用于在高通量筛选中以高时间分辨率进行测量的方法和系统与流程

本发明涉及一种用于在高通量筛选中以高时间分辨率进行测量的方法和系统。

背景技术：

新药的鉴定和开发旨在鉴定调节生物化学过程的化合物，所述生物化学过程例如是配体结合、大分子构象变化或酶促反应。高通量筛选（high-throughputscreening，hts）通常用于测试大量化学结构，因为小型化确保了快速、成本有利和有效的测试。

基于荧光的测试由于其高灵敏度和可自动化性而可能是用于hts的最重要方法。除了通过酶促反应追踪荧光的变化之外，还使用标记技术来通过荧光共振能量转移（fret）、生物发光共振能量转移（bret）或荧光偏振（fp）来确定蛋白质-蛋白质相互作用或配体结合。

许多生物过程、尤其是小配体的结合的特征在于非常快速的动力学，所述非常快速的动力学需要快速混合方法。

然而，采用具有384或1536个测试凹部的板格式的仪器通常在时间分辨率方面受到限制，由此快速结合动力学的确定被限制为具有低通量的方法。甚至配备有多分发器的仪器的筛选方法（参见gonzález,j.e.和maher,m.p.(2002)cellularfluorescentindicatorsandvoltage/ionprobereader(viprtm):toolsforionchannelandreceptordrugdiscovery,receptorsandchannels8,283-295；mori,t.、itami,s.、yanagi,t.、tatara,y.、takamiya,m.和uchida,t.(2009)useofareal-timefluorescencemonitoringsystemforhigh-throughputscreeningforprolylisomeraseinhibitors,journalofbiomolecularscreening14,419-424；schroeder,k.s.和neagle,b.d.(1996)flipr:anewinstrumentforaccurate,highthroughputopticalscreening,journalofbiomolecularscreening1,75-80）主要被限制为秒时间范围，其中这些仪器的筛选方法明显改善了时间分辨率。

由现有技术公开的快速混合方法是连续流动设备或停流设备。

在连续流动实验中，作为混合器下游距离的函数来检查在平衡流动条件下的反应。混合器设计的改进导致了死区时间缩短到100μs或甚至更短的范围（regenfuss,p.、clegg,r.m.、fulwyler,m.j.、barrantes,f.j.和jovin,t.m.(1985)mixingliquidsinmicroseconds,rev.sci.instrum.56,293-290；shastry,m.c.r.、luck,s.d.和roder,h.(1998)acontinuous-flowcapillarymixingmethodtomonitorreactionsonthemicrosecondtimescale,biophysicaljournal74,2714-2721；roder,h.、maki,k.、cheng,h.和ramachandrashastry,m.c.(2004)rapidmixingmethodsforexploringthekineticsofproteinfolding,methods34,15-27）。然而，为了实现有效的混合，需要高流速和相对大的通道尺寸，这消耗了大量的材料。

在可商购的停流仪器情况下，借助于气动触发器经由两个注射器来输送反应物。在填充了观察室之后，当停止注射器碰到停止块时，流突然停止。仪器可以按照常规达到少数几毫秒的死区时间（dickson,p.n.和margerum,d.w.(1986)extensionofaccessiblefirst-orderrateconstantsandaccuratedead-timedeterminationsforstopped-flowspectroscopy,analyticalchemistry58,3153-3158；nakatani,h.和hiromi,k.(1980)analysisofsignalamplitudeinstopped-flowmethodforenzyme-ligandsystems,journalofbiochemistry87,1805-1810；peterman,b.f.(1979)measurementofthedeadtimeofafluorescencestopped-flowinstrument,analyticalbiochemistry93,442-444）。

连续流动设备和停流设备都是具有低通量的方法，该低通量限于一个比色皿或一个通道。然而，需要用于测试多种抑制剂和浓度的快速混合方法，因为快速结合反应或酶动力学的确定在新药的鉴定和开发中起着重要作用。为了能够观察微量滴定板中的快速动力学，已经开发了一种基于成像仪器来检测快速动力学的新方法，该方法将高时间分辨率与高度并行化系统的通量相组合。这首次使得能够将快速动力学有效应用于鉴定和开发新药。

de102004016361a1和wo03/100398a1公开了一种用于微量滴定板上的荧光测量的光学分析测量设备。微量滴定板具有透明底部。激发和评估光路指向微量滴定板的透明底部。在微量滴定板上方具有用于在不间断地同时测量微量滴定板样本的发射期间添加液体的定量给料或移液装置。

来自de102004016361a1和wo03/100398a1的发明基本思想基于以下考虑：为了在微量滴定板上存在大量单个样本情况下实现高样本通量，单个样本的激发以及发射的记录和必要时的液体添加应当同时进行，并且可以尽可能地借助于图像记录器（例如密集的相机）在较长的时间段内永久检测微量滴定板的所有样本的发射（荧光或发光）。

对于细胞生物学的测试—在这种测试中通常必须在添加药理学活性物质之后测量荧光反应的动力学，分析测量设备通过同时测量所有阱来满足应当在添加物质之前、期间和之后测量样本的发射的要求。如果从下面进行微量滴定板发射的荧光激发和检测，则可以任意地、也同时在多个阱中无接触地从上面添加物质和/或其他液体，或者在定义的时间并且以不同的量或浓度无接触地添加不同物质和/或其他液体，并且连续地观察。特别是对于hts方案，借助于ccd相机通过这种并行测量可以获得所谓的多路复用优点，因此尽管每个阱的测量时间显著增加，仍可以实现高样本通量。

尽管使用来自de102004016361a1和wo03/100398a1的光学分析测量设备可以实现高样本通量，但是它不是被设计用于时间分辨率小于1秒的强度测量，而所述强度测量是阐明诸如小配体结合的确定的生物过程情况下的快速动力学所需要的。

技术实现要素：

所说明的问题的解决方案在于用于在高通量筛选中以高时间分辨率进行快速动力学测量的方法，包含以下步骤：

a.提供

i.具有透明底部的微量滴定板，所述底部具有大量测试凹部，

ii.定量给料系统，具有布置在微量滴定板上方的用于将液体同时添加到多个测试凹部中的定量给料设备；

iii.微量滴定板下方的照射系统，其适用于通过透明地板同时照射多个测试凹部；和

iv.检测系统，其适用于通过透明底部同时检测来自多个或所有测试凹部的电磁辐射；

b.当压力在0.5巴至2巴范围内时，在5-200ms内从定量给料设备向多个测试凹部同时添加每测试凹部0.3-300μl液体；

c.在开始添加的时刻之前或之时，随着照射开始利用照射系统通过透明地板同时照射多个测试凹部；

d.以各个测量点之间的时间间隔1-1000ms同时检测来自多个或所有测试凹部的电磁辐射。

本发明的主题还有一种用于在高通量筛选中以高时间分辨率进行快速动力学测量的系统，该系统包含：

-具有透明底部的微量滴定板，所述底部具有大量测试凹部，

-定量给料系统，具有布置在微量滴定板上方的用于在多个测试凹部中同时添加液体的定量给料设备；

-微量滴定板下方的照射系统，其适用于通过透明地板同时照射多个测试凹部；和

-检测系统，其适用于通过透明底部同时检测来自多个或所有测试凹部的电磁辐射。

微量滴定板优选具有384或1536个测试凹部。

定量给料设备

定量给料设备具有壳体，所述壳体具有至少一个压力室、用于将液体输送到压力室中的进料口以及在压力室与壳体外侧之间的大量通道，其中在每个通道中具有管，该管用其第一端伸入到压力室中并且用其第二端在外侧处从壳体伸出。

压力室优选地在一个空间维度中具有比在其他两个空间维度中更大的扩展。压力室的纵向轴线在更大扩展的方向上延伸。压力室的纵向轴线同时平行于壳体的外侧。在优选的实施方式中，压力室是圆柱形或长方六面体形。通道位于压力室的壁之一中，这些壁平行于压力室的纵向轴线延伸。优选地，通道彼此平行布置。存在至少两个通道。通道可以布置成平行于压力室的纵向轴线的一行或多行。在此，每行优选有12个，特别优选地24或48个通道。理想地，每行的通道数量与微量滴定板的一行（长边）中的凹部的数量匹配，通过定量给料设备在所述凹部中定量给料。

管优选是由金属或塑料制成的毛细管，毛细管，即细管，在使用液体的情况下毛细管作用发生在这些细管中。毛细管的内径应在0.1mm至0.8mm的范围内，优选0.2mm至0.6mm的范围。外径可以在0.35mm至2mm的范围内，优选0.6mm至1.1mm的范围。管的长度在6mm至15mm的范围内，优选为8.5mm至13mm的范围，特别优选为10mm至13mm的范围。

这些管垂直（90°）或倾斜地布置为与壳体外侧成40°至<90°范围内的角度，这取决于是垂直地从上方将液体施加到微量滴定板的凹部中，还是以一角度施加或注入到凹部的侧壁上。

为了增大位于壳体外侧上的管的疏水性，管可以被包裹，优选地用塑料包裹，例如聚四氟乙烯。

毛细管用一端伸入到压力室中并用另一端伸出壳体。

在一种实施方式中，液体的进料口位于垂直于定量给料室的纵向轴线布置的壁之一中。壳体还可以具有通风口，当用液体填充定量给料室时，空气从该通风口被挤出。该通风口可以位于垂直于定量给料室的纵向轴线布置的壁之一中。

压力室的横截面积可以在60mm²至300mm²的范围内，或者直径在4mm至10mm的范围内，优选地在5.5mm至6.5mm的范围内。

定量给料设备的壳体也可以具有多于一个压力室，例如两个、三个或四个压力室，这些压力室的纵向轴线彼此平行地延伸。每个压力室具有单独的进料口，用于将液体输送到压力室中，并且每个压力室在压力室与壳体外侧之间具有大量通道，所述通道具有对应的通道和管。优选地，各个压力室的通道和管彼此平行布置。根据需要，具有一个或多个压力室的多个壳体也可以并排并且彼此平行地布置。

由于压力室的大体积与伸入到压力室中的短管相组合，不会产生压力梯度，因此可以非常快速且按数量准确地施加液体。在例如384或1536微量滴定板的μl范围内的并行、精确和快速定量给料成为可能。

除了定量给料设备之外，定量给料系统还具有液体贮存器，该液体贮存器经由管线连接到定量给料设备的进料口。液体贮存器上的压力导致液体从液体贮存器泵送到压力室中。为此，液体贮存器气密地由周围大气封闭并连接到泵，该泵建立必要的压力。在多个压力室的情况下，每个压力室的进料口可以连接到同一个液体贮存器或不同的液体贮存器。

通过液体贮存器和进料口之间的阀门的开关时间以及泵的压力相组合，可以控制在每个开关循环（通道打开/关闭）中进入压力室并且经由各个管输出的液体的量。

在本发明的一个实施方式中，来自液体贮存器的液体在阀门处的压力处于0.5至2巴的范围内、优选0.5至0.85巴的范围内，并且阀门具有在5ms至200ms范围内的开关时间（对于具有1536个凹部的微量滴定板是5-60ms，对于具有384个凹部的微量滴定板是40-200ms），优选在5ms至50ms的范围内。

阀门的开关时间和由泵施加的压力被调整为使得定量给料设备的输出体积处于每毛细管0.3至300μl的范围中，优选在1和30μl之间。

照射

照射系统包括至少一对led光模块，led光模块布置在微量滴定板下方的彼此相对的侧上，并以20至80度的角度照射微量滴定板的透明底部。

根据本发明的led发光模块的特征在于，在触发信号开始后的小于10μsec内达到最大发射，并且在触发信号结束后的≤20µsec内脉冲再次衰减。由此可以进行快速动力学测量。同时，通过该光学布置可以实现对微量滴定板的均匀照射。

led光模块包括布置成一行或多行的led光源，并且可选地包括杆状、平凸的柱面透镜，所述柱面透镜以平坦侧布置在led光源处，使得led光源的辐射在平面侧上进入柱面透镜和在凸面侧处离开柱面透镜。

led光源的数量可以处于12至36的范围内。

优选地，led光源布置在led板上，并且led板导热地连接到冷却体。

消光滤光器可以位于led光源和柱面透镜之间，并且保护玻璃或偏振滤光器可以位于消光滤光器和柱面透镜之间。

在优选的实施方式中，led光源是可见（vis）或uv波长范围内的高功率led光源，优选地在340nm至800nm的波长范围内。

对于确定的应用，也可以使用多于一对的led光模块，或者可以使用多个led光模块。如果不同的led光模块具有不同的波长，则荧光激发可以同时在多个波长中进行。

两对led光模块可以各自布置在微量滴定板下方的彼此相对的侧上，并以相同或不同的角度照射微量滴定板的透明底部。两对或更多对led光模块可以与微量滴定板分别具有不同距离地布置在微量滴定板的同一侧上，并且分别以不同的照射角度照射微量滴定板的透明底部。

优选地，唯一一对的两个led光模块布置在微量滴定板下方的彼此相对的侧上，并且附加地一个或两个另外的led光模块布置在微量滴定板下方的更中心处，使得来自这些附加led光模块的发射光与微量滴定板的平面成一角度地到达微量滴定板的透明底部，其中该角度比所述一对led光模块的光与微量滴定板的平面之间的角度更大。

具有不同波长的led光模块的应用是光遗传学领域。光遗传学意味着借助于光敏蛋白质通过光控制转基因细胞。波长用于激活这些蛋白质，从而影响细胞过程。为了也能够观察这些过程，使用另外的波长来激发荧光发射以用于相应传感器或染料的荧光测量。

检测

发射光的检测与微量滴定板的底部成直角地进行。

检测系统可以位于微量滴定板下方的中心并直接接收发射光，和/或发射光经由相应的偏转镜或二向色分束器被偏转到检测系统上。

发射光的检测可以在不同波长的情况下同时进行。

该检测系统适用于以各个测量点之间1至1000ms的时间间隔同时检测来自多个或所有测试凹部的电磁辐射。

附图说明

图1是以透视图示出的具有两个定量给料室的两个定量给料设备

图2是以带有内部结构的透视图示出的具有两个定量给料室的定量给料设备

图3是以侧视图示出的定量给料设备

图4是以侧视图示出的定量给料设备的放大部分（阀门侧）

图5是具有液体贮存器的定量给料系统

图6是以透视图示出的led光模块

图7是以分解图示出的led光模块

图8是以横截面示出的led光模块

图9是纵截面示出的led光模块

图10是在不同长度的触发信号情况下的led发射

图11是成像测量仪器（单通道检测）

图12是成像测量仪器（双通道检测）

图13是具有1536个测试凹部的微量滴定板的发射分布

图14a-c示出用成像测量仪器测量ans与bsa结合的动力学。

具体实施方式

图1以透视图示出了根据本发明的两个平行布置的定量给料设备10，每个定量给料设备具有两个压力室。定量给料设备的其他视图示于图2至图4中。每个定量给料设备10具有长方六面体形的壳体2，该壳体具有两个直径为4-10mm且长度为120-140mm的管状孔。这些孔形成两个平行的压力室5。每个孔具有开口端，该开口端形成圆形进料口6。相对端是打开的，用于系统填充和排空，并在定量给料操作时密封地关闭。这里存在出风口或通风口3。壳体2以进料口6所位于的侧面固定在支架7处，使得壳体水平地从支架7伸出。支架7具有用于每个进料口6的凹陷。在伸出的壳体2的下侧上具有在每个压力室5和壳体2的下侧之间的一行多达48个通道，其中在每个通道中具有优选地由不锈钢制成的毛细管4，该毛细管利用其第一端伸入到压力室5中并且利用其第二端在下侧处从壳体2伸出。毛细管具有0.1-0.8mm的内径并且垂直布置。从壳体2的下侧伸出的管分段被疏水地（优选地利用聚四氟乙烯）包裹。

图3以侧视图示出了定量给料设备10。圆形截面a在图4中放大地示出。在图4中可以看出，毛细管4伸入到压力室中直至压力室的一半高度。已经证明这对于均匀的定量给料是特别有利的。

图5示出了根据本发明的定量给料系统。定量给料设备10的压力室5（在壳体2中不可见）经由管线71、阀72和另外的管线70与位于贮备容器中的液体相连。经由隔膜泵66和压力管线68，将室内空气在0.8巴的压力下引入贮备容器。也可以使用另一种气体如n2来代替室内空气。也可以使用另一种压力供应系统来代替隔膜泵。已经证明具有低死区容积和短开关时间的电磁阀是合适的阀门，其例如由parkerhannifin公司，cleveland，oh44124usa销售。

图6-9示出了led光模块610的不同视图。图6以透视图示出了led光模块610。led光模块610具有壳体612，壳体612具有底部615和两个侧壁以及带有冷却空气流入口的前壳体盖613。壳体612的与底部615相对的开口侧由保护玻璃支架617和保护玻璃616封闭。在偏振测量的情况下，保护玻璃616可以由偏振滤光器代替。在保护玻璃616和保护玻璃支架617上方，可以安装杆状、平凸的柱面透镜，该柱面透镜具有朝向保护玻璃616或保护玻璃支架617的平坦侧。与前壳盖613相对地，在壳体的开口的延长侧中具有用于吸入冷却空气的通风设备位置。在通风设备位置614上方具有电连接端618。

在壳体612内部具有冷却体632，在所述冷却体上一方面安装电连接端618，另一方面安装led板630。led板630可以由一行或两个平行行12至36个led631组成，优选地由一行24个led631组成。led631布置成使得它们在操作中在图像中向上辐射。在led631上方具有滤光器支架623中的激发滤光器622。壳体由保护玻璃616和保护玻璃支架617封闭。在壳体底部615处具有保持磁铁636以及rfid应答器634。rfid应答器也可以安装在侧壁中。

对于下面描述的测量，使用具有来自philips公司的luxeonrebel型led631的led光模块610。适用于同一用途的其他led631例如是：

•osram：goldendragonplus，oslonssl80/150，platinumdragon

•cree：xlampxpc，xlampxrc，xlamp7090xre，xlampxpe，

•nichia：ncu133a，ncsu034b，ncsu033b。

依据波长，这些led的发射功率处于100-2000mw。

图10a）至图10d）示出了在不同长度的触发信号660的情况下led发射的时间变化曲线的测量。分别经由连接端618将不同长度的触发信号660施加到板630的led631上。根据触发信号660的长度，实现不同长度的不同强度led发射。x轴666以5μsec（微秒）为单位示出了时间。

在图10a）中示出了在触发信号660的长度为2μsec情况下的led发射。led发射在触发信号660开始之后的5μsec的死区时间之后才开始并且达到最大发射功率的60％。

在图10b）中示出了在触发信号660的长度为5μsec情况下的led发射。led发射662在触发信号660开始之后的5μsec的死区时间之后才开始并且达到最大发射功率的70％。

在图10c）中示出了在触发信号660的长度为8μsec情况下的led发射。led发射在触发信号660开始之后的5μsec的死区时间之后才开始并且达到最大发射功率的100％。

在图10d）中示出了在触发信号660的长度为14μsec情况下的led发射。led发射在触发信号660开始之后的5μsec的死区时间之后才开始并且达到最大发射功率的100％。

触发信号660的开始与模块的led631的最大发射功率之间的时间延迟约为8μsec。触发信号660结束之后的17μsec，led发射被完全衰减。可以通过脉冲宽度调制或电流调节来控制led强度。

在下文中将基于图11和图12描述用于在高通量筛选中以高时间分辨率进行快速动力学测量的系统的操作。

具有反应物的液体的定量给料从位于微量滴定板定位托盘62上的微量滴定板60的上侧进行，该微量滴定板60具有透明底部。定量给料与斜向下的照射以及使用向下的相应相机的探测相组合。通过同时记录来自微量滴定板60的一行48个测试凹部的荧光分布来跟踪反应进程。在此，定量给料和照射系统被设计和控制为，使得利用这种布置可以观察包括定量给料时间和混合时间的动力学过程。

定量给料借助于定量给料系统来进行。定量给料设备10是该定量给料系统的一部分。贮备容器64中的包含待检查反应物的液体65经由阀门72泵送到定量给料设备的定量给料室5（未示出）中（图5）。毛细管4具有~800μm的开口（=内径），由此使得可以在微量滴定板的48个测试凹部中进行并行的定量给料（图5）。为了实现高湍流的混合条件，管4的定量给料出口的取向专门与具有384和1536个测试凹部的微量滴定板匹配。通过将反应物对角地定量给料到微量滴定板壁上，实现了针对具有384个测试凹部的微量滴定板的最佳混合结果。与此不同，具有1536个测试凹部的微量滴定板60所需的更低定量给料体积是垂直定量给料的，如图5所示。阀门的开关时间以及由此待定量给料的体积通过针对要使用的每个压力而存储的校准函数（线性或多项的三阶）定义。精确的微量滴定板支架62确保了定量给料设备10朝着微量滴定板60的凹部的最佳和可再现的取向。

微量滴定板60的均匀底部照射通过一对led光模块610实现，所述led光模块610具有12至36个（uv和vis）高功率led光源631，所述led光源631成行布置并且对角地朝着板取向（图11、图12和图7）。运行的led631输送340至800nm波长范围内的激发光92，并且消光滤光器通过传输选定的波长范围来改善波长选择性。通过快速且高灵敏度的背部照射的emccd（背照式电子多层电荷耦合器件）或iccd（强化电荷耦合器件）相机82以90°的角度探测发射的荧光94。相机82配备有干涉滤光器84，并且可以另外配备有偏振滤光器85。

利用两个相机82和分束镜90的荧光检测使得能够同时检测两个发射信号，所述发射信号例如在用于förster共振能量转移（fret）、生物发光共振能量转移（bret）或荧光偏振（fp）的测量中是必需的。

图11和图12中所示的测量系统可以通过另外的led照射单元扩展，所述另外的led照射单元以改变的照射角度布置在所示的led单元下方。如果这些附加led单元具有与原始led单元不同的波长，则荧光激发可以在多个波长中同时进行。

在图13中示例性地示出具有1536个包含发荧光溶液的凹部的微量滴定板的发射的伪彩色显示。收集针对测试凹部的数据，其方式是采集和可视化每秒和每测试凹部高达1000个点并通过定制的数据处理软件进行处理。

性能测试

常规用于检查快速混合设备的性能的一种方法是观察快速测试反应。对于荧光研究来说，适当地跟踪疏水性染料1-苯胺基-8-萘磺酸（ans）与牛血清白蛋白（bsa）的结合，该结合伴随着荧光产率的大幅增加。针对不同bsa浓度的荧光动力学与指数函数匹配并被外推至共同的初始荧光。该共同点提供了在反应起始时刻(t0)时不存在bsa的情况下ans的荧光。从该点至落在匹配的指数曲线上的第一个数据点的时间间隔提供了对该测量的死区时间的估计。图14a-c示出了各种bsa浓度情况下的经校正的荧光动力学，所述各种bsa浓度是在具有用于快速动力学的根据本发明的定量给料设备的成像测量仪器中测量的。

55ms后，将1.6μl的ans溶液通过9ms的毛细阀门闭合添加到具有1536个测试凹部的包含bsa的微量滴定板（图14a）。毛细阀门闭合通过灰色条表示。ans与bsa的结合导致ans荧光的增加，所述增加在以365nm（带通36nm）激发后以460nm（带通60nm）记录。ans和bsa溶液在100mm磷酸钾（ph7.5）中制备。最终浓度：5μμ的ans和1.9μμ（空心圆）、2.5μμ（实心圆）、3.4μμ（倒三角形）、7.9μμ（正方形）和10.6μμ（三角形）的bsa（图14a）。

结合反应的起始时刻通过双指数匹配和将荧光动力学外推至共同的初始时刻t0来确定。将（来自图14a的）荧光动力学校正至该初始时刻t0（图14b）。实线示出了外推到共同时刻t0的双指数函数。

应该注意的是，反应的t0不等于阀门闭合的时刻，而是被延迟了测试凹部中反应物的进入和混合。仪器的死区时间将通过从t0到匹配的指数曲线上的第一个正确的确定点的时间段实现，并且基于定量给料时间和混合伪影。在微量滴定板的测试凹部中存在3μl液体和将1.6μl的小体积定量给料到该微量滴定板的1536个测试凹部中的情况下，死区时间可以达到约10ms，这近似地对应于几毫秒的商业停流仪器的时间分辨率。

所探测的荧光轨迹（图14b）显示出非常低的噪声水平，这表明动力学数据的高质量。图14c示出了作为bsa浓度的函数的从动力学轨迹中确定的所述结合的表观速率常数的图。可以探测慢结合阶段（实心圆）和快速结合阶段（空心圆）。具有慢动力学的结合阶段对bsa浓度的线性依赖性证实了确定轨迹的准确性和可靠性。将观察到的速率常数（黑色）与通过常规停流装置获得的数据（红色）进行比较。表观速率常数以及第二阶的速率常数显得与通过在停流装置中添加而在单个比色皿中获得的数据一致，其中表观速率常数以及第二阶的速率常数是基于慢结合阶段的浓度依赖性确定的。

附图标记：

10定量给料设备

1阀门

2壳体

3出风口/通风口

4管

5压力室

6进料口

7支架

8护套

60微量滴定板

62板保持器

64贮备容器

65液体

66泵

68压力管线

70管线

71管线

72阀门

82相机

84发射滤光器

85偏振滤光器

90分束器

92激发光

94荧光

610led光模块

612壳体

613具有冷却空气流入口的前壳体盖

614用于吸入冷却空气的通风设备位置

615壳体底部

616保护玻璃或偏振滤光器

617保护玻璃支架

618电连接端

620柱面透镜

622激发滤光器

623滤光器支架

630led板

631led

632冷却体

634rfid应答器

636保持磁体

660触发信号

662在图10b）中的led发射的电压变化曲线

664图10d）中的led发射的的电压变化曲线

666图10中的时间轴

a图8的截面轴

b图9的截面轴