。开关可以是简单的微动开关,其可以通过连接和断开电池来打开和关闭检测装置。
电源560可以是锂离子aa型电池或适用于支持小型医疗设备的任何市售电池,例如rhino610电池,turntigynanotechhigh可充电lipo电池或pentaxd-l163电池。
本发明的检测试剂
特异性识别变应原蛋白的分子可用于本发明,例如本发明人开发的抗体、核酸分子(例如适体)和spn。在一些实施方案中,本发明还提供了信号传导多核苷酸(spn),其衍生自特异性结合变应原的适体。spn可以在核酸序列的一端(即5’端或3’端)用荧光团标记物标记。
适体
虽然已经开发了多种用于变应原检测的商业分析方法,但是它们中的大多数依赖于基于抗体的免疫测定。作为变应原检测的检测试剂的抗体具有很好的特异性。然而,免疫测定耗时,需要专业人员来读取测试结果,难以小型化,并且不是完全标准化。此外,免疫测定方法通常会导致假阳性结果,这通常归因于基质和交叉反应性。在食品安全控制的背景下,近来关于基于适体的分析的综述之一表明,正在对针对该组成分的适体进行选择(amaya-gonzález等,sensors2013,13:16292-16311,其全部内容通过引用并入本文)。
如本文所用,术语“适体”是指一类小的单链核酸物质,其通过重复轮次的体外选择或等效的selex(通过指数富集的配体的系统演进)进行工程化,折叠成确定的三维结构,以结合各种分子靶标,如小分子、蛋白质、核酸、甚至细胞、组织和生物体。其对靶分子的结合特异性和高亲和力、环境温度下的灵敏度和再现性、相对较低的生产成本、以及开发出能够识别任何蛋白质的适体核心序列的可能性,保证了本文所述的检测装置的传感器进行有效但仍简单的测定。
适体特别适于为检测试剂提供核心/结合序列,其原因在于,selex(通过指数富集的配体的系统演进)过程(下文描述)的迭代方法可用于产生针对基本上任何分子靶标(或其部分)的适体。这些适体对其靶标具有高亲和力和结合特异性。本发明人已经认识到,使用适体作为核心/结合序列生成信号传导多核苷酸(spn)(下文详细描述)允许与各种报告分子的方便连接。对于开发用于生物分子传感器的简单但有效的测定目的而言,基于适体核心/结合序列的信号传导多核苷酸的相对低生产成本也是有利的。本发明人已经认识到,采用基于适体的检测器序列(例如信号传导多核苷酸)可以方便地实现各种食品基质中的变应原检测,所述检测器序列特别适用于在环境温度下可以高灵敏度和再现性重复使用、简单且便携的传感器,从而确保食品安全。
最近的综述描述了使用适体开发的用于控制病原体、变应原、掺杂物、毒素和其他禁用污染物以确保食品安全性的分析策略(amaya-gonzalez等,aptamer-basedanalysis:apromisingalternativeforfoodsafetycontrol,sensors,2013,13:16292-16311;amaya-gonzalez等,aptamerbindingtocoelicdisease-triggeredinghydrophobicproteins:asensitiveglutendetectionsystem.anal.chem.2014,86(5):2733-2739;每一个的内容通过引用整体并入本文中)。amaya-gonzalez等人于2013年6月28日提交的pct/es2013/000133中描述了一种检测谷蛋白的方法,其内容通过引用整体并入本文。
作为非限制性示例,已经报道了体外选择对过敏性毒性变应原、β-蓝豆蛋白(β-conglutin)、lupan1具有特异性的单链dna适体的方法(nadal等,dnaaptamersagainstlupan1foodallergen.plosone,2012,7(4):e35253;其内容通过引用整体并入本文)。简而言之,来自羽扇豆的β-蓝豆蛋白亚基被纯化并与磁珠化学交联。采用肽质量指纹以确保珠表面上β-蓝豆蛋白的存在。使用硫代磷酸酯化的正向引物和t7基因6外切核酸酶扩增具有1014群体变异性的dna文库池,以产生单链93-merdna序列。将文库池与蛋白质缀合的磁珠一起孵育。采用pcr监测每轮selex,比较从蛋白质缀合的珠子释放的dna的量与从未缀合的珠子获得的dna的量。采用酶联寡核苷酸测定(elona)和表面等离子共振(spr)监测演进。在15轮selex后,克隆富集的dna,测序并鉴定共有基序,评估这些基序的亲和力和特异性,并预测它们的二级结构。采用竞争性elona评估所得适体,以检测和定量β-蓝豆蛋白羽扇豆变应原。由此,选择kd为3.6×10-7的原始93-mer,并截短成kd为1.7×10-9的11-mer(nadal等,probinghigh-affinity11-merdnaaptameragainstlupan1(β-conglutin),anal.bioanal.chem.,2013,405:9343-9349;其内容通过引用整体并入本文)。该截短的11-mer富含鸟嘌呤,并预测折叠成g-四元结构,由堆积的鸟嘌呤四联体组成,其通过鸟嘌呤之间的hoogsteen型氢键和四联体之间的阳离子的相互作用来稳定。最近报道了一种利用荧光共振能量转移(fret)对lupusan1进行快速、灵敏检测的灵敏方法,其采用截短的11-mer抗β-蓝豆蛋白适体的高亲和力二聚体形式,每个单体适体的侧边为供体/受体部分。在没有靶标的情况下,由于从激发的荧光团至近端第二荧光团的fret,二聚体形式产生荧光发射。然而,加入β-蓝豆蛋白后,特异性相互作用诱导双-适体结构的变化,导致荧光发射的增加。该方法具有高度特异性和灵敏度,检出限为150pm,提供了在室温下仅1分钟内直接检测食品中有毒β-蓝豆蛋白亚基的有效工具(mairal等,fret-baseddimericaptamerprobeforselectiveandsensitivelupan1allergendetection,biosensorsandbioelectronics,2014,54:207-210;其内容通过引用整体并入本文)。
核酸适体(dna或rna)通常通过重复轮次的体外选择或等效地selex(通过指数富集的配体的系统演进)进行工程化以结合各种分子靶标,例如小分子、蛋白质、核酸、甚至是细胞、组织和生物体。核酸适体通过除经典watson-crick碱基配对之外的相互作用对分子具有特异性结合亲和力。核酸适体,如噬菌体展示产生的肽或单克隆抗体(mab),能够特异性结合选定的靶标,并通过结合阻断其靶标的功能。
通常称为“化学抗体”的适体具有与抗体相似的特征。典型的核酸适体大小约为10-15kda(20-45个核苷酸),以至少纳摩尔亲和力结合其靶标,并区分密切相关的靶标。
适体可以是单价或多价。适体可以是单体、二聚体、三聚体、四聚体或更高的多聚体。单个适体单体可以连接形成多聚体适体融合分子。作为非限制性示例,可以设计连接寡核苷酸(即接头)以包含与随机适体的5'-臂和3'-臂区域互补的序列,形成二聚体适体。对于三聚体或四聚体适体,工程化小的三聚体或四聚体(即holiday结合样)dna纳米结构以包括与随机适体的3'-臂区互补的序列,由此通过杂交产生多聚体适体融合。此外,可以将富含3至5或5至10dt的核苷酸工程化为接头多核苷酸,作为适体结合基序之间的单链区域,其为多个适体提供了灵活性和自由度,以协调和协同与细胞配体或受体的多价相互作用。
或者,也可以通过将生物素化的适体与链霉亲和素混合形成多聚体适体。
如本文所用,术语“多聚体适体”或“多价适体”是指包含多个单体单元的适体,其中每个单体单元其自身可以是适体。多价适体具有多价结合特征。多聚体适体可以是同源多聚体或异源多聚体。术语“同源多聚体”是指包含多个相同类型的结合单元的多聚体适体,即每个单元结合相同靶分子的相同结合位点。术语“异源多聚体”是指包含多个不同类型结合单元的多聚体适体,即每个结合单元结合相同靶分子的不同结合位点,或每个结合单元结合不同靶分子上的结合位点。因此,异源多聚体可以指在不同结合位点结合一个靶分子的多聚体适体或结合不同靶分子的多聚体适体。与不同靶分子结合的异源多聚体也可以称为多特异性多聚体。
核酸适体包含一系列连接的核苷或核苷酸。在最广泛的意义上,术语“核酸”包括任何包含核苷酸聚合物的化合物和/或物质。这些聚合物通常称为多核苷酸。本发明的示例性核酸分子或多核苷酸,包括但不限于,d-或l-核酸,核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、苏糖核酸(tna)、二醇核酸(glycolnucleicacid,gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna,包括具有β-d-核糖构型的lna、具有α-l-核糖构型的α-lna(lna的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-lna,和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-lna),或其杂合物。
本领域技术人员将认识到术语“rna分子”或“核糖核酸分子”不仅包括在自然界中表达或发现的rna分子,还包括包含如本文所述或本领域已知的一种或多种核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的rna类似物和衍生物。严格地说,“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖,“核糖核苷酸”是具有一个、两个或三个磷酸基团的核糖核苷。然而,术语“核糖核苷”和“核糖核苷酸”在本文中可以认为是等同的。可以在核碱基结构、核糖呋喃基环或核糖-磷酸主链中修饰rna。
核酸适体可以是核糖核酸、脱氧核糖核酸或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。适体可以是单链核糖核酸、脱氧核糖核酸或混合的核糖核酸和脱氧核糖核酸。
在一些实施方案中,适体包含至少一种化学修饰。在一些实施方案中,化学修饰选自核酸在糖位置处的化学取代,磷酸位置处的化学取代和碱基位置处的化学取代。在其他实施方案中,化学修饰选自掺入经修饰的核苷酸;3'加帽;与高分子量、非免疫原性化合物结合;与亲脂性化合物结合;将硫代磷酸酯掺入磷酸骨架中。在优选的实施方案中,高分子量、非免疫原性化合物是聚亚烷基二醇,更优选是聚乙二醇(peg)。peg与另一种分子(通常是药物或治疗性蛋白质)的共价结合的过程称为peg化。通常将peg的反应性衍生物与靶分子一起孵育来实现peg化。peg与药物或治疗性蛋白质的共价连接可以使药剂躲避宿主的免疫系统,从而降低免疫原性和抗原性,并增加药剂的水动力学大小(hydrodynamicsize,溶液中的大小),通过降低肾脏清除率来延长其循环时间。peg化还可以为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。
在另一个优选的实施方案中,3'帽是反向的脱氧胸苷帽。
在一些实施方案中,提供核酸适体,其中p(o)o基团被p(o)s(“硫代”)、p(s)s(“二硫代”)、p(o)nr2(“酰胺化物”)、p(o)r、p(o)or'、co或ch2(“甲缩醛”)或3'-胺(-nh-ch2-ch2-)取代,其中每个r或r'独立地为h或取代或未取代的烷基。连接基团可以通过-o-、-n-或-s-连接与相邻的核苷酸连接。核酸适体中的所有连接并不需要都相同。
作为非限制性示例,核酸适体可包括d-核糖或l-核糖核酸残基,并且还可包括至少一种经修饰的核糖核苷,包括但不限于2'-o-甲基修饰的核苷,包含5'硫代磷酸酯基团的核苷、与胆固醇基衍生物或十二烷酸双十二烷基酰胺基团连接的末端核苷、锁核苷、非碱性核苷、反向脱氧核苷或反向核糖核苷、2'-脱氧-2'-氟代修饰的核苷、2'-氨基修饰的核苷,2'-烷基修饰的核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯或包含核苷的非天然碱基,或其任何组合。或者,核酸适体可包含至少两个经修饰的核糖核苷,至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个修饰的核糖核苷,直至分子的整个长度。对于核酸分子中的多个经修饰的脱氧核糖核苷或核糖核苷中的每一个,所述修饰并不需要相同。
基于核酸的检测试剂可包括核碱基(本领域通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用,“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基即腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g),以及嘧啶碱基即胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。经修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基,例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羟甲基胞嘧啶,黄嘌呤,次黄嘌呤,2-氨基腺嘌呤,腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物,腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶,6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶,5-尿嘧啶(假尿嘧啶),4-硫尿嘧啶,8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤,5-卤素(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶,7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤,8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤,7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤,3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的,modifiednucleosidesinbiochemistry,biotechnologyandmedicine,herdewijn,p.ed.wiley-vch,2008中公开的;在theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering,第858-859页,kroschwitz,j.l,ed.johnwiley&sons,1990中公开的,englisch等人在angewandtechemie,internationaledition,1991,30,613中公开的,以及sanghvi,ys.,第15章,dsrnaresearchandapplications,第289-302页,crooke,st和lebleu,b.,ed.,crcpress,1993中公开的。
适体的合适核苷酸长度可以为约15至约120个核苷酸(nt),在各种其他优选实施方案中,长度为15-30nt、20-25nt、50-120nt、30-100nt、30-60nt、25-70nt、25-60nt、40-60nt、25-40nt、30-40nt,15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40nt或40-70nt中的任何一个。然而,序列的设计可以具有足够的灵活性,使得其可以适应适体与本文所述距离的两个靶标之间相互作用。
在一些实施方案中,核酸适体包含双链特征的一个或多个区域。所述双链区可以源自内部自身互补或与第二种或另外的适体或寡核苷酸分子的互补。在一些实施方案中,双链区的长度可以是4-12、4-10、4-8个碱基对。在一些实施方案中,双链区可以是5、6、7、8、9、10、11或12个碱基对。在一些实施方案中,双链区可以形成茎区。所述具有双链特征的延伸茎区可用于稳定核酸适体。如本文所用,术语“双链特征”是指在任何长度的两个核酸分子上,它们的序列形成超过50%长度的碱基配对(标准或非标准)。
可以进一步修饰适体以提供对核酸酶和其他酶活性的保护。适体序列可以通过本领域已知的任何合适的方法进行修饰。例如,硫代磷酸酯可以掺入主链中,5'-修饰的嘧啶可以包括在dna适体的ssdna的5’端。对于rna适体,可以使用t7rna聚合酶突变体将修饰的核苷酸(例如核糖主链的2'-oh基团被例如2'-脱氧-ntp或2'-氟-ntp取代)掺入rna分子中。可以将它们与纯化的核酸酶或来自小鼠血清的核酸酶一起孵育,来测试所述经修饰的适体对核酸酶的抗性,并通过凝胶电泳分析适体的完整性。
在一些实施方案中,所述经修饰的核酸适体可完全由修饰的核苷酸合成,或用经修饰的核苷酸的一部分合成。修饰可以相同或不同。所有核苷酸都可以被修饰,所有都包含相同的修饰。所有核苷酸可以被修饰,但含有不同的修饰,例如,含有相同碱基的所有核苷酸可以具有一种类型的修饰,而含有其他碱基的核苷酸可以具有不同类型的修饰。例如,所有嘌呤核苷酸可具有一种类型的修饰(或未修饰),而所有嘧啶核苷酸具有另一种不同类型的修饰(或未修饰)。这样,采用本文公开的任何修饰组合产生寡核苷酸或寡核苷酸文库。
根据本发明,selex方法用于选择结合8种主要食物变应原(即腰果、蛋、奶、花生、面筋、鱼、甲壳类动物和大豆)的核心结合适体。选择具有可特异性识别靶变应原的序列的几种适体,并进一步对所选适体的核酸序列进行修饰以产生信号传导多核苷酸(spn)。选择具有高选择性、特异性和稳定性的适体,并进一步标记为检测试剂。针对8种主要变应原的所选适体的序列列于表1中。例如,1501ribospn(seqidno:1)是结合腰果的适体之一的全长序列。所述全长序列包括用于筛选的引物和适体的核心结合序列(seqidno:2)。进一步修饰核心结合序列以产生对腰果具有特异性的信号传导多核苷酸,如下文所述。
信号传导多核苷酸(spn)
根据本发明,信号传导多核苷酸可以由特异性结合靶变应原分子的所选适体开发。当以高亲和力和特异性结合分子靶标时,多核苷酸序列是可检测的。
在一些实施方案中,本发明的spn包含核心结合序列,其确定spn对靶变应原分子的特异性和亲和力。通过删除用于适体选择的引物而不影响与靶变应原的结合序列,可以缩短所选适体的全长序列。还可以在5'端和/或3'端添加额外的核苷酸,而不影响每个适体的结合(核心)序列。使用标准结构预测软件预测所述spn的3d结构。得到的多核苷酸可以形成开放的单一结构。在一些方面,5’端和3’端并不一定形成闭环结构从而使两端结合在一起。在其他方面,在末端添加的核苷酸可以增加多核苷酸的稳定性并促进荧光染料的结合。对于信号传导多核苷酸的核心结合序列,额外核苷酸的长度和序列可以不同。由针对常见变应原的适体所产生的spn列于表1中。例如,1501-spn_a(seqidno.:3)和1501spn_b(seqidno.:4)是衍生自适体1501ribospn(seqidno.:1)的两个多核苷酸。
表1:结合常见变应原的适体和spn
在一些实施方案中,可以通过修饰文献中公开的原始变应原结合适体来产生本发明的spn。针对特定变应原的亲本适体序列被修饰为包含最短序列而不改变适体的结合特异性和亲和力。从已知的亲本序列修饰的一些示例性spn列于表2中。
表2:源自文献序列的spn
一个实施方案中,可以用荧光标记物例如荧光染料探针标记本发明的信号传导多核苷酸。可以在多核苷酸的5’端或3’端添加荧光染料。在一些方面,荧光染料可包括但不限于,荧光素、罗丹明、俄勒冈绿(oregongreen,例如,俄勒冈绿488染料、俄勒冈绿514染料)、曙红、德克萨斯红、rox、tamra、joe、hex、tet、菁、吲哚碳菁、草酸菁、硫氰菁(thiacarbocyanine)、份菁、方酸菁及其衍生物如seta(例如,seta-apc-780、seta-percp-680、seta-555-nhs、seta-555-azide、seta-555-dbco、seta-580-nhs和seta-r-pe-670)、setau(例如,setau-380-nhs、setau-425-nhs、setau-647-nhs和setau-405-nhs)和方形染料(squaredye)、萘衍生物、香豆素衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑、蒽醌(例如draq5、draq7和cytrak橙)、芘及其衍生物(例如级联蓝(cascadeblue))、噁嗪衍生物(例如尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170)、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、金胺、结晶紫、孔雀石绿、卟啉、酞菁、胆红素、bodipytmr染料、bodipyfl染料、四甲基罗丹明、羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、级联蓝、太平洋蓝、太平洋橙、nbd、r-藻红蛋白(pe)、red613、percp、trured、fluorx、cy2、cy3、cy5、cy7、tritc、x-罗丹明、丽丝胺罗丹明(lissaminerhodamine)b、别藻蓝蛋白(apc)和alexafluor染料(例如,alexafluor488染料和alexafluor594染料)。
在另一个实施方案中,可以将多于一种的荧光团分子添加至信号传导多核苷酸的相同末端。作为非限制性示例,可以在信号传导多核苷酸的5’端或3’端一个接一个地添加两个fam(荧光素)分子。在另一个实施方案中,可以在信号传导多核苷酸的5'和3’端都添加荧光团分子。
检测试剂
本发明的检测试剂包含如本文所讨论的spn。根据本发明,并且不希望受理论束缚,检测试剂可以完全或部分地结合变应原。在一些实施方案中,本发明的检测试剂包含一种或多种适体作为核心序列,其特异性结合变应原分子。
在一些实施方案中,本发明的检测试剂可包含可检测的探针,例如各种有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、量子点、酶或酶底物、荧光材料、发光材料(例如鲁米诺)、生物发光材料(例如荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白)、化学发光材料、放射性材料(例如,18f、67ga、81mkr、82rb、111in、123i、133xe、201t1、125i、35s、14c、3h或99mtc(例如,高锝酸盐(锝酸盐(vii)、tco4))、造影剂(例如,金(例如,金纳米颗粒)和丁酸盐量子点)。
在一些实施方案中,本发明的检测试剂可进一步包含缀合物。在一些方面,检测试剂可以与以下物质缀合:其他多核苷酸、染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如,补骨脂素(psoralene)、丝裂霉素c)、卟啉(tppc4、特沙弗林(texaphyrin)、噻啉(sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工内切核酸酶(例如edta)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、peg(例如peg-40k)、mpeg、[mpeg]2,聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如,阿司匹林、维生素e、叶酸)、合成核糖核酸酶、蛋白质,例如糖蛋白或肽,例如对共配体具有特异性亲和力的分子或抗体,例如与特定的细胞类型诸如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体、激素和激素受体、非肽类物质,如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅助因子或药物。
根据本发明的某些实施方案,提供了检测试剂的变体。在一些方面,变体是多核苷酸变体。如本文所用,术语“多核苷酸变体”是指其核苷酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比,核酸序列变体可在核苷酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常,变体与天然或参考序列具有至少约50%的同一性(同源性),并且优选地,它们与天然或参考序列具有至少约80%,更优选至少约90%的同一性(同源性)。不应将“天然”或“参考”序列与野生型序列混淆。如本文所用,天然或参考序列是一个相对术语,是指可以进行比较的原始分子。“天然”或“参考”序列或分子可以代表野生型(在自然界中发现的序列),但不一定是野生型序列。在一些示例中,天然或参考序列可以是如本文公开的信号传导多核苷酸的序列,例如表1和表2中列出的对花生具有特异性的spn。
在一些实施方案中,还提供了检测试剂的衍生物。如本文所用,术语“衍生物”与术语“变体”同义使用,是指相对于参照分子以任何方式被修饰或改变的分子。如本文所提及的术语“衍生物”包括用有机蛋白质或非蛋白质衍生剂对参照多核苷酸进行修饰。
在一些实施方案中,本发明的检测试剂可以与其他检测分子组合使用,例如针对变应原的抗体。
可以将本发明的spn和检测试剂配制成有利于检测分子和变应原之间相互作用的溶液中。所述制剂可以使用任何可接受的容器封闭物包装在各种药学上或诊断上可接受的容器中。可接受的容器的示例包括但不限于安瓿和预填充的注射器,盒等。或者,制剂可以包含位于混合袋的一个腔室中的冻干适体,以及位于混合袋的单独腔室中的可接受溶剂,使得两个腔室在施用之前可以混合在一起。液体形式的制剂可以储存在冷藏环境中。或者,冻干制剂可以在室温下储存,或冷藏或冷冻。优选地,制剂可以是无菌的。如本文所用,“无菌”制剂是指已经达到无菌状态并且随后未暴露于微生物污染的制剂,即,容纳无菌组合物的容器没有受到损害。无菌组合物通常由制药商根据美国食品和药物管理局的现行药品生产质量管理规范(“cgmp”)的规定制备。在一些实施方案中,本发明的检测试剂和组合物可以与其他成分或试剂组合或制备成试剂盒或其他零售产品的组分用于商业销售或分销。试剂盒包含化合物或组合物,以及关于试剂盒的施用和/或使用的说明。该试剂盒还可包含以下一种或多种:注射器,袋子或瓶。
靶变应原蛋白
在一些实施方案中,本发明的检测系统和装置、适体、spn和检测试剂可用于检测变应原蛋白或其变体的存在和/或不存在。在一些实施方案中,适体、spn和检测试剂可以设计成与蛋白质或其他生物分子结合或缔合,所述生物分子自身与变应原结合。变应原可包括来自食物、环境或来自非人类蛋白质(例如家养宠物皮屑)的那些。在一些实施方案中,本发明的检测系统和装置可用于实施变应原检测测试,例如使用本发明的spn作为检测试剂以检测测试样品中变应原蛋白的存在和/或不存在。
食物变应原包括但不限于豆类中的蛋白质,例如花生、豌豆、扁豆和豆、以及与豆类相关的植物羽扇豆、坚果如杏仁、腰果、核桃、巴西坚果、榛子/榛实、山核桃、开心果、山毛榉坚果、灰胡桃、栗子、毛枝栗、椰子、银杏坚果、荔枝坚果、澳洲坚果、南海坚果和松子、蛋、鱼、贝类如蟹、小龙虾、龙虾、虾和对虾、软体动物如蛤蜊、牡蛎、贻贝和扇贝、奶、大豆、小麦、面筋、玉米、肉类如牛肉、猪肉、羊肉和鸡肉、明胶、亚硫酸盐、种子如芝麻籽、向日葵籽和罂粟籽,以及调味品如香菜、大蒜和芥菜、水果,例如芹菜的蔬菜和大米等。例如,来自植物的种子,例如羽扇豆、向日葵或罂粟,可以用于诸如种子面包的食物中,或者可以被研磨成粉用于制作面包或糕点。
海鲜变应原通常属于肌肉蛋白质组,包括鳕鱼中的小清蛋白和甲壳类动物中的原肌球蛋白;其他变应原如精氨酸激酶和肌球蛋白轻链也可能在变应原性中起重要作用。原肌球蛋白是造成甲壳类动物和软体动物之间分子和临床交叉反应的主要变应原,并且被认为是其他吸入性无脊椎动物如房尘螨和昆虫中起作用的变应原。
在一些实施方案中,变应原是食物变应原。与食物相关的变应原蛋白的示例包括但不限于,盐水虾(artfr5)、蟹(chaf1)、北海虾(crac1,crac2,crac4,crac5,crac6,crac8)、美国龙虾(homa1、homa3、homa6)、白虾(litv1、litv2、litv3、litv4)、巨型淡水虾(macr1)、虾(mete1、pena1、peni1)、北方虾(panb1)、刺龙虾(spinylobster)(pans1)、黑虎虾(penm1、penm2、penm3、penm4、penm6)、窄爪小龙虾(poni4、poni7)、远海梭子蟹(porp1)、家牛(bosd4、bosd5、bosd6、bosd7、bosd8、bosd9、bosd10、bosd11、bosd12)、大西洋鲱鱼(cluh1)、鲤鱼(cypc1)、波罗的海鳕鱼(gadc1)、大西洋鳕鱼(gadm1、gadm2、gadm3)、鳕鱼(gadc1)、鸡(gald1、gald2、gald3、gald4、gald5)、澳洲肺鱼(latc1)、帆鳞鮃(lepidorhombuswhiffiagonis)(lepw1)、大麻哈鱼(onck5)、大西洋鲑鱼(sals1、sals2、sals3)、虹鳟鱼(oncm1)、莫桑比克罗非鱼(orem4)、食用蛙(rane1、rane2)、太平洋沙丁鱼(sarsa1)、海洋鲈鱼(sebm1)、黄鳍金枪鱼(thua1、thua2、thua3)、箭鱼(xipg1)、鲍鱼(halm1)、庭园大蜗牛(helas1)、鱿鱼(todp1)、菠萝(anac1、anac2)、芦笋(aspao1)、大麦(horv12、horv15、horv16、horv17、horv20、horv21)、香蕉(musa1、musa2、musa3、musa4、musa5)、香蕉(musxp1)、大米(orys12)、黑麦(secc20)、小麦(tria12、tria14、tria18、tria19、tria25、tria26、tria36、tria37)、玉米(玉米)(zeam14、zeam25)、猕猴桃(actc1、actc2、actc5、actc8、actc10、actd1、actd2、actd3、actd4、actd5、actd6、actd7、actd8、actd9、actd10、actd11)、腰果(anao1、anao2、anao3)、芹菜(apig1、apig2、apig3、apig4、apig5、apig6)、花生(arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10、arah11、arah12、arah13)、巴西坚果(bere1、bere2)、东方芥菜(braj1)、油菜籽(bran1)、卷心菜(brao3)、萝卜(brar1、brar2)、甜椒(capa1w、capa2)、山核桃(cari1、cari4)、栗子(cass1、cass5、cass8、cass9)、柠檬(citi3)、蜜橘(citr3)、甜橙(cits1、cits2、cits3)、榛子(cora1、cora2、cora8、cora9、cora11、cora12、cora13、cora14)、甜瓜(cucm1、cucm2、cucm3)、胡萝卜(dauc1、dauc4、dauc5)、甜荞(fage2、fage3)、苦荞(fagt2)、草莓(fraa1、fraa3、fraa4)、大豆(glym1、glym2、glym3、glym4、glym5、glym6、glym7、glym8)、向日葵(hela1、hela2、hela3)、黑核桃(jugn1、jugn2)、英国核桃(jugr1、jugr2、jugr3、jugr4)、栽培莴苣(lacs1)、小扁豆(lenc1、lenc2、lenc3)、荔枝(litc1)、窄叶蓝羽扇豆(lupan1)、苹果(mald1、mald2、mald3、mald4)、木薯(mane5)、桑葚(morn3)、鳄梨(persa1)、青刀豆(phav3)、开心果(pisv1、pisv2、pisv3、pisv4、pisv5)、豌豆(piss1、piss2)、杏(pruar1、pruar3)、甜樱桃(pruav1、pruav2、pruav3、pruav4)、欧洲李子(prud3)、杏仁(prudu3、prudu4、prudu5、prudu6)、桃子(prup1、prup2、prup3、prup4、prup7)、石榴(pung1)、梨(pyrc1、pyrc3、pyrc4、pyrc5)、蓖麻子(ricc1)、覆盆子(rubi1、rubi3)、芝麻(sesi1、sesi2、sesi3、sesi4、sesi5、sesi6、sesi7)、黄芥菜(sina1、sina2、sina3、sina4)、番茄(solai1、solai2、solai3、solai4)、马铃薯(solat1、solat2、solat3、solat4)、绿豆(vigr1、vigr2、vigr3、vigr4、vigr5、vigr6)、葡萄(vitv1)、枣(zizm1)、腰果(anao1.0101、anao1.0102)、旱芹(apig1.0101、apig1.0201)、胡萝卜(dauc1.0101、dauc1.0102、dauc1.0103、dauc1.0104、dauc1.0105、dauc1.0201)、橙子(cits3.0101、cits3.0102)、大豆(glym1.0101、glym1.0102、glym3.0101、glym3.0102)、兵豆(lenc1.0101、lenc1.0102、lenc1.0103)、豌豆(piss1.0101、piss1.0102)、西红柿(lyce2.0101、lyce2.0102)、草莓(fraa3.0101、fraa3.0102、fraa3.0201、fraa3.0202、fraa3.0203、fraa3.0204、fraa3.0301)、苹果(mald1.0101、mald1.0102、mald1.0103、mald1.0104、mald1.0105、mald1.0106、mald1.0107、mald1.0108、mald1.0109、mald1.0201、mald1.0202、mald1.0203、mald1.0204、mald1.0205、mald1.0206、mald1.0207、mald1.0208、mald1.0301、mald1.0302、mald1.0303、mald1.0304、mald1.0401、mald1.0402、mald1.0403、mald3.0101w、mald3.0102w、mald3.0201w、mald3.0202w、mald3.0203w、mald4.0101、mald4.0102、mald4.0201、mald4.0202、mald4.0301、mald4.0302)、甜樱桃(pruav1.0101、pruav1.0201、pruav1.0202、pruav1.0203)和桃(prup4.0101、prup4.0201);及其任何变体。根据iuis变应原命名小组委员会系统地命名和列出了与食物相关的变应原的名称(参见国际免疫学会变应原命名小组委员会,异变应原和变体列表)。
除了食物变应原之外,本发明的适体、信号传导多核苷酸和检测试剂可以检测空气传播的微粒/变应原和其他环境变应原。含有变应原的样品可以来自植物(例如杂草、草、树、花粉)、动物(例如哺乳动物如猫、狗、牛、猪、绵羊、马、兔、大鼠、豚鼠、小鼠和沙鼠的皮屑、尿、唾液、血液或其他体液中发现的变应原)、真菌/霉菌、昆虫(例如,蜇人的昆虫,如蜜蜂、黄蜂、马蜂和摇蚊科(不叮咬的摇蚊)以及其他昆虫,如家蝇、果蝇、羊飞蝇、锥蝇、谷物象甲、蚕、蜜蜂、不叮咬的摇蚊幼虫、大蜡螟幼虫、粉虫、蟑螂和黄粉虫(tenibriomolitor)甲虫的幼虫;蜘蛛和螨、如屋尘螨)、橡胶(例如乳胶)、金属、化学品(例如药物、蛋白质洗涤剂添加剂)和自身变应原以及人体自身变应原(例如homs1、homs2、homs3、homs4、homs5)(参见,变应原命名:国际免疫学会联合会变应原命名小组委员会,变应原列表和变应原命名:国际免疫学会联合会变应原命名小组委员会,异变应原和变体清单)。
可以使用本发明的适体、信号传导多核苷酸和检测试剂所检测的来自植物的变应原蛋白的示例包括但不限于,白蜡树(frae1)、日本扁柏(chao1、chao2)、日本雪松(cryj1、cryj2)、柏树(cupa1)、普通柏树(cups1、cups3)、山地雪松(juna1、juna2、juna3、juns1)、刺桧(juno4)、东方红雪松(junv1、junv3)、黄花草(anto1)、藏红花(cros1、cros2)、爬根草(bermudagrass)(cynd1,cynd7,cynd12,cynd15,cynd22w,cynd23,cynd24)、野茅(orchardgrass)(dacg1,dacg2,dacg3,dacg4,dacg5)、牛尾草(meadowfescue)(fesp4)、绒毛草(holi1、holi5)、大麦(horv1、horv5)、黑麦草(lolp1、lolp2、lolp3、lolp4、lolp11)、百喜草(bahiagrass)(pasn1)、加那利虉草(canarygrass)(phaa1、phaa5)、梯牧草(phlp1、phlp2、phlp4、phlp5、phlp6、phlp7、phlp11、phlp12、phlp13)、海枣(datepalm)(phod2)、肯塔基蓝草(kentuckybluegrass)(poap1、poap5)、黑麦(secc1、secc5、secc38)、石茅高梁(johnsongrass)(sorh1)、小麦(tria15、tria21、tria27、tria28、tria29、tria30、tria31、tria32、tria33、tria34、tria35、tria39)、玉米(zeam1、zeam12)、桤木(alng1、alng4)、红根苋(amar2)、短豚草(amba1、amba2、amba3、amba4、amba5、amba6、amba7、amba8、amba9、amba10、amba11)、西部豚草(ambp5)、三裂叶豚草(giantragweed)(ambt5)、艾蒿(artv1、artv2、artv3、artv4、artv5、artv6)、甜菜(betav1、betav2)、欧洲白桦(betv1、betv2、betv3、betv4、betv6、betv7)、萝卜(brar5)、鹅耳枥(carb1)、栗子(cass1)、紫长春花(catr1)、蔓生藜(lamb’s-quarters)、猪草(chea1、chea2、chea3)、阿拉伯咖啡(cofa1、cofa2、cofa3)、榛子(cora6、cora10)、榛果(cora1.04、cora2、cora8)、欧洲山毛榉(fags1)、白蜡树(frae1)、向日葵(hela1、hela2)、巴西橡胶树(pararubbertree)(hevb1、hevb2、hevb3、hevb4、hevb5、hevb6、hevb7、hevb8、hevb9、hevb10、hevb11、hevb12、hevb13、hevb14)、葎草(japanesehop)(humj1)、女贞子(privet)(ligv1)、法国山靛(mercurialisannua)(mera1)、橄榄(olee1、olee2、olee3、olee4、olee5、olee6、olee7、olee8、olee9、olee10、olee11)、欧洲铁木(hophornbeam)(ostc1)、欧蓍草(parietariajudaica)(parj1、parj2、parj3、parj4)、直墙草(parietariaofficinalis)(paro1)、长叶车前草(plantagolanceolata)(pali1)、法国梧桐树(londonplanetree)(plaa1、plaa2、plaa3)、三球悬铃木(platanusorientalis)(plaor1、plaor2、plaor3)、白橡木(quea1)、俄罗斯蓟(salk1、salk2、salk3、salk4、salk5)、番茄(solai5)、丁香(syrv1、syrv5)、俄罗斯蓟(salk1)、英国车前草(plal1)、豚草(ambrosiaartemisiifolia)(amba8.0101、amba8.0102、amba9.0101、amba9.0102)、长叶车前草(plal1.0101、plal1.0102、plal1.0103)、欧蓍草(parietariajudaica)(parj3.0102)、狗压根(cynodondactylon)(cynd1.0101、cynd1.0102、cynd1.0103、cynd1.0104、cynd1.0105、cynd1.0106、cynd1.0107、cynd1.0201、cynd1.0202、cynd1.0203、cynd1.0204)、绒毛草(holcuslanatus)(holi1.0101、holi1.0102)、黑麦草(loliumperenne)(phlp1.0101、phlp1.0102、phlp4.0101、phlp4.0201、phlp5.0101、phlp5.0102、phlp5.0103、phlp5.0104、phlp5.0105、phlp5.0106、phlp5.0107、phlp5.0108、phlp5.0201、phlp5.0202)、黑麦(secalecereale)(secc20.0101、secc20.0201)、疣桦(betulaverrucosa)(betv1.0101、betv1.0102、betv1.0103、betv1.0201、betv1.0301、betv1.0401、betv1.0402、betv1.0501、betv1.0601、betv1.0602、betv1.0701、betv1.0801、betv1.0901、betv1.1001、betv1.1101、betv1.1201、betv1.1301、betv1.1401、betv1.1402、betv1.1501、betv1.1502、betv1.1601、betv1.1701、betv1.1801、betv1.1901、betv1.2001、betv1.2101、betv1.2201、betv1.2301、betv1.2401、betv1.2501、betv1.2601、betv1.2701、betv1.2801、betv1.2901、betv1.3001、betv1.3101、betv6.0101、betv6.0102)、欧洲鹅耳枥(carpinusbetulus)(carb1.0101、carb1.0102、carb1.0103、carb1.0104、carb1.0105、carb1.0106、carb1.0106、carb1.0106、carb1.0106、carb1.0107、carb1.0107、carb1.0108、carb1.0201、carb1.0301、carb1.0302)、欧洲榛(corylusavellana)(cora1.0101、cora1.0102、cora1.0103、cora1.0104、cora1.0201、cora1.0301、cora1.0401、cora1.0402、cora1.0403、cora1.0404)、普通女贞(ligustrumvulgare)(syrv1.0101、syrv1.0102、syrv1.0103)、日本柳杉(cryptomeriajaponica)(cryj2.0101、cryj2.0102)和地中海柏木(cupressussempervirens)(cups1.0101、cups1.0102、cups1.0103、cups1.0104、cups1.0105);及其任何变体。
羽扇豆是属于羽扇豆(lupinus)属的豆科植物的草本植物。在欧洲,羽扇豆粉和种子广泛用于面包、饼干、糕点、面食、调味料、作为牛奶或大豆替代品的饮料以及无麸质食品中。国际免疫学会联合会(iuis)变应原命名小组委员会最近将β-蓝豆蛋白指定为lupan1变应原。(nadal等,dnaaptamersagainstthelupan1foodallergen.plosone,2012,7(4):e35253),以及最近报道了针对lupan1(β-蓝豆蛋白)的高亲和力11-merdna适体(nadal等,probinghigh-affinity11-merdnaaptameragainstlupan1(β-conglutin).anal.bioanal.chem.2013,405:9343-9349)。
可以使用本发明的适体、信号传导多核苷酸和检测试剂所检测的来自螨的变应原蛋白的示例包括但不限于,螨(blot1、blot3、blot4、blot5、blot6、blot10、blot11、blot12、blot13、blot19、blott21);美国屋尘螨(derf1、derf2、derf3、derf7、derf10、derf11、derf13、derf14、derf15、derf16、derf17、derf18、derf22、derf24);微角尘螨(dermatophagoidesmicroceras)(屋尘螨)(derm1);欧洲屋尘螨(derp1、derp2、derp3、derp4、derp5、derp6、derp7、derp8、derp9、derp10、derp11、derp14、derp15、derp20、derp21、derp23);欧宇尘螨(euroglyphusmaynei)(屋尘螨)(eurm2、eurm2、eurm3、eurm4、eurm14);储存尘螨(storagemite)(acas13、glyd2、lepd2、lepd5、lepd7、lepd10、lepd13、tyrp2、tyrp3、tyrp10、tyrp13、tyrp24)、粉尘螨(dermatophagoidesfarinae)(derf1.0101、derf1.0102、derf1.0103、derf1.0104、derf1.0105、derf2.0101、derf2.0102、derf2.0103、derf2.0104、derf2.0105、derf2.0106、derf2.0107、derf2.0108、derf2.0109、derf2.0110、derf2.0111、derf2.0112、derf2.0113、derf2.0114、derf2.0115、derf2.0116、derf2.0117)、欧洲尘螨(dermatophagoidespteronyssinus)(derp1.0101、derp1.0102、derp1.0103、derp1.0104、derp1.0105、derp1.0106、derp1.0107、derp1.0108、derp1.0109、derp1.0110、derp1.0111、derp1.0112、derp1.0113、derp1.0114、derp1.0115、derp1.0116、derp1.0117、derp1.0118、derp1.0119、derp1.0120、derp1.0121、derp1.0122、derp1.0123、derp2.0101、derp2.0102、derp2.0103、derp2.0104、derp2.0105、derp2.0106、derp2.0107、derp2.0108、derp2.0109、derp2.0110、derp2.0111、derp2.0112、derp2.0113)、欧宇尘螨(euroglyphusmaynei)(eurm2.0101、eurm2.0102)、害嗜鳞螨(lepidoglyphusdestructor)(lepd2.0101、lepd2.0101、lepd2.0101、lepd2.0102、lepd2.0201、lepd2.020)和家甜食螨(glycyphagusdomesticus)(glyd2.0101、glyd2.0201);及其任何变体。
可以使用本发明的适体、信号传导多核苷酸和检测试剂所检测的来自动物的变应原蛋白的示例包括但不限于,家牛(bosd2、bosd3、bosd4、bosd5、bosd6、bosd7、bosd8)、狗(canf1、canf2、canf3、canf4、canf5、canf6)、家马(equc1、equc2、equc3、equc4、equc5)、猫(feld1、feld2、feld3、feld4、feld5w、feld6w、feld7、feld8)、小鼠(musm1)、豚鼠(cavp1、cavp2、cavp3、cavp4、cavp6)、兔(oryc1、oryc3、oryc4)、大鼠(ratn1)、家牛(bosdomesticus)(bosd2.0101、bosd2.0102、bosd2.0103)和马(equuscaballus)(equc2.0101、equc2.0102);及其任何变体。
可以使用本发明的适体、信号传导多核苷酸和检测试剂所检测的来自昆虫的变应原蛋白的示例包括但不限于,黄热病蚊子(aeda1、aeda2、aeda3)、东部蜂巢蜂(apic1)、巨型蜜蜂(apid1)、蜜蜂(apim1、apim2、apim3、apim4、apim5、apim6、apim7、apim8、apim9、apim10、apim11、apim12)、鸽蜱(argr1)、德国小蠊(blag1、blag2、blag3、blag4、blag5、blag6、blag7、blag8、blag11),大黄蜂(bomp1、bomp4、bomt1、bomt4)、蚕蛾(bombm1)、摇蚊(midge)(chik10、chit1、chit1.01、chit2、chit2.0101、chit2.0102、chit3、chit4、chit5、chit6、chit6.01、chit7、chit8、chit9)、猫蚤(ctef1、ctef2、ctef3)、黄色马蜂(dola5)、白脸马蜂(dolm1、dolm2、dolm5)、叮咬的摇蚊(fort1、fort2)、savannah采采蝇(glom5)、亚洲瓢虫(asianladybeetle)(hara1、hara2)、蠹虫(silverfish)(leps1)、书虱(lipb1)、澳大利亚跳蚁(australianjumperant)(myrp1、myrp2、myrp3)、美洲大蠊(pera1、pera3、pera6、pera7、pera9、pera10)、印度谷螟(ploi1、ploi2)、胡蜂(pola1、pola2、pola5、pole1、pole4、pole5、polf5、polg1、polg5、polm5、polyp1、polys5、vesvi5)、地中海胡蜂(mediterraneanpaperwasp)(pold1、pold4、pold5)、热带火蚁(solg2、solg3、solg4)、红火蚁(solenopsisinvicta)(红色输入性火蚁redimportedfireant)(soli1、soli2、soli3、soli4)、黑火蚁(solr2、solr3)、巴西火蚁(sols2、sols3)、马蝇(taby1、taby2、taby5)、松树列队蛾(pineprocessionarymoth)(thap1、thap2)、加州接吻虫(californiakissingbug)(triap1)、欧洲马蜂(vespc1、vespc5)、大胡蜂(vespamagnifica)(马蜂)(vespma2、vespma5)、大虎头蜂(vespamandarinia)(vespm1、vespm5)、小黄蜂(vesf5、vesg5、vesm1、vesm2、vesm5)、德国黄胡蜂(vespulagermanica)(小黄蜂)(vesp5)、鳞毛胡蜂(vespulasquamosa)(小黄蜂)(vess1、vess5)、普通黄胡蜂(vespulavulgaris)(小黄蜂)(vesv1、vesv2、vesv3、vesv4、vesv5、vesv6)、德国小蠊(blattellagermanica)(blag1.0101、blag1.0102、blag1.0103、blag1.02、blag6.0101、blag6.0201、blag6.0301)、美洲大蠊(periplanetaamericana)(pera1.0101、pera1.0102、pera1.0103、pera1.0104、pera1.02、pera3.01、pera3.0201、pera3.0202、pera3.0203、pera7.0101、pera7.0102)、黄边胡蜂(vespacrabo)(vespc5.0101、vespc5.0101)、野胡蜂(vespamandarina)(vespm1.01、vespm1.02);及其任何变体。
可以使用本发明的适体、信号传导多核苷酸和检测试剂所检测的来自真菌/霉菌的变应原蛋白的示例包括但不限于,交链孢菌(链格孢菌)(alta1、alta3、alta4、alta5、alta6、alta7、alta8、alta10、alta12、alta13)、黄曲霉菌(aspergillusflavus)(真菌)(aspfl13)、烟曲霉菌(aspergillusfumigatus)(真菌)(aspf1、aspf2、aspf3、aspf4、aspf5、aspf6、aspf7、aspf8、aspf9、aspf10、aspf11、aspf12、aspf13、aspf15、aspf16、aspf17、aspf18、aspf22、aspf23、aspf27、aspf28、aspf29、aspf34)、黑曲霉菌(aspergillusniger)(aspn14、aspn18、aspn25)、米曲霉菌(aspergillusoryzae)(aspo13、aspo21)、杂色曲霉菌(aspergillusversicolor)(aspv13)、白色念珠菌(酵母)(canda1、canda3)、白假邻酵母(candidaboidinii)(酵母)(candb2)、支孢样支孢霉菌(cladosporiumcladosporioides)(clac9、clac14)、多主枝孢(cladosporiumherbarum)(clah2、clah5、clah6、clah7、clah8、clah9、clah10、clah12)、月状弯孢菌(curvularialunata)(同义词:月状弯孢菌(cochlioboluslunatus))(curl1、curi2、curi3、curi4)、黑附球菌(epicoccumpurpurascens)(土壤真菌)(epip1)、大刀镰刀菌(fusariumculmorum)(n.a.)(fusc1、fusc2)、层生镰刀菌(fusariumproliferatum)(fusp4)、短密青霉菌(penicilliumbrevicompactum)(penb13、penb26)、产黄青霉菌(penicilliumchrysogenum)(pench13、pench18、pench20、pench31、pench33、pench35)、橘青霉菌(penicilliumcitrinum)(penc3、penc13、penc19、penc22、penc24、penc30、penc32)、皮落青霉(penicilliumcrustosum)(pencr26)、草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)(peno18)、纸葡萄穗霉(stachybotryschartarum)(stac3)、红色毛癣菌(trichophytonrubrum)(trir2、trir4)、断发毛癣菌(trichophytontonsurans)(trit1、trit4)、psilocybecubensis(psic1、psic2)、毛头鬼伞(shaggycap)(copc1、copc2、copc3、copc5、copc7)、胶红酵母(rhodotorulamucilaginosa)(rhom1、rhom2)、糠秕马拉色菌(malasseziafurfur)(malaf2、malaf3、malaf4)、合轴马拉色苗(malasseziasympodialis)(malas1、malas5、malas6、malas7、malas8、malas9、malas10、malas11、malas12、malas13)和烟草赤星病菌(alternariaalternate)(alta1.0101、alta1.0102);及其任何变体。
另外的变应原的示例包括但不限于,线虫(anis1、anis2、anis3、anis4)、蠕虫(ascs1)、软珊瑚(denn1)、橡胶(乳胶)(hevb1、hevb2、hevb3、hevb5、hevb6、hevb7、hevb8、hevb9、hevb10、hevb11、hevb12、hevb13)、非洲轻木(obeche)(trips1)和巴西橡胶(heveabrasiliensis)(hevb6.01、hevb6.0201、hevb6.0202、hevb6.03、hevb8.0101、hevb8.0102、hevb8.0201、hevb8.0202、hevb8.0203、hevb8.0204、hevb10.0101、hevb10.0102、hevb10.0103、hevb11.0101、hevb11.0102);及其任何变体。
一些新的变应原可包括来自马皮屑的变应原食管鳞癌分泌素(secretoglobin)(美国专利号9,164,101)和来自狗的前列腺激肽释放酶(kallikrein)变应原(美国专利号9,182,400)。
其他靶分子
除变应原之外,本发明的检测系统、装置、适体、spn和检测试剂可用于检测样品中的任何靶标含量。
在一些实施方案中,本发明的检测系统、装置、适体、spn和检测试剂可以检测一种或多种对病原微生物具有特异性的靶蛋白。靶蛋白可以是由病原体分泌的分子、表面蛋白、当病原体攻击宿主时诱导的蛋白、或靶蛋白的一部分。本发明允许检测和鉴定多种不同类型的病原微生物,例如细菌、酵母、真菌、孢子、病毒或朊病毒。如本文所用,术语“病原体”意指任何导致疾病的物质(尤其是病毒或细菌或其他微生物)。
在一些实施方案中,本发明的检测系统、装置、适体、spn和检测试剂可以检测其他靶分子,例如疾病相关蛋白,以诊断疾病、病症和其他临床状况并对进行分期。疾病相关蛋白可以是分泌的多肽和肽(例如循环分子);细胞表面蛋白(例如受体);在特定疾病状况下表达或过表达的生物标志物;仅存在于疾病状态的特定蛋白质的同种型、衍生物和/或变体;导致病症的突变蛋白质;和来自另一种生物体的蛋白质,其在宿主中引起临床病症,例如病毒感染。
在其他实施方案中,本发明的检测系统、装置、适体、spn和检测试剂可以检测非蛋白质靶分子,例如神经节苷脂、脂质、磷脂、碳水化合物、小分子(例如霉菌毒素和抗生素)、半抗原和核酸(dna或rna)、杀虫剂、肥料和其他氯芳香族污染物。
测定和方法
本发明进一步提供了用于检测食物样品中所关注的变应原的存在和/或不存在的方法。多种方法和测定可以与本发明的检测系统、装置、适体、spn、检测试剂和组合物结合使用;选择取决于应用领域。在一些实施方案中,采用基于适体的信号多核苷酸作为检测试剂提供变应原检测测定。在一些实施方案中,信号多核苷酸在多核苷酸的一个末端用荧光团标记。在其他实施方案中,变应原蛋白结合时可以检测荧光偏振的变化以测量变应原的存在。在一些实施方案中,spn和检测试剂可包含表1和表2中包括的核酸序列。
通常,使用本发明的系统、装置、适体、spn和检测试剂检测样品中的靶变应原蛋白的测定和方法包括以下步骤:(a)获得怀疑含有所关注的变应原的测试样品;(b)用提取缓冲液处理(a)的样品;(c)将经处理的样品与对所关注的变应原具有特异性的检测试剂接触;(d)用激发装置处理经混合处理的样品和检测试剂;和(e)使经处理的样品中所含的所关注的变应原与检测试剂之间的相互作用可视化。所提供的测定和方法可以检测样品中所关注的变应原的存在和/或不存在,和/或确定样品中变应原的量。
用于检测样品中的变应原含量的测定和方法适用于含有变应原的食物,而没有任何限制。食物的示例包括蛋类、奶类、肉类、鱼类、甲壳类和软体动物、谷类、豆类和坚果、水果、蔬菜、啤酒酵母和明胶;更尤其是,蛋类的蛋白和蛋黄,奶类的奶和奶酪,肉类的猪肉、牛肉、鸡肉和羊肉,鱼类的鲭鱼、金枪鱼(horsemackerel)、沙丁鱼、鲔鱼、鲑鱼、鳕鱼、比目鱼和鲑鱼鱼子酱、甲壳动物和软体动物的蟹、虾、紫贻贝、鱿鱼、章鱼、龙虾和鲍鱼,谷类的小麦、大米、荞麦、黑麦、大麦、燕麦、玉米、小米、粟和稗,豆类和坚果的大豆、花生、可可、豌豆、芸豆、榛子、巴西坚果、杏仁、椰子和核桃、水果的苹果、香蕉、橙子、桃子、猕猴桃、草莓、甜瓜、鳄梨、葡萄柚、芒果、梨、芝麻和芥菜、蔬菜的番茄、胡萝卜、土豆、菠菜、洋葱、大蒜、竹笋、南瓜、甘薯、芹菜、西芹、山药和松茸、含有它们及其成分(如卵清蛋白、卵类粘蛋白、溶菌酶、酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、谷蛋白和α-淀粉酶抑制剂)的食物。
食物可以是含有动物来源的肉和/或蔬菜的新鲜食物、冷冻食物、冷却食物或加工食物。这些食物可以经过加热、冷冻、干燥、盐腌、发酵、酶处理等加工。
在一些实施方案中,食物样品加工可涉及采用通用的制剂。就对测试的食物影响最小且仅需要采样大约0.5g食物而言,该通用制剂在临床上相关的,当变应原在样品中含量最小,其允许检测出痕量的变应原。这种优化的蛋白质提取过程将提供快速,准确和通用的方案,允许检测任何食物基质中的变应原。在一些方面,通用缓冲液可以是基于tris的缓冲液(t缓冲液)、基于hepes的缓冲液、基于tgk的缓冲液或基于pbs的缓冲液。下面进行详细讨论。
在一些实施方案中,根据食物基质的性质,可以采用一种或多种检测试剂(例如spn)。某些食物含有若干种变应原蛋白,例如,至少八种花生蛋白(例如arah1和arah2)有可能引起免疫应答。在这种情况下,可以在混合物中使用针对多于一种的变应原蛋白的多于一种的spn,以检测花生的存在或不存在。在其他方面,一些食物基质如鱼、贝类和软体动物仅含有一种主要的变应原蛋白。特异性结合该主要变应原蛋白的一种或多种spn可用于变应原检测。在一些方面,检测试剂可以预先存储在检测系统中,并且在检测的过程中释放,例如,在本发明的一次性测试杯中。
在一些实施方案中,本发明的变应原检测测定和方法可以检测食物样品中较低浓度的变应原。核酸适体和spn的灵敏度和光学设计使得可以检测低至0.0001ppm的变应原的存在。在一些方面,可检测的变应原的浓度或量可以为0.001ppm至5ppm、或0.001ppm至0.1ppm、或0.1ppm至3ppm、或1ppm至5ppm、或5ppm至10ppm、或从10ppm到30ppm。在一些方面,可以检测的食物样品中变应原的浓度或量可以是0.001ppm、0.002ppm、0.003ppm、0.004ppm、0.005ppm、0.006ppm、0.007ppm、0.008ppm、0.009ppm、0.01ppm、0.02ppm、0.03ppm、0.04ppm、0.05ppm、0.06ppm、0.07ppm、0.08ppm、0.09ppm、0.1ppm、0.2ppm、0.3ppm、0.4ppm、0.5ppm、0.6ppm、0.7ppm、0.8ppm、0.9ppm、1.0ppm、1.5ppm、2ppm、2.5ppm、3ppm、3.5ppm、4ppm、4.5ppm、5ppm、10ppm、15ppm、20ppm或30ppm。
在一些实施方案中,本发明的变应原检测测定和方法可以在不到5分钟内完成实施。在一些方面,测定时间可以是约1分钟至约5分钟、约1分钟至约3分钟、约2分钟至约10分钟、约5分钟至约10分钟。在其他方面,测定时间可持续少于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。在其他方面、测定时间可持续少于约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约35秒、约40秒、约45秒、约50秒、约55秒或约60秒。
用于检测和显示核酸分子(例如spn)和蛋白质的相互作用的任何方法和系统可用于显示检测结果。在一些实施方案中,当结合靶变应原时,测量荧光团探针标记的检测分子(例如spn)的荧光偏振(fp)变化,以指示样品中靶变应原的存在和不存在。为了测量荧光偏振,用线性偏振光激发样品。当发射偏振器平行于偏振激发的方向定向时,测量平行的荧光强度,当发射偏振器垂直于激发光的偏振面定向时,测量垂直荧光强度。可以通过许多现象对荧光发射去偏振,包括在激发态的寿命期间荧光团的旋转扩散、能量转移、再吸收等。根据fp技术的原理,靶变应原与相对小的信号传导多核苷酸的结合可以显著改变旋转扩散,所述改变导致fp,并且可以对结合的目标进行定量。
在一些实施方案中,可以使用光学系统测量fp变化,并且可以使检测到的信号可视化以向消费者报告。一方面,可以使用本发明的装置。因此,系统中的偏振光发射器发出的光具有适于激发spn的荧光团的激发波长,而且系统中的光检测器可以过滤spn的荧光团发射的荧光并透射所关注的波长。然后,可以采用装置来处理荧光信号并将其转换成有用的读数(即数字信号)。另一方面,可以在任何商业fp设备中测量fp的变化。
在一些实施方案中,偏振光的波长在200nm至800nm的范围内。
在一些实施方案中,来自spn和靶变应原之间的相互作用的信号可以由检测系统检测和可视化。一些非限制性示例包括侧向流动装置(lfd)、微流体芯片(美国专利号8,617,903),共同拥有的2015年3月16日提交的美国专利申请号62/133,632和2015年6月22日提交的美国专利申请62/182,900中描述的便携式检测装置/系统,以及2014年10月28日提交的共同拥有的pct专利申请号pct/us14/62656中描述的盒,它们的每一个的全部内容通过引用并入本文。
来自本测定的检测结果可以显示在用户易于阅读的平台中,例如显示窗口。在一个实施方案中,它可以是计算机、平板电脑和/或智能手机中的平台应用(coskun等,apersonalizedfoodallergentestingplatformonacellphone,labchip.,2013,13(4),636-640;其内容通过引用整体并入本文中)。
在一个实施方案中,可以用本发明的检测系统和组合物实施检测所关注的变应原蛋白的存在和/或不存在的方法。以下部分对该方法进行了详细描述。
采样
为了从变应原检测测试中提供可靠且灵敏的结果,适当大小的测试样品是重要的。本发明的发明人研发了一种采样机制,其可以有效且非破坏性地收集测试样品,以快速、有效地提取变应原蛋白用于检测。
可以使用如图2c中所示的食物取芯器200收集一定大小的测试样品。样品获取器(例如,食物取芯器200)可以测量尺寸,并收集适当大小的样品,其可以提供足够用于检测测试的蛋白质提取。所述的大小可以是0.1g至1g食品样品。此外,食物取芯器200可以通过切割、研磨、混合、刮擦和/或过滤来预处理收集的测试样品。将经预处理的测试样品引入样品处理杯体220中以进行均质化和变应原蛋白质提取。如图1a和图3a所示,食物取芯器200可以插入杯盖组件210顶部的食物取芯器端口213中,并将测试样品释放到一次性测试杯300中。
在提取缓冲液中处理收集的测试样品。在一些方面,提取缓冲液存在于杯体220中,可以通过均质器组件570与测试样品混合。在其他方面,提取缓冲液可以通过手动投入从局部区域(例如,在杯体220的底部)释放到杯体220中,或自动从存储位置释放到杯室中。通过均质器组件570将测试样品和提取缓冲液混合在一起,并将样品均质化。
提取缓冲液可以是通用的靶提取缓冲液,其可以从任何测试样品中回收足够多的靶蛋白(例如,最小1mg/ml总蛋白),并且被优化使得蛋白质提取和变应原回收最大化。在一些实施方案中,通用蛋白质提取缓冲液的制剂可以在室温下和最短时间内提取蛋白质,例如小于约2分钟,或小于约1分钟,或小于约30秒。在食物取样、均质化和过滤期间可以使用相同的缓冲液。通用提取缓冲液适用于任何变应原和所有食物(例如,预处理或后处理)。另外,通用提取缓冲液可以提高信号传导多核苷酸(spn)的结合亲和力,使非特异性结合最小化,并增加信噪比。在某些方面,提取缓冲液可以是含有10%、20%或40%乙醇的基于pbs的缓冲液,或含有tris碱ph8.0、5mmmedta和20%乙醇的基于tris的缓冲液,或改良的pbs或tris缓冲液。在一些示例中,缓冲液可以是基于hepes的缓冲液。改良的pbs缓冲液的一些示例可包括p+缓冲液和k缓冲液。基于tris的缓冲液的一些示例可包括缓冲液a+,缓冲液a、b、c、d、e和缓冲液t。每种改良缓冲液的详细描述公开于pct专利申请号pct/us2014/062656;其内容通过引用整体并入本文。
提取缓冲液的体积可以是0.5ml至3ml,已经确定其随时间和在不同的食物基质中是有效且可重复的。
根据本发明,使用经优化的均质器(例如均质器组件570)以高速均质化将测试样品均质化并进行处理,以最大限度地处理测试样品。在一些方面,过滤机构可以连接至均质器。然后驱动经均质化的样品溶液流经过滤器处理以进一步提取变应原蛋白,降低从测试样品中提取的其他分子的量。可以将诸如corning(corning,ny,usa)的细胞滤器或类似定制方案的过滤膜连接至均质器。过滤器孔隙可在0.2μm至600μm之间。过滤器可以由任何低粘合材料制成,包括但不限于,pes(聚醚砜)、pcte(聚碳酸酯)或pvdf(聚偏二氟乙烯)。过滤过程可以是多级设置,其具有从一级过滤到二级过滤的孔径变化。过滤器可以是相对于流量阀的(从上面得到该恰当的名称)任何设置,在过滤的任何阶段之上、之下或之间。
在一些方面,采样程序可在不到1分钟内达到有效的蛋白质提取。在一方面,消化速度可以小于2分钟,包括食物获取、消化和读数。近似地,程序可以是15秒、30秒、45秒、50秒、55秒或1分钟。
传感器和检测试剂
经提取的变应原蛋白可以与一种或多种对一种或多种所关注的变应原具有特异性的检测试剂混合。变应原蛋白质提取物和检测试剂之间的相互作用将产生可检测的信号,其指示测试样品中一种或多种变应原的存在或不存在或量。如本文所用,术语“检测试剂”或“变应原检测试剂”是指能够或确实与一种或多种变应原以允许检测样品中的所述变应原的方式相互作用和/或结合的任何分子。
本发明的一个方面,检测试剂是基于核酸分子的spn。
在其他实施方案中,可用作反应室223中的检测试剂的适体分子可以是申请人的相关专利申请中描述的适体,包括2014年7月18日提交的美国临时申请序列号62/026,361;2014年6月10日提交的美国临时申请序列号62/009,958;2014年5月9日提交的美国临时申请序列号61/991,068;2014年2月11日提交的美国临时申请序列号61/938,528;2013年10月28日提交的美国临时申请序列号61/896,399;2014年10月28日提交的pct申请系列号pct/us2014/062656;和2015年4月29日提交的美国临时申请序列号62/154,200;它们的全部内容通过引用并入本文。
除了基于适体的spn之外,检测装置100中使用的检测试剂可以是能够缀合或结合一种或多种变应原的任何分子或试剂,例如小分子、抗体及其变体。抗体检测剂可以是多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、抗体片段和其他功能变体。
在一些实施方案中,用荧光标记物标记的本发明的适体和spn可用作检测试剂。spn可以包含表1和表2中包括的核酸序列。在一些方面,spn可以在多核苷酸的一端用荧光标记物标记。在这方面,当结合测试样品中存在的变应原时,测量经荧光探针标记的检测试剂的荧光偏振的变化,并用于计算测试样品中的变应原含量。荧光偏振变化可以由光学子系统520测量,如本检测系统的图16和图17所示。
荧光标记物,荧光团可以合适地具有200至800nm范围内的激发最大值,而发射最大值可以在300至700nm范围内。荧光团可以进一步具有1-7纳秒优选3-5纳秒的荧光弛豫时间。作为非限制性示例,可以在spn的一个末端探针标记的荧光团可以包括bodipy衍生物(例如,bodipytmr染料;bodipyfl染料)、包括其衍生物的荧光素、包括其衍生物的罗丹明、包括其衍生物的丹磺酰(例如,丹磺酰尸胺)、德克萨斯红、曙红、菁染料、吲哚碳菁、草酸菁、硫氰菁、份菁、方酸菁及其衍生物seta、setau和方形染料(squaredye)、萘及其衍生物、香豆素及其衍生物、吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、蒽醌、芘及其衍生物、噁嗪及其衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、金胺、结晶紫、孔雀石绿、卟啉、酞菁、胆红素、四甲基罗丹明、羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、级联蓝、太平洋蓝、太平洋橙、nbd、r-藻红蛋白(pe)、red613;percp、trured;fluorx、cy2、cy3、cy5和cy7、tritc、x-罗丹明、丽丝胺罗丹明(lissaminerhodamine)b、别藻蓝蛋白(apc)和alexafluor染料。
除了荧光偏振变化之外,还可以通过测量其他光学性质来检测经荧光团标记的检测试剂与变应原之间的特异性相互作用,包括但不限于吸光度、荧光强度、荧光光谱和荧光寿命。荧光信号的测量提供了监测环境(例如本检测测定的样品混合物)中生物化学变化的灵敏方法。
在一些实施方案中,8种主要食物变应原(即小麦、蛋、奶、花生、树坚果、鱼、贝类和大豆)的检测试剂可以作为一次性用品。一方面,检测试剂的构建体可以与mgcl或掺杂有kcl的缓冲液一起储存。mgcl使构建体紧密闭合,而kcl稍微打开它们以进行键合。
检测系统
在反应室223中分析变应原蛋白质提取物和检测试剂的混合物。如上所述,用荧光团(例如德克萨斯红)探针标记的检测试剂(例如spn)是小分子并且快速旋转。通常,由荧光团吸收的平面偏振激发光旋转至与荧光团在发射荧光之前经历的相同程度的分子旋转。荧光发射可以通过许多现象去偏振,包括在激发态的寿命期间荧光团的旋转扩散、能量转移、再吸收等。靶变应原与相对较小的信号传导多核苷酸的结合可以显著减慢旋转并改变旋转扩散;这些变化可用于量化所结合的变应原蛋白。根据本发明,如图16和图17所示的光学子系统520测量这些信号并将检测到的信号转换成数字信号,或者将模拟信号与用于指示用户测试样品中变应原存在或不存在或量的阈值进行比较。
在该范围内被光激发的荧光团适用于便宜的激光器或led照明。印刷电路板(pcb)550可用于将荧光信号转换为数字信号或将模拟信号与阈值进行比较,以向用户显示检测测试的读数。在一些实施方案中,聚苯乙烯窗口可以设计用于读数,其原因在于,在聚苯乙烯孔板中荧光读数非常精确和可重复。
除了上述包括荧光偏振测量的检测方法之外,检测机制可以基于化学发光测量、比色测量、ph测量、溶解氧测量、氧化还原测量和/或其他合适的测量。
应用
根据本发明,本文所述的检测系统、装置和方法涵盖使用基于核酸的检测分子,例如适体或适体衍生的spn,用于检测样品例如食物样品中的变应原。便携式设备允许用户检测食物样品中是否存在一种或多种用户对之过敏的变应原。可采用本文所述的系统和组合物检测的变应原家族包括来自食物、环境或来自非人类蛋白质例如家养宠物皮屑的变应原。食物变应原可包括但不限于,如花生、豌豆、扁豆和豆、以及与豆类有关的植物羽扇豆的豆类、树坚果如杏仁、腰果、核桃、巴西坚果、榛子/榛实、山核桃、开心果、山毛榉坚果、灰胡桃、栗子、毛枝栗、椰子、银杏坚果、荔枝坚果、澳洲坚果、南海坚果和松子,蛋、鱼,贝类如蟹、小龙虾、龙虾、虾和对虾,软体动物如蛤蜊、牡蛎、贻贝和扇贝、奶、大豆、小麦、面筋、玉米,肉类如牛肉、猪肉、羊肉和鸡肉,明胶、亚硫酸盐、种子如芝麻、向日葵和罂粟籽,以及调味品如香菜、大蒜和芥菜,水果、例如芹菜的蔬菜和大米等。变应原可以存在于面粉或谷物粗粉中,或存在于任何形式的产品。例如,来自植物的种子,例如羽扇豆、向日葵或罂粟,可以用于诸如种子面包的食物中,或者可以被研磨以制作用于制作面包或糕点的面粉。该装置能够确认这些变应原的存在或不存在以及对这些变应原的量进行定量。
在一些实施方案中,本发明的检测系统、装置、适体、spn、检测试剂和测定可以在医院中用于临床食物过敏或过敏测试,以及识别患者对其过敏的食物/变应原。所述测定和方法也可用于监测食品工业中的变应原污染。另外,它们也可以在家中或餐馆中在过敏者食用食物之前由过敏者用于检测变应原含量。
在广义的概念中,除了食品安全之外,本文所述的检测系统、装置、适体、spn、检测试剂和方法可以在大量应用中检测样品中的任何蛋白质含量,例如,民用和战场环境中的疾病医学诊断和预测、环境监测/控制和用于检测生物武器的军事用途。在更广泛的应用中,本发明的检测系统、装置、spn、组合物和方法可用于检测基于核酸的检测分子结合的任何生物分子。作为一些非限制性示例,该检测系统、装置、spn、试剂和方法可用于癌症标志物的现场检测、现场诊断(暴露化学试剂,创伤性头部损伤等)、第三世界应用(tb、hiv检测等)、紧急护理(中风标记物、头部受伤等)和许多其他应用。
作为应用的非限制性示例,本发明的检测系统、装置、适体、spn、检测试剂和方法可以检测和鉴定样品中的病原微生物。可检测的病原体包括细菌、酵母、真菌、病毒和病毒样生物体。病原体可能导致动物和植物疾病;污染食物、水、土壤或其他资源;或用作军事领域的生物制剂。该装置能够检测和鉴定这些病原体。
另一个重要的应用包括将本发明的检测系统、装置、spn、检测试剂和方法用于医疗护理,例如,用于诊断疾病、对疾病进展进行分期,和监测对特定治疗的响应。作为非限制性示例,本发明的检测装置和spn可用于测试与疾病(例如癌症)相关的生物标志物的存在或不存在或量,以预测疾病或疾病进展。本发明的检测系统、装置和方法被设计用于分析少量的测试样品,并且可以由用户实施而无需深入的实验室培训。
除食品安全领域之外的其他扩展应用包括军事机构的现场使用、抗生素和生物药物的检测、杀虫剂和肥料等产品的环境检测、膳食补充剂以及成批制备的各种食品组分和添加剂(例如咖啡因和尼古丁)的测试,以及临床样品如唾液、皮肤和血液的检测以确定个体是否暴露于显著水平的单个变应原。
定义
在本说明书中的不同地方,本公开内容的化合物的取代物以组或范围公开。具体地,本公开内容特别旨在包括所述组和范围的成员的每一个以及每个单独的子组合。以下是术语定义的非限制性列表。
约:如本文所用,当提及诸如重量、时间、剂量的量等的可测量值时,术语“约”意指包括指定量的±20%或±10%、更优选±5%、甚至更优选±1%、更优选±0.1%的变化,这些变化适于实施所公开的方法。
活性:如本文所用,术语“活性”是指事物正在发生或正在进行的状态。本发明的组合物可具有活性,并且该活性涉及与靶分子的结合。
变应原:如本文所用,术语“变应原”是指在受试者中引起、引发或触发免疫反应的化合物、物质或组合物。因此,变应原通常被称为抗原。变应原通常是蛋白质或多肽。
变应原检测试剂:如本文所用,术语“变应原检测试剂”是指能够或者确实与一种或多种变应原以允许检测样品中的所述变应原的方式相互作用和/或结合的任何试剂,在本文中称为“变应原检测试剂”或“检测试剂”。
结合亲和力:如本文所用,术语“结合亲和力”是指检测分子(例如,适体)结合或不结合靶标(例如,变应原)的趋势,描述了检测分子结合靶标的结合或亲和力强度的量度。
局部构象形状:如本文所用,术语“局部构象形状”是指位于多核苷酸的可限定空间内的结构表现。
检测:如本文所用,术语“检测”是指从许多非靶蛋白的混合物中提取特定靶蛋白,指示来自许多非靶蛋白的混合物中靶蛋白的不存在、存在和/或量。
可检测标记:如本文所用,“可检测标记”是指与另一实体连接、掺入或缀合的一种或多种标记物、信号或基团,该标记物、信号或基团易于通过本领域已知的方法检测,包括放射线照相、荧光、化学发光、酶活性、吸光度、免疫学检测等。可检测标记可包括放射性同位素、荧光团、生色团、酶、染料、金属离子、配体、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素和半抗原、量子点、多组氨酸标签、myc标签、flag标签、人流感血凝素(ha)标签等。可检测标记可以位于它们所连接、掺入或缀合的实体中的任何位置。例如,当连接、掺入肽或蛋白质中或与肽或蛋白质缀合时,它们可以在氨基酸、肽或蛋白质内,或位于n-或c-末端。
结构域:如本文所用,术语“结构域”是指具有一个或多个可识别的结构或功能特征或性质(例如结合能力,用作分子相互作用位点)的多核苷酸的基序。
荧光偏振(fp):如本文所用,术语“荧光偏振(fp)”是指由荧光团带来的平面偏振光的定向的变化,所述荧光团在其荧光寿命期间经历显著的分子运动。该寿命定义为激发光子吸收和光子通过荧光发射之间的时间段。通常,由荧光团吸收的平面偏振激发光旋转至与荧光团发射荧光之前相同的分子旋转程度。大多数荧光团是小分子并且快速旋转。平面偏振光的偏振或去偏振的可测量变化可在其荧光寿命期间发生。如果荧光团与小配体连接,仍可能发生显著的去偏振。去偏振的程度为定量荧光配体(检测试剂)与靶标(例如变应原蛋白)的特异性结合提供了基础。如果小的检测试剂结合明显更大的靶标(例如变应原蛋白),则检测试剂使平面偏振光去偏振的能力严重降低,靶蛋白增加的分子体积将大大减少分子在荧光寿命期间的旋转。事实上,特异性结合的程度可以通过测量去偏振的程度来定量。特异性结合越大,原始平面偏振光的去偏振越少。fp信号表示为荧光强度的比率。因此,信号不受检测试剂浓度变化所引起的强度变化的影响。这是因为荧光团使光去偏振的能力不是其浓度的函数;相反,它是在荧光寿命期间自由旋转的能力的函数。
包括:如本文所用,术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
相互作用:如本文所用,术语“相互作用”是指当两个或更多个分子彼此影响时发生的一种作用。在本发明中,检测分子和靶标之间的相互作用影响检测分子的结构,并且所述影响将产生能够可视化的能量变化。
环:如本文所用,术语“环”是指多核苷酸的结构特征,其反转了序列主链的方向,包含四个或更多个核苷(或核苷酸)残基。
多核苷酸:如本文所用,术语“多核苷酸”是指核碱基聚合物或寡聚物,其中核碱基通过糖磷酸键(糖-磷酸主链)连接。示例性的多核苷酸和寡核苷酸包括2'脱氧核糖核苷酸(dna)的聚合物和核糖核苷酸(rna)的聚合物。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸组成,完全由2'脱氧核糖核苷酸或其组合组成。
多核苷酸变体:如本文所用,术语“多核苷酸变体”是指与天然或起始序列相比在其核酸序列上具有某些差异的分子。
样品:如本文所用,术语“样品”是指可能含有所关注的待分析的靶标的任何组合物,包括但不限于,从受试者(包括如下详述的人和动物)获得的生物样品、从环境中获得的样品,例如土壤样品、水样、农业样品(包括植物和作物样品),或食品样品。食物样品可以从新鲜食物、加工/烹饪食物或冷冻食物中获得。
灵敏度:如本文所用,术语“灵敏度”是指检测分子与靶分子结合的能力。
特异性结合:如本文所用,术语“特异性结合”是指与其他靶标的反应或缀合相比,检测分子(例如,适体)与特定靶标(如变应原蛋白)更频繁、更快速、更长时间和/或更大亲和力地反应或缀合。例如,相较于与无关蛋白和/或其片段的结合相比,特异性结合变应原蛋白的适体以更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长时间结合该变应原蛋白质或其片段。本领域技术人员还通过该定义理解,例如,特异性结合第一靶标的检测分子(例如,适体)可以与或不与第二靶标特异性结合。因此,“特异性结合”并不必然要求与另一分子的排他性结合或不可检测的结合,这包括在术语“选择性结合”中。通常但不是必然,提及结合时是指特异性结合。相较于适体与环境中的其他材料或者通常无关的分子之间的解离常数,就适体对靶标的相对解离常数(kd)而言定义结合的特异性。通常,适体与靶标的kd低于靶标和环境中不相关材料或伴随材料的kd2倍、5倍或10倍。甚至更优选地,kd低于25倍、50倍、75倍、100倍、150倍或200倍。
靶标:如本文所用,术语“靶标”和“靶分子”是指可以在测试样品中发现并且能够结合检测分子例如适体或抗体的分子。
末端(复数)或末端(单数):如本文所用,术语“末端(复数)”或“末端(单数)”是指多核苷酸的末端。所述末端不仅限于多核苷酸的第一个或最后一个位点,还可以在末端区域包括另外的核苷(或核苷酸)。本发明的多核苷酸可以表征为具有5’端和3’端。
通用缓冲液:如本文所用,术语“通用缓冲液”是指可用于多种样品的缓冲液。
其他实施方案
应当理解,已经使用的词语是描述性词语而不是限制性的,并且可以在所附权利要求的范围内在更宽泛的方面对其进行改变而不脱离本发明的真实范围和精神。
虽然已经相对于所描述的若干实施方案以一定长度和某些特定方面描述了本发明,但是并不表明本发明将限于任何所述细节或实施方案或任何特定实施方案,而是应当参考所附权利要求对其进行解释,以便鉴于现有技术提供对这些权利要求的尽可能广泛的解释,并因此有效地包含本发明的预期范围。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用整体并入。如果发生冲突,以本说明书包括定义为准。另外,章节标题、材料、方法和示例仅是说明性的而不是限制性的。
实施例
实施例1:选择结合变应原蛋白的适体
进行基于selex方法进行体外筛选实验,在反向-标靶(非靶蛋白质的组合)中选择针对变应原靶标的适体,所述变应原靶标包括蛋、面筋、奶、大豆、鱼、花生、腰果和甲壳类动物,并对它们检测靶食物变应原的能力进行进一步工程化。
实验计划
在23℃下在选择缓冲液中采用不同rna文库选择结合能力,选择缓冲液由100mmtris(ph8)、5mmedta、150mmnacl、10mmmgcl2、0.1%sds、0.1%明胶、1%np-40(tergitol)、0.5%脱氧胆酸钠组成。给定轮次的选择开始于仅在缓冲液中孵育rna文库成员(阴性选择),然后收集未响应的文库部分(即切割)。每轮的第二部分(当需要时)包括将来自先前阴性选择步骤的非响应分子与非阳性靶标(作为反向物(counter))的全部组合进行孵育,或者仅再次与选择缓冲液一起孵育以进行第二次阴性选择。再次,收集未响应(非切割)分子。每轮的最后步骤包括将来自前一步骤的材料与缓冲液中的阳性靶标(适当的每种变应原)一起孵育,然后收集响应材料(即切割的rna)。每轮选择之后进行逆转录以产生cdna,通过pcr进行文库扩增,并通过转录再生rna文库。在使不同随机序列的初始文库经历不同的连续轮次选择(即,阴性,反向和阳性选择)之后,再次根据项目,将富集的文库分成三个部分以进行平行评估。
在阴性,反向和阳性选择轮次之后,对富集的文库进行的平行评估涉及同时将富集文库的三分之一单独暴露于选择缓冲液中,另一个三分之一暴露于选择缓冲液中的反向-靶标复合物中,富集文库的最后三分之一暴露至位于缓冲液中的目标变应原。在进一步的生物信息学分析过程中,确定并丢弃不加选择地与靶变应原和反向-靶标反应,或者在没有靶变应原的情况下仍然产生响应的任何残留的rna分子。
将平行评估后的经富集的rna文库进行page凝胶评估。将40pmole的富集文库分别暴露于选择缓冲液中的阴性(仅缓冲液),反向靶标或靶变应原(例如,奶、小麦、蛋白和花生)。在23℃孵育5分钟后,收集表现出阳性反应(即切割)材料的文库,乙醇沉淀,逆转录和pcr扩增,用于测序和生物信息学分析。
材料和方法
如果需要,在与不含rna酶的水组合用于初步分析和适体筛选之前,将靶标(来自腰果、花生、鱼、奶、大豆、面筋、蛋和甲壳类动物的蛋白质复合物)干燥。需要时,通过未被指定为用于选择的阳性靶标的适当量靶标合并,将靶标汇合以产生反向靶标混合物。初始适体文库模板和引物由idt(coralville,ia)合成为单链dna。然后使用来自clontech(mountainview,ca)的钛taqdna聚合酶对文库进行引物延伸以提供双链dna(dsdna)。
根据实验计划,对于给定代的文库,使用epicenter(madison,wi)的ampliscribet7转录试剂盒从先前的dsdna转录rna,并使用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)进行纯化。将纯化的rna与选择缓冲液合并,然后将其稀释至1x浓度(100mmtris(ph8)、5mmedta、150mmnacl、10mmmgcl2、0.1%sds、0.1%明胶、1%np-40(tergitol)、0.5%脱氧胆酸钠)用于阴性选择。阴性选择开始于复性循环,其涉及将样品加热至65℃以使rna变性,然后将样品置于23℃以进行剩余的孵育。孵育后,采用10%变性page从切割的rna中分离未切割的rna。取决于选择步骤,将回收的未切割的材料与反向靶标和缓冲液、靶标和缓冲液、或单独的缓冲液组合,在23℃孵育,并在10%变性page上分离。如果需要,进行回收和另一选择步骤。然后使用superscriptii反向转录酶(lifetechnologies;carlsbad,ca)从洗脱的选择后文库中产生cdna,然后用钛taqdna聚合酶(clontech;mountainview,ca)进行pcr扩增以完成选择轮次。在几轮选择步骤后,文库被富集并显示阴性切割量小于30%,并且与反向物相比,阳性处理中的切割至少多5%。
对由大约1014个随机序列组成的初始文库进行不同轮次的基于核酶的selex,以富集与靶变应原结合的序列,并消除在多轮选择中与反向靶标结合的序列。结果,待测序的群体预计含有潜在适体候选物的多个拷贝(vansimaeys等,studyofthemolecularrecognitionofaptamersselectedthroughovariancancercell-selex,2010,plosone,5(11):e13770)。测序和生物信息学
实施illumina(sandiego,ca)miseq系统采用配对端读取技术在选择后对适体进行测序。测序数据的生物信息学分析鉴定了候选适体分子。深度测序和随后的数据分析减少了执行大量选择的传统方法,传统方法可能由于筛选过程而引入错误和偏差(schütze等人,probingtheselexprocesswithnext-generationsequencing,plosone,2011,6(12):e29604)。
适体候选物的选择
序列家族构建集中于基序存在,其意味着在阳性靶群体中的序列频率被考虑在内,但更加强调整个群体中子序列的普遍性(在整个序列中,加入一个家族并不需要100%匹配)。使用另外两个因素来调整基序家族大小的重要性以确定候选序列。一个因素是阴性和反向靶标群体中存在的序列。从平行评估中收集了三个文库:阳性靶标暴露文库,仅缓冲液的阴性文库和反向靶标暴露文库。分析所有文库以发现在阴性或反向选择步骤期间尚未除去、但仍然对靶标和反向靶标具有亲和力的任何序列。比在反向靶标暴露群体中更频繁地出现在阳性群体中的给定序列成为有吸引力的候选物,供进一步测试。
采用mfold二级结构建模软件(zucker,mfoldwebserverfornucleicacidfoldingandhybridizationprediction,nucleicacidsres.,2003,31(13):3406-3415)预测给定候选序列的二级结构。
选择一组适体序列并进一步设计为用于检测不同食物变应原的信号传导多核苷酸,所述食物变应原包括腰果、花生、蛋白、小麦、鱼、大豆、奶和甲壳类动物。表1列出了限定对所选择的适体的每个变应原具有结合特异性的全长序列和核心序列。然后,每种食物变应原的所选适体在5’端和3’端中的任一个或两个进行进一步修饰,以优化其与靶变应原的结合亲和力。在5’端具有荧光团探针(例如,德克萨斯红)的修饰序列是将被测试用于如本文所述的变应原检测的信号传导多核苷酸。
实施例2:信号传导多核苷酸的产生
作为概念验证的示例,采用经实施例1所示的筛选所选择的两个适体来设计不同的信号传导多核苷酸。策略是尽可能多地删除用于筛选的引物,但保持核心结合序列以确保对靶变应原的特异性。
对花生具有特异性的信号传导多核苷酸
采用经筛选(实施例1)选择的、对花生具有特异性的适体。适体的全长序列如下所示。
5’taatacgactcactataggcgtagcctgatgagctcaccacataccatgtaccacgtgcgaaacgtggtgaaagccacgtagctgcgcc3’(7ribospn_全长序列;seqidno.:83)
结合花生的核心序列如下所示:
5’ctcaccacataccatgtaccacgtg3’(7spn-核心序列;seqidno.:84)
对seqidno.:83的原始全长序列进行修饰,从而在5’端和3’端删除尽可能多的引物而不改变seqidno:84的结合序列。在5’端或3’端或两个末端还添加额外的核苷酸。对不影响结合序列并形成开放单一结构的最短序列进行变应原检测。得到的信号传导多核苷酸包括7spn-a(seqidno.:85)、7spn-b(seqidno.:86)、7spn-c(seqidno.:87)、7spn-d(seqidno.:88)、7spn-e(seqidno.:89)、7spn-f(seqidno.:90)、7spn-g(seqidno.:91)、7spn-h(seqidno.:92)、7spn-i(seqidno.:93)、7spn-j(seqidno.:94)、7spn-k(seqidno.:95)和7spn-l(seqidno.:96)。
对蛋具有特异性的信号传导多核苷酸
采用经筛选(实施例1)选择的、对蛋具有特异性的适体。适体的全长序列如下所示。
5’taatacgactcactataggcgtagcctgatgagccaactgtgcacactgttcgcttatcgagctgtgtacctccatagcgaaacgtggtgaaagccacgtagctgcgcc3’(17ribospn_全长序列;seqidno.:228)。
结合花生的核心序列如下所示:
5’ccaactgtgcacactgttcgcttatcgagctgtgtacctccatag3’(17spn-核心序列;seqidno.:229)
对seqidno.:228的原始全长序列进行修饰,从而在5’端和3’端删除尽可能多的引物而不改变seqidno:229的结合序列。在5’端或3’端或两个末端还添加额外的核苷酸。对不影响结合序列并形成开放单一结构的最短序列进行变应原检测。得到的信号传导多核苷酸包括17spn-a(seqidno.:230)、17spn-b(seqidno.:231)、17spn-c(seqidno.:232)、17spn-d(seqidno.:233)、17spn-e(seqidno.:234)、17spn-f(seqidno.:235)、17spn-g(seqidno.:236)和17spn-h(seqidno.:237)。
以类似的方式,基于经筛选选择(表1)的和公开的文献序列(表2)的适体序列设计信号传导多核苷酸。信号传导多核苷酸通过测量荧光偏振变化用于变应原检测。
实施例3:荧光偏振测量
结合花生变应原的信号传导多核苷酸7spn-a(seqidno.:85)、7spn-b(seqidno.:86)、7spn-c(seqidno.:87)用荧光团德克萨斯红在5’端标记(用spn-p表示)。采用t缓冲液处理含有花生的几种不同食物样品。每种测试使用20μl样品。测量spn-p(20μl浓度为100μm的spn-p)或不含spn-p的荧光偏振。表3列出了研究设计。在商业fp设备中测量fp变化。
表3:含有花生酱(pb)的样品的spn结合试验
类似地,结合蛋变应原的信号传导多核苷酸17spn-a(seqidno.:230)、17spn-b(seqidno.:231)、17spn-c(seqidno.:232)、17spn-d(seqidno.:233)在5’端用荧光团德克萨斯红标记。德克萨斯红标记的信号传导多核苷酸用于测试变应原结合时的荧光偏振变化。
序列表
<110>多茨技术公司(dotstechnologycorp.)
<120>变应原检测的系统和方法
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