用于检测凝血因子的化学发光生物传感器的制作方法

本公开涉及一种用于在非常短的一段时间内检测血液样本中的凝血因子的化学发光生物传感器、一种监测凝血因子的方法、一种量化血液样板中的凝血因子的方法、以及一种用于量化血液样板中的凝血因子的试剂盒。该生物传感器包括：用于凝血因子的荧光底物，其中，该荧光底物包括荧光染料；以及与荧光底物共轭的淬灭剂。

背景技术：

常规凝血是形成凝块的过程，对于出血性损伤非常重要，因为该过程会止住出血，使伤口可以愈合。然而，血液在流经身体时不应该凝结，因为凝结能引起高凝状态或者血栓症。静脉或者静脉系统中能够行经血流的血凝块能引起深静脉血栓或者肺栓塞。另外，动脉中的血凝块能阻碍血液流到主要的器官。因此，动脉血栓能引起多种严重病症，诸如心脏病发作、中风、腿部剧痛、行走困难、以及截肢。

为了防止出血、血栓形成和中风，已经开发出了多种类型的抗凝剂。具体地，抗凝剂被广泛用作预防和治疗无数心血管疾病的药剂。抗凝剂已经被开发出来用于控制凝血因子(例如，iia、xa)的活性(浓度)，如图1a所示。这是因为可以使用恰当的抗凝剂降低因子iia或者xa的活性来预防出血、血栓形成和中风。近年来，我们已经看到使用口服抗凝剂(doacs)替代传统抗凝药剂(诸如，华法令阻凝剂(warfarin)、苯丙香豆素(phenprocoumon)、和肝素)增加了。目前，抑制因子xa(例如，利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班)和iia(例如，达比加群酯)的doac被广泛使用。

抗凝剂可以预防或者治疗急性或者慢性血栓栓塞疾病。然而，抗凝药剂的副作用，诸如出血过多，可能会引起长期的衰竭性疾病或者可能会危及性命。通常，抗药剂的副作用可能会立即发生或者在几个小时内发生。准确地监测抗凝剂的药效的最好方法可能是快速量化在患者服用抗凝剂之后仍然呈活性的专用凝血因子(例如，iia和xa)。遗憾的是，尚无能够在几分钟内直接量化凝血因子的分析方法。

作为一种替代方法，可以用于在体外条件下测量凝血时间的国际标准化比值(inr)被广泛用来研究因子iia抗凝剂的药效。然而，使用inr难以预测iia抗凝剂的副作用，这是因为inr的值依赖于患者的疾病。例如，从带人工心瓣的患者确定的inr的值低于期望的inr目标范围。

近年来，已经开发出了大量使用两个dna适体的高敏感度生物传感器来量化因子iia。然而，因为dna适体无法快速地结合到人类样本(例如，血浆、全血)中的因子iia，所以这些生物传感器无法适用于准确且快速地预测因子iia抗凝剂的副作用。为了提高在dna适体与因子iia之间的结合率，用恰当的缓冲液将人类样本进行100到10000倍的稀释。另外，为了使用生物传感器来量化因子iia，多次培养和清洗是必要的。因此，这些生物传感器无法被用于快速地监测抗凝剂的副作用。

inr和部分凝血活酶时间(aptt)不适合因子xa抗凝剂的评估。然而，可以使用夹心酶免疫分析法(使用了结合到因子xa抗凝剂的两个单克隆抗体)来研究因子xa抗凝剂的功效。但是，使用这种耗时的夹心酶免疫分析法仍然难以快速地预测因子xa抗凝剂的副作用。

在身体中充当酶的蛋白酶可以通过结合专用内源性肽和蛋白的氨基酸侧链来识别和水解该专用内源性肽和蛋白。专用内源性肽和蛋白是能够与专用酶反应的底物。通过使用水解反应，已经开发出了多种具有吸收和荧光检测功能的生物传感器来量化和监测专用蛋白酶(一种用于早期诊断人类疾病的生物标记)。图1b示出了在蛋白酶与同用于测量吸收或者荧光的发色团或荧光染料共轭的底物之间的反应的基本构思。随着蛋白酶浓度的增加，吸收度或者荧光强度也得到提高。因子iia和xa称为蛋白酶蛋白。因此，已经开发出了能够与因子iia或者xa反应的多种底物。而且，已经开发出了具有紫外可见吸收或者荧光检测功能的多种生物传感器来对因子iia或者xa进行量化。遗憾的是，这些生物传感器都不合适，因为对人类样本中的iia或者xa进行量化所需的时间太长，以致于不能在几分钟内监测到iia或者xa抗凝剂的副作用。

已经已知的是，从图1c所示的反应机制生成的1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)比吸收和荧光检测功能更敏感10到1000倍。而且，具有odi-cl检测功能的生物传感器的动态范围比具有吸收或者荧光检测功能的生物传感器宽得多。图1c所示的发光体是能够接收来自高能量中间体的能量以如图1d所示发出明亮的且快速的发光的荧光染料。

然而，尚未开发出在几分钟内检测/量化血液样本中的凝血因子(例如，iia、xa)以便最小化或者消除任何不利的副作用的高敏感度生物传感器。

技术实现要素：

根据本发明的一个方面，提供了一种用于检查血液样本中的凝血因子的生物传感器，其包括：用于凝血因子的荧光底物，其中，荧光底物包括荧光染料；以及与荧光底物共轭的淬灭剂。凝血因子可以是凝血因子iia或者xa，并且血液样本是血浆或者全血。血液样本可以是经过1到1000倍稀释的血浆或者全血。荧光染料可以是选自由以下组成的组的至少一种：2-氨基苯甲酰(abz)、n-甲基-氨茴酰(n-me-abz)、5-(二甲氨基)萘-1-磺酰基(丹酰)、5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸(edans)、7-二甲氨基香豆素-4-乙酸(dmaca)、7-氨基-4-甲基香豆素(amc)、(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基(mca)、若丹明、若丹明101、若丹明110和试卤灵。当发生以下情况时，荧光染料可以发光：荧光染料通过在凝血因子与荧光底物之间的水解反应与荧光底物解离；以及当荧光染料与由1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂形成的高能量中间体相互作用时。1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂可以包括odi和h2o2。淬灭剂是选自由以下组成的组的至少一种：2，4-二硝基苯基(dnp)、n-(2，4-二硝基苯基)乙二胺(eddnp)、4-硝基-苯丙氨酸、3-硝基酪氨酸、对硝基苯胺(pna)、4-(4-二甲氨基偶氮苯)苯甲酰(dabcyl)和7-硝基-苯并[2，1，3]恶二唑-4-基(nbd)。

根据本发明的另一方面，一种用于监测血液样本中的凝血因子的方法，包括：在缓冲液中将权利要求1的生物传感器与包括凝血因子的血液样本混合并反应；向反应混合物添加1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂；以及测量cl强度。在室温(21±2℃)下或者在37℃下在血液样本与生物传感器中的荧光底物之间的反应时间为10秒到120分钟。在添加odi-cl试剂之后，测量cl强度可以进行1到10秒。凝血因子可以是凝血因子iia或者xa，并且血液样本可以是血浆或者全血。缓冲液可以选自由pbst、pbs、tbst和tbs组成的组。

在根据本发明的又一方面，一种用于量化血液样本中的凝血因子的方法，包括：在缓冲液中将权利要求1的生物传感器与包括凝血因子的血液样本混合并反应；向反应混合物添加1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂；测量cl强度；以及将cl强度与标准强度相比较。

在根据本发明的再一方面，一种用于量化血液样本中的凝血因子的试剂盒，包括：生物传感器；以及容器。试剂盒可以进一步包括：缓冲液；以及1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂。

本领域的普通技术人员通过阅读和理解以下说明会了解到这些和其它方面。

附图说明

图1a示出了xa和iia在血液级联系统中的作用。

图1b是在蛋白酶与同发色团或者荧光染料共轭的底物之间的水解反应的示意图。

图1c示出了1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)的反应体系，其中，l是处于基态的发光体并且l*是处于激发态的发光体。

图1d示出了快速odi-cl光谱的曲线图。

图2a是示出了当不存在和存在凝血因子iia(5nm)或者xa(5nm)时的相对cl强度的曲线图。

图2b描绘了当血浆中不存在诸如因子iia和xa等生物标记时的化学发光共振能量传递(cret)。

图2c描绘了当存在荧光底物和蛋白酶时的odi-cl反应。

图2d示出了在荧光底物与凝血因子iia或者xa之间的水解反应。

图2e示出了当存在通过在荧光底物与凝血因子(例如，iia、xa)之间的水解反应形成的荧光染料(例如，amc)时的odi-cl反应。

图3a示出了当存在凝血因子iia时通过在pbs中使用与amc共轭的专用底物产生的血浆的效果的曲线图。

图3b示出了当存在凝血因子xa时通过在pbs中使用与amc共轭的专用底物产生的血浆的效果的曲线图。

图3c是示出了为了量化10％人类血浆中的凝血因子iia(6.8nm)而进行缓冲液选择的曲线图。

图3d是示出了量化10％人类血浆中的凝血因子xa(10nm)而进行缓冲液选择的曲线图。

图4a是示出了用具有odi-cl检测功能的快速生物传感器量化凝血因子iia的校准曲线的曲线图。

图4b是示出了为了用具有odi-cl检测功能的快速生物传感器量化凝血因子xa的校准曲线的曲线图。

图4c是示出了在用于量化人类血浆中的凝血因子iia的odi-cl与荧光检测之间的相关性(n＝10)的曲线图。(各个值的误差范围为4％-7％)。

图4d是示出了在用于量化人类血浆中的凝血因子xa的odi-cl与荧光检测之间的相关性(n＝10)的曲线图。(各个值的误差范围为4％-7％)。

图5a是示出了当全血中不存在和存在凝血因子iia时培养时间的效果的曲线图。

图5b是示出了当全血中不存在和存在凝血因子xa时培养时间的效果的曲线图。

图5c是示出了随着在iia荧光底物与全血(n＝5)中的凝血因子iia之间的反应(培养)时间的延长相对cl强度的提高的曲线图。

图5d是示出了随着在xa荧光底物与全血(n＝5)中的凝血因子xa之间的反应(培养)时间的延长相对cl强度的提高的曲线图。

图6a是示出了通过使用具有odi-cl检测功能的生物传感器能够快速地量化全血中的凝血因子iia的痕量水平的校准曲线的曲线图。

图6b是示出了通过使用具有odi-cl检测功能的生物传感器能够快速地量化全血中的凝血因子xa的痕量水平的校准曲线的曲线图。

图6c是示出了与amc共轭的xa荧光底物的选择性和特异性的曲线图。

图6d是示出了与amc共轭的iia荧光底物的选择性和特异性的曲线图。

图7是示出了当存在amc(12.5μm)作为发光体(荧光染料)时在odi-cl反应中血浆的效果的曲线图。各个样本被制备成是amc的tbst溶液与某个百分比浓度的用h2o稀释之后的人类血浆的混合物(体积比＝1：1)。

图8是示出了在四种不同缓冲溶液中amc(25μm)的相对cl强度的曲线图。

图9是示出了在量化10％人类血浆中的iia(3.4nm)的不同反应(培养)时间内的cl3.4/cl0的曲线图。

图10是示出了用于量化人类全血中的xa的稀释作用的曲线图。经过稀释的全血和荧光底物的反应时间为2、4和10分钟。

图11是示出了当存在amc(25μm)作为发光体(荧光染料)时在odi-cl反应中在全血中的成分的效果的曲线图。

图12a是示出了用于开发具有odi-cl检测功能的生物传感器的iia荧光底物的特异性和选择性的曲线图。浓度：[iia]＝28.6ng/ml、[葡萄糖]＝106ng/ml、[血红蛋白]＝106ng/ml、[hsa]＝106ng/ml、[igg]＝106ng/ml。

图12b是示出了用于开发具有odi-cl检测功能的生物传感器的xa荧光底物的特异性和选择性的曲线图。浓度：[xa]＝10.8ng/ml、[葡萄糖]＝106ng/ml、[血红蛋白]＝106ng/ml、[hsa]＝106ng/ml、[igg]＝106ng/ml。

具体实施方式

根据本发明的实施例，提供了一种用于检查血液样本中的凝血因子的生物传感器，该生物传感器包括：用于凝血因子的荧光底物，其中，荧光底物包括荧光染料；以及与荧光底物共轭的淬灭剂。当荧光染料通过在凝血因子与荧光底物之间的水解反应与荧光底物解离时，以及当荧光染料与由1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂形成的高能量中间体相互作用时，荧光染料发光。1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂可以包括odi和h2o2。

在荧光底物中使用的荧光染料可以是以下中的至少一种：2-氨基苯甲酰(abz)、n-甲基-氨茴酰(n-me-abz)、5-(二甲氨基)萘-1-磺酰基(丹酰)、5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸(edans)、7-二甲氨基香豆素-4-乙酸(dmaca)、7-氨基-4-甲基香豆素(amc)、(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基(mca)、若丹明、若丹明101、若丹明110和试卤灵。在本说明书中，amc用作示例，但是可以单独地或者彼此组合地使用其它荧光染料。

生物传感器中使用的淬灭剂是以下中的至少一种：2，4-二硝基苯基(dnp)、n-(2，4-二硝基苯基)乙二胺(eddnp)、4-硝基-苯丙氨酸、3-硝基酪氨酸、对硝基苯胺(pna)、4-(4-二甲氨基偶氮苯)苯甲酰(dabcyl)和7-硝基-苯并[2，1，3]恶二唑-4-基(nbd)。

本发明的凝血因子可以是在凝血级联中涉及的任何类型的凝血因子。在各种凝血因子中，因子iia(凝血酶)和因子xa是优选的。

如图2a所示，在用于凝血因子iia(或者xa)的荧光底物中的荧光染料(例如，amc)在不存在凝血因子iia(或者xa)的odi-cl检测系统中不会发光。这是因为荧光染料(amc；发光体(l))是由通过odi与h2o2之间的反应形成的高能量中间体激发的，由于化学发光共振能量传递(cret)，将能量传递至与荧光底物共轭的淬灭剂(q)，如图2b所示。图2a示出了存在凝血因子(5nm)时的相对cl强度比不存在凝血因子时的相对cl强度高得多。结果可由图2c所示的反应图解来图示。荧光底物被在荧光底物与凝血因子之间的水解反应分开。因此，未与淬灭剂结合的荧光染料(发光体)在odi-cl反应中可以发光。图2d示出了，由于在凝血因子iia(或者xa)与用于凝血因子的专用荧光底物之间的水解反应，荧光染料(amc)被分开。在图2e所示的示例中，由通过odi-cl反应形成的高能量中间体(x)激发的amc可以发出(蓝色的)光。

下面的表1示出了iia专用荧光底物和xa专用荧光底物的示例性结构。

[表1]

在本发明中，血液样本可以是血浆或者全血。血液样本可以被原样使用，或者可以经过1到1000倍稀释后使用。图7中示出了在使用amc(12.5μm)作为荧光染料的odi-cl反应中使用血浆的效果。如图所示，在0.1％-10％血浆(10到1000倍稀释)中amc的相对cl强度恒定处于在统计学上可接受的误差范围内(<5％)。在100％血浆中的相对cl强度低于在0.1％-10％血浆中的相对cl强度，这是因为人类血浆中的一些成分在odi-cl反应中可能会充当抑制剂或者淬灭剂。

图3a和图3b示出了根据血浆浓度在生物传感器中发出的odi-cl的敏感度。当人类血浆的组成被稀释时，提高了信号/背景比(cliia/cl0或者clxa/cl0)。因此，使用经过10到1000倍稀释的人类血浆的生物传感器可以比使用100％人类血浆的生物传感器更敏感。另外，10％人类血浆中的信号/背景比要比0.1％人类血浆中的信号/背景比低大约50％。这些结果表明，针对用经过10倍稀释的人类血浆操作的生物传感器的检测极限(lod＝3σ)可能与用经过1000倍稀释的人类血浆生成的生物传感器的检测极限一样低或者略高。σ是当不存在凝血因子iia或者xa时测得的背景的标准偏差。

在本发明中，生物传感器中包括的专用于凝血因子的肽可以与缓冲剂中的凝血因子反应。缓冲剂可以是以下中的任何一种：含吐温-20的磷酸盐缓冲盐水(pbst)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tbst)、和三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tbs)。如图8所示，从tbs中的amc(25μm)发出的光比其它缓冲溶液中的amc发出的光更亮。结果表意味着，tbs是能够快速地量化通过凝血因子iia(或者xa)与同图2d所示amc共轭的专用底物之间的水解反应形成的amc的痕量水平的odi-cl生物传感器的最好缓冲溶液。然而，图3c和图3d表明，用于在凝血因子iia与同amc共轭的底物之间的水解反应的最好缓冲剂是tbst，而pbs是用于在凝血因子xa与底物之间的水解反应的最好缓冲剂。这些结果表明，通过凝血因子与同amc共轭的专用底物之间的水解反应形成的amc的产率取决于缓冲溶液的类型。例如，图3c示出了在tbst中进行2分钟的水解反应之后测得的相对cl强度最强。因此，图8和图3c所示的结果表明，通过在tbst中进行2分钟的水解反应形成的amc的浓度高于在其它缓冲溶液中的浓度。换言之，在tbst中的水解反应比在其它缓冲溶液中的水解反应更快。作为另一示例，图3d示出了，用于使用具有odi-cl检测功能的生物传感器量化凝血因子xa的最好缓冲溶液是pbs，这是因为在pbs中进行2分钟的水解反应形成的amc的浓度高于在pbst、tbs和tbst中的浓度。基于这些结果，对于监测/量化人类样本中的iia，tbst可以是优选的，而对于监测/量化人类样本中的xa，pbs可以是优选的。

在本发明中，在室温(21±2℃)下或者在37℃下在血液样本与生物传感器中的荧光底物之间的反应(水解)时间可以控制在大致10秒到120分钟范围内。优选地，反应(水解)时间可以控制为1-30分钟，并且最优选地，1-4分钟。图9示出了具有odi-cl检测功能的生物传感器的敏感度取决于在凝血因子与同amc共轭的底物之间的水解反应所需的培养时间。随着水解反应(培养)时间的增加，cl3.4/cl0得到提高。用在4分钟的培养之后测得的相对cl强度计算得到的cl3.4/cl0与用在5分钟的培养之后测得的相对cl强度计算得到的cl3.4/cl0相似。因此，通过使用具有odi-cl检测功能的生物传感器和与tbst中的amc共轭的底物，可以使用于量化10％人类血浆中的凝血因子iia所需的反应(水解)时间为4分钟。另外，根据图9中的本发明的示例性实施例，1分钟的培养时间也是可能的。这是因为，在1分钟的培养(水解)之后检测到的3.4nm低于在10％人类血浆中的正常范围(10-15nm)，即使预计用1分钟的培养操作的生物传感器的敏感度可能不如4分钟的培养之后生成的生物传感器的敏感度好。因此，利用10％人类血浆与同tbst中的amc共轭的底物的混合物的较短培养(1-4分钟)，具有odi-cl检测功能的生物传感器可以用于快速地量化凝血因子iia。

该反应(水解)时间也可适用于能够在pbs中感测在10％人类血浆中的凝血因子xa的生物传感器。下表示出了用于量化10％人类血浆中的凝血因子xa的odi-cl和荧光(传统的)的归一化强度。

[表2]

*利用odi-cl或者荧光检测测得的各个值的误差范围为3％-7％。

**用于荧光测量的激发波长和发射波长为342nm和440nm。

如表2所示，具有odi-cl检测功能的生物传感器比传统的具有荧光检测功能的传感器敏感得多。odi-cl能够检测0.02nmxa，在大气条件下仅需要2分钟的培养时段，而荧光检测，由于在操作光源时会生成高背景，所以即使是进行30分钟的培养，也难以充分地感测0.11nmxa。具有荧光检测功能(一种传统的方法)的生物传感器的敏感度被用来与具有odi-cl检测功能的生物传感器相比较。(https：//www.mybiosource.com/prods/assay-kit/factor-xa/datasheet.php？products_id＝841634)。

根据本发明的另一实施例，提供了一种使用上述生物传感器来监测/量化血液样本中的凝血因子的方法。该方法包括：在缓冲液中将生物传感器与包括凝血因子的血液样本混合并反应；向反应混合物添加1，1'-乙二酰二咪唑化学发光(odi-cl)试剂；以及测量cl强度。在室温(21±2℃)下或者在37℃下在血液样本与生物传感器中的荧光底物之间的反应(水解)时间可以为10秒到120分钟，并且在添加odi-cl试剂之后，测量cl强度可以进行1到10秒。

利用凝血因子iia(和xa)与同amc共轭的底物的2分钟的培养，如图4a和图4b所示，具有odi-cl检测功能的生物传感器可以用宽线性校准曲线快速地量化iia和xa的痕量水平。用于量化因子iia的线性校准曲线的动态范围宽达0.3到27.2nm。能够分析因子iia的生物传感器的lod低至104pm。同样，用于量化因子xa的线性校准曲线的动态范围宽达0.25到20nm。生物传感器的lod低至44pm。通过使用具有图4a和图4b所示优越线性校准曲线的生物传感器，本发明仅利用经过10倍稀释的血浆样本(而不是像在先前的生物传感器的情况中使用的经过100到10000倍稀释的血浆)就实现了对凝血因子的准确的、性价比高的、且快速的量化。图4c和图4d示出了在具有odi-cl检测功能的生物传感器和具有荧光检测功能的传统生物传感器之间的良好相关性。这些结果表明，利用混合物(例如，专用荧光底物、因子iia或者xa)的2分钟的培养而具有odi-cl检测功能的生物传感器可以是一种用于量化凝血因子的性价比高的、快速的和容易使用的诊断方法。

下面的表3示出了根据本发明的示例性实施例的具有odi-cl检测功能的生物传感器可以量化因子iia和xa，准确度、精确度和回收率都很好。因此，根据本发明的生物传感器可以统计学上可接受的再现性比传统生物传感器快得多地量化人类血浆中的因子iia和xa。

[表3](具有odi-cl检测功能的一体化生物传感器在量化人类血浆(n＝5)中的iia和xa方面的准确度、精确度和回收率)

全血中的因子iia和xa的分析

根据本发明的示例性实施例的生物传感器可以与全血(作为样本)一起使用。图10示出了生物传感器在全血样本(其中，全血样本是用去离子水进行10-40倍稀释的)中的应用，该应用再次表明具有odi-cl检测功能的生物传感器可以快速地量化在经过10倍稀释的全血中的凝血因子的痕量水平，与量化在经过10倍稀释的血浆中的凝血因子iia和xa相似。图5a和图5b还示出了与amc共轭的因子iia(或者xa)底物在不含iia(或者xa)的阴性样本中如此稳定使得在混合物(例如，阴性样本与同amc共轭的iia(或者xa)底物)的三次不同培养时间之后测得的相对cl强度恒定处于在统计学上可接受的误差范围(<5％)内。在含有iia和xa的痕量水平的患者样本(例如，经过10倍稀释的全血)中发出的光的强度随着培养时间的延长成比例地增加。样本的相对cl强度(在患者样本中加标了iia(2.5nm)或者xa(5nm))高于纯患者样本的相对cl强度，也取决于培养时间。

如图5c和图5d所示，全血样本的相对cl强度与其它四个全血样本的相对cl强度不同，这是因为各个全血样本中的iia和xa浓度不同。然而，随着培养时间的延长，也成比例地提高了各个全血样本的相对cl强度。因此，图5c和图5d表明，具有odi-cl检测功能的生物传感器可以快速地量化在患者样本(例如，经过10倍稀释的全血)中的iia(或者xa)的痕量水平，具有在统计学上可接受的精确度和再现性。

如图11所示，在10％全血中的amc的相对cl强度比在0.1％和1％全血中的amc的相对cl强度低大约50％，而在10％血浆中的amc的相对cl强度与在0.1％和1％血浆中的amc的相对cl强度相同(见图7)。同样，在100％全血中的amc的相对cl强度比在0.1％和1％全血中的amc的相对cl强度低大约60倍，图11所示的结果表明，在odi-cl反应中发出的amc的量子效率被10％和100％全血样本中存在的一些抑制剂降低。基于图7和图11所示的结果，预计人类全血可能含有能够在odi-cl反应中充当强抑制剂的一些成分。为了克服与在odi-cl反应中使用全血样本相关联的缺点，选择对混合物(例如，与amc共轭的iia(或者xa)底物和经过10倍稀释的全血样本)进行4分钟的培养，以便开发出能够快速地诊断和预防出血、血栓形成和中风的具有odi-cl检测功能的高敏感度生物传感器。因此，优选地，可以将量化全血中的iia和xa所需的反应(水解)时间设置为比在血浆中需要的时间长2倍。

图6a和图6b的线性校准曲线表明，具有odi-cl检测功能的生物传感器利用对混合物的4分钟的培养可以快速地量化患者全血中的iia和xa。能够量化iia和xa的生物传感器的lods在全血中低至66和18pm。在全血中生物传感器的lods低于在血浆中的lod，如表4所示，这是因为在全血中在生物传感器中应用的4分钟反应(水解)时间比在血浆中在生物传感器中选择的2分钟反应(水解)时间更长。这些结果表明，具有odi-cl检测功能的生物传感器的敏感度取决于在蛋白酶(例如，因子iia、xa)与同amc共轭的底物之间的水解反应所需的反应时间。因此，预计具有odi-cl检测功能的生物传感器的lod可能会根据在荧光底物与血浆或者全血中的凝血因子iia(或者xa)之间的水解反应所需的反应时间而有所不同。

[表4]

表4表明，能够量化血浆和全血中的iia和xa的具有odi-cl检测功能的生物传感器的敏感度与用经过10到100倍稀释的人类样本(诸如，血清和血浆)操作的其它方法一样低。

具有荧光染料(amc)的用于凝血因子iia和xa的荧光底物具有良好的特异性和选择性。图12a和图12b表明，本发明的荧光底物不会与全血中存在的其它主要蛋白(例如，葡萄糖、血红蛋白、has、igg)反应。随着培养时间的延长，可以提高当不存在和存在主要蛋白时生物传感器的相对cl强度，这是因为全血(例如，10％)含有iia和xa的痕量水平。

同样，图6c和图6d是关于测试与amc共轭的用于凝血因子iia和xa的荧光底物在存在抗凝剂的情况下是否可以专门地且选择性地与活性iia或者xa反应的实验。图6c和图6d表明，与生物传感器中应用的amc共轭的用于凝血因子iia和xa的荧光底物具有良好的特异性和选择性。与amc共轭的iia底物可以专门地与未与iia抗凝剂(例如，达比加群酯)结合的活性iia反应，而xa荧光底物可以选择性地与未与xa抗凝剂(例如，利伐沙班)结合的活性xa反应。因此，生物传感器确定：在具有如图6c所示的达比加群酯的患者全血中存在活性iia的痕量水平。因为xa不会与达比加群酯(图6c)结合，所以在xa与同具有达比加群酯的患者全血中的amc共轭的xa底物之间的反应之后测得的相对cl强度很强。如图6d所示，生物传感器确定：在具有利伐沙班的患者全血中的活性xa的浓度非常低。同样，图6d示出了：当存在xa抗凝剂的情况下，在患者全血中，在iia与同amc共轭的iia底物之间的反应之后测得的相对cl强度很强。总之，图6c和图6d所示的结果表明，用于amc共轭的底物操作的生物传感器可以用于预防出血、血栓形成和中风，具有优越的选择性和特异性。

表5表明用于全血的生物传感器的准确度、精确度和回收率与用于人类血浆的生物传感器一样好。

[表5](具有odi-cl检测功能的一体化生物传感器在量化全血(n＝5)中的iia和xa方面的准确度、精确度和回收率)

因此，根据本发明的示例性实施例的具有odi-cl检测功能的生物传感器可以快速地量化全血中的凝血因子iia和xa，与传统生物传感器相比，具有可接受的再现性。

另外，表6表明，利用具有odi-cl检测功能的生物传感器量化的在全血中的iia和xa的浓度与利用具有荧光检测功能的传统方法确定的浓度相同，在统计学上可接受的误差范围内。

[表6](利用具有odi-cl检测功能的生物传感器和利用具有荧光检测功能的传统方法(n＝3)对全血中的iia和xa的量化)

生物传感器以及使用上述生物传感器的方法可以被提供成试剂盒的形式。在本发明的一个实施例中，试剂盒包括上述生物传感器和容器。试剂盒可以进一步包括缓冲剂和odi-cl试剂(例如，odi和h2o2)。

因此，本发明提供了一种具有odi-cl检测功能的高性价比生物传感器，其可以被用作进行快速凝血测试的新装置。荧光染料(发光体)可以通过在凝血因子(例如，iia、xa)与专用荧光底物之间的快速反应形成。随着血液样本(例如，血浆、全血)中的凝血因子浓度的增加，在溶液中加入odi-cl试剂(例如，odi、h2o2)之后发出的光的强度也成比例地提高。预计具有odi-cl检测功能的生物传感器的宽动态范围可以诊断和监测患者的出血和凝块，具有在统计学上可接受的准确度、精确地和再现性。另外，因为不再需要样本预处理、耗时的多次培养和清洗，所以具有odi-cl检测功能的生物传感器的分析过程快速且简单。总之，本发明的具有odi-cl检测功能的生物传感器的构思和原理可以广泛地应用于诸如癌症、心脏疾病和传染性疾病(例如，hiv、sars、zika病毒)等人类疾病的早期诊断和快速监测。

示例

用以下材料和过程来进行本说明书中描述的实验。

化学品和材料

来自人类血浆的凝血酶(凝血因子iia，100un)和凝血酶的荧光底物(benzoyl-phe-val-arg-amc，hcl，25mg)购自西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)。因子xa(人类)天然蛋白购自invitrogen。因子xa的荧光底物(ch3so2-d-cha-gly-arg-amc，acoh)购自cryopep。作为荧光染料(发光体)的amc是7-氨基-4-甲基香豆素。用混合的人类供体(1g)冻干的正常血浆购自leebiosolution。双(2，4，6-三氯苯基)草酸酯(tcpo)和4-甲基咪唑(4mimh)购自tciamerica。3％和30％的h2o2购自vwr。去离子水(hplc级)、乙酸乙酯、异丙醇、和高浓度的pbs(ph7.4，20×)、tbs(ph7.4×10)、pbst和tbst购自emd。8孔eia/ria条孔板购自costar。人类血浆和全血由美国马里兰州黑格斯敦的meritusmedicalcenter提供。

通过使用odi-cl检测确定在凝血因子iia或者xa与专用荧光底物之间的化学反应

实验1：在odi-cl反应中仅当不存在因子iia或者xa时荧光底物的背景(图2a)

将各种荧光底物(5mg/ml)溶解在作为原液的dmso中。将原液储存在冷冻箱中(-80℃)。在进行本实验之前，制备稀释在pbs(ph7.4)中的荧光底物(5μg/ml)的工作溶液。将各种工作溶液(10μl)注入硼硅酸盐试管(12mm×75mm)中。将试管插入具有两个注射泵的光度计(lumatlb9507，berthold有限公司)的检测区域中。通过光度计的第一注射泵分出100mm的溶解在异丙醇中的h2o2(25μl)。在用第二注射泵添加odi(25μl)之后，我们看看各种荧光底物在不存在因子iia或者xa的情况下是否能发光。利用该过程，我们能够确定在odi-cl反应中当不存在因子iia和xa时荧光底物的背景。

实验2：通过荧光底物与凝血因子之间的反应形成的amc的cl发射(图2a)

用去离子水在经过10倍稀释的血浆中制备各种凝血因子(iia或者xa，5nm)。在pbs中制备各种荧光底物(5μg/ml)。在大气条件下，在条孔中将因子iia(50μl)和因子iia的荧光底物(50μl)的混合物培养2分钟。同样，在大气条件下，在条孔中将因子xa(50μl)和因子xa的荧光底物(50μl)的混合物也培养2分钟。在培养之后，将各种混合物(10μl)插入硼硅酸盐试管中。通过光度计的两个注射泵连续地分配h2o2(25μl)和odi(25μl)以测量试管中发出的光的相对cl强度。

实验3：用于量化凝血因子的荧光和odi-cl的敏感度(表2)

制备在10％人类血浆中的因子xa的12个标准品。在pbs中制备因子xa的荧光底物(5μg/ml)。在条孔中，将各种标准品溶液(50μl)与荧光底物(50μl)混合。在大气条件下，将混合物培养2分钟。在培养之后，使用实验1和2中描述的相同方法操作的光度计来测量各个样本的相对cl强度。为了测量各个样本的荧光强度，在大气条件下，将条孔中的混合物培养30分钟。在培养之后，用微孔板读板仪(tecan有限公司的infinitem1000)测量条孔中发出的荧光的强度。最后，将用于量化凝血因子的odi-cl检测的敏感度与荧光检测的敏感度相比较。

实验4：使用具有odi-cl检测功能的生物传感器来量化在人类血浆中的凝血因子(表3)

用10％的用去离子水稀释的血浆来制备因子iia和xa的标准品。用100％血浆制备未知的样本。然后，将各个样本10倍稀释在去离子水中。将各个标准品或者样本(50μl)分配到含有荧光底物的条孔中。在大气条件下，将条孔中的混合物培养2分钟。在pbs中制备因子iia的荧光底物(5μg/ml)。同样，在pbs中制备因子xa的荧光底物(5μg/ml)。在培养之后，使用光度计测量在添加了odicl试剂之后各个混合物发出的光2秒钟。

实验5：使用具有odi-cl检测功能的生物传感器来量化在人类全血中的凝血因子(表5)

用10％的用去离子水稀释的全血来制备因子iia和xa的标准品。将未知的全血样本10倍稀释在去离子水中。将各个标准品或者样本(50μl)分配到含有荧光底物的条孔中。在大气条件下，将条孔中的混合物培养4分钟。在tbst中制备因子iia的荧光底物(25μg/ml)。同样，在pbs中制备因子xa的荧光底物(25μg/ml)。在4分钟的培养之后，使用光度计测量在添加了odicl试剂之后各个混合物发出的光2秒钟。

实验6：在用于量化在经过10倍稀释的血浆和全血中的iia和xa的具有odi-cl检测功能的生物传感器与具有荧光检测功能的传统方法之间的相关性

为了确定在具有odi-cl检测功能的生物传感器与具有荧光检测功能的传统方法之间的相关性，用具有荧光检测功能的微孔板读板仪(tecan有限公司的infinitem1000)来确定在经过10倍稀释的血浆或者全血(例如，标准品、样本)中的iia和xa的浓度。在使用传统方法量化iia和xa的荧光底物的浓度与使用实验4和5中描述的具有odi-cl检测功能的生物传感器的浓度相同。在黑孔中将各个标准品或者样本(50μl)与荧光底物(50μl)混合。将含有各种混合物的黑孔板(96孔，greinerbio-one)插入具有荧光检测功能的微孔板读板仪中并且在室温下培养30分钟。在培养之后，在440nm发射波长(激发波长：342nm)下，测量从各个孔发出的荧光的相对强度。在使用传统方法确定在血浆和全血中的样本的浓度之后，将这些浓度与用具有odi-cl检测功能的生物传感器得到的浓度相比较，以确定新方法与传统方法之间的相关性。

实验数据的分析

使用微软excel和sigmaplot12.5(systat软件有限公司)的统计工具来分析在本说明书中观察到的所有实验结果。

应该理解，上述生物传感器和方法仅仅是对本公开的原理的实施例的图示，并且，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以想到其它组成和方法来使用它们。还要理解，本公开涉及包括所公开的部分以及由所公开的部分组成的实施例。