本发明涉及恩拉霉素的检测领域，具体涉及一种动物组织中残留的恩拉霉素的检测方法。
背景技术：
：恩拉霉素(enramycin)是由放线菌(streptomycesfungicidicus)发酵而得的多肽类抗生素，主要组分有恩拉霉素a和b，是其盐酸盐形式应用。白色或微黄白色粉末(粗品呈灰色或灰褐色的粉末，有特臭)。恩拉霉素是由包括13个不同种类的17个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的成的有机碱。其中氨基酸分子构成环状多肽结构，据其末端脂肪酸种类不同。可分为恩拉霉素a(c107h138cl2n26o31)和恩拉霉素b(c108h140cl2n26o31)则是由这两种成分组成的混合物。恩拉霉素的盐酸盐为白色结晶性粉末，分子量约为2500，融点为238～245℃，易溶于二甲亚砜、稀盐酸，可溶于甲醇、含水乙醇，难溶于丙酮，不溶于苯、氯仿。恩拉霉素的盐酸盐对热、光照和潮湿有极好的稳定性。恩拉霉素在饲料中具有很高的稳定性，在室温条件下长期储藏很少降解，在制成颗粒料过程中也非常稳定，与饲料混合后在室温下长期储藏效价下降甚微。恩拉霉素在肠道内不被降解，能够保持原有的抗菌活性，其结构式如下：恩拉霉素在需氧和厌氧条件下对主要的革兰氏阳性菌都具有强大的杀菌作用。恩拉霉素不但具有溶菌作用，而且还具有杀菌作用。恩拉霉素具有广泛的抗革兰氏阳性菌和优良的促生长及改善饲料利用率的作用，仔猪开口料中添加恩拉霉素，不仅能促进生长和改善饲料报酬。而且能减少仔猪下痢的发生。恩拉霉素拌料对肉鸡和后备鸡均能起到促生长和改善饲料报酬的作用，恩拉霉素主要作用于肠道菌群，可改善排水便的不良状况。恩拉霉素可增强抗球虫药的抗球虫活性或降低球虫病的发生。为了保证动物性食品及公共卫生安全，需要对动物性食品中的恩拉霉素残留进行检测和监督，我国尚未制定恩拉霉素在动物性食品中的最高残留限量。欧盟、美国以及国际食品法典委员会(cac)也未有恩拉霉素最高残留限量的报道。我国兽药典规定恩拉霉素预混剂用量每吨饲料为：猪2.5～20克，鸡1～5克。猪、鸡的休药期为7天。恩拉霉素属于多肽类抗生素检测的难点，我国尚未建立动物组织中恩拉霉素残留检测方法。国际上的相关报道也不多，只建立了肉的检测方法，其它组织检测方法空白。因此，建立动物性食品中恩拉霉素残留检测方法具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测动物组织中残留的恩拉霉素的方法，其主要改进点为，采用hplc-ms/ms法进行检测前，对样品进行如下预处理：1)样品提取：将动物组织样品进行均质、匀浆处理后用提取液对其进行提取，提取完毕后吹氮去除溶液中的有机物，然后再将剩余溶液与盐酸溶液充分混合，离心后取上清液；2)样品净化：用env固相萃取柱对所述上清液进行净化，得待检测样品；所述提取液的配制方法为：a、将甲醇和盐酸混合，制得盐酸的体积分数为1.8％的盐酸甲醇混合液；b、将上述1.8％的盐酸甲醇混合液与水混合，制备得到盐酸甲醇混合液的体积分数为54～56％的溶液。本发明的方法根据恩拉霉素的结构特性，优选出一定比例的酸化甲醇水作为提取溶剂，通过env固相萃取小柱净化，有效减少了基质干扰。该方法具有操作简单、检测限低、重现性好，且测定费用低的特点，适用于动物性食品中恩拉霉素残留的定量分析。而且本发明检测方法适用范围广，检测对象可以为各种动物的组织，如肌肉、肝脏、肾脏、脂肪等。优选的，所述步骤2)的具体操作为，将步骤1)所得的上清液通过所述env固相萃取柱，然后先用甲醇和5％的氨水溶液的混合液对env固相萃取柱淋洗一次，再用甲酸和乙酸乙酯的混合液对其淋洗一次，最后再用甲醇和0.1m盐酸的混合液对其进行洗脱，所得洗脱液过有机滤膜，即得待检测样品；优选的，所述甲醇与5％的氨水溶液的体积比为20:80，所述甲酸与乙酸乙酯的体积比为1:99，所述甲醇与0.1m盐酸的体积比为80:20。优选的，所述步骤1)中提取的具体操作为，将样品与提取液按质量体积比1:4.5～5.5混合，充分震荡混匀，离心后取上清液，重复上述操作3次，合并上清液；将吹氮去除有机物后的溶液与0.1m的盐酸溶液按体积比5:0.8～1.2混合，充分震荡混匀，再进行超声处理，最后离心取上清液。优选的，所述液相色谱检测的条件为：采用c18色谱柱，柱温28～32℃，选择体积分数为0.2％的甲酸的水溶液和甲醇作为洗脱液进行梯度洗脱。优选的，所述梯度洗脱的具体操作为：0～1.5min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比由90：10调整到50:50；1.5～3.3min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比为由50：50调整到30:70，3.3～3.5min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比由30:70调整到5：95；3.5～6min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比维持在5：95，6～6.1min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比为由5:95调整至90:10，6.1～9min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比为维持在90:10。(详见实施例中的表1)优选的，所述质谱检测的的过程中，恩拉霉素a的定性离子对为786.1＞1089.6、786.1＞178.9和786.1＞95.3，与之对应的碰撞能量分别为25ev、25ev和30ev，定量离子对为786.1＞1089.6，与之对应的碰撞能量为25ev；恩拉霉素b的定性离子对为790.9＞1089、790.9＞193.2和790.9＞95，与之对应的碰撞能量为25ev、25ev和30ev，定量离子对为790.9＞1089，与之对应的碰撞能量为25ev。优选的，所述质谱检测的条件为：选择电喷雾离子源，干燥气温度为300℃，干燥气流量为7l/min，雾化气压力为35psi，鞘气温度为300℃；鞘气流量为11l/min；毛细管电压为3500v；喷嘴电压为1500v；电晕电流为0.16ua。作为优选的方案，本发明的方法包括如下步骤：1)样品的前处理对动物组织样品进行均质、匀浆处理后，与提取液按质量体积比1:4.5～5.5混合，充分震荡混匀，离心后取上清液，重复上述操作3次，合并上清液；将吹氮去除有机物后的溶液与0.1m的盐酸溶液按体积比5:0.8～1.2混合，充分震荡混匀，再进行超声处理，最后离心取上清液；所述提取液由如下方法配制得到：a、将甲醇和盐酸混合，制得盐酸的体积分数为1.8％的盐酸甲醇混合液；b、将上述1.8％的盐酸甲醇混合液与水混合，制备得到盐酸甲醇混合液的体积分数为556％的溶液，即为所述提取液；2)上清液的净化将步骤1)所得的上清液通过env固相萃取柱，然后先用甲醇和5％的氨水溶液的混合液对env固相萃取柱淋洗一次，然后再用甲酸和乙酸乙酯的混合液对其淋洗一次，最后再用甲醇和0.1m盐酸的混合液对其进行洗脱，所得洗脱液过有机滤膜，即得待检测样品；所述甲醇与5％的氨水溶液的体积比为20:80，所述甲酸与乙酸乙酯的体积比为1:99，所述甲醇与0.1m盐酸的体积比为80:20；3)液相色谱检测将步骤2)制得的待检测样品进行液相色谱检测，检测的条件为：采用c18色谱柱，控制柱温30℃，选择体积分数为0.2％的甲酸的水溶液和甲醇作为洗脱液进行梯度洗脱；所述梯度洗脱的具体操作为：0～1.5min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比由90：10调整到50:50；1.5～3.3min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比为由50：50调整到30:70，3.3～3.5min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比由30:70调整到5：95；3.5～6min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比维持在5：95，6～6.1min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比为由5:95调整至90:10，6.1～9min，0.2％的甲酸的水溶液与甲醇的体积比为维持在90:10；4)质谱检测将上述液相色谱检测后的样品通过二级质谱进行检测，质谱检测的条件为：选择电喷雾离子源，干燥气温度为300℃，干燥气流量为7l/min，雾化气压力为35psi，鞘气温度为300℃；鞘气流量为11l/min；毛细管电压为3500v；喷嘴电压为1500v；电晕电流为0.16ua；所述质谱检测的的过程中，恩拉霉素a的定性离子对为786.1＞1089.6、786.1＞178.9和786.1＞95.3，与之对应的碰撞能量分别为25ev、25ev和30ev，定量离子对为786.1＞1089.6，与之对应的碰撞能量为25ev；恩拉霉素b的定性离子对为790.9＞1089、790.9＞193.2和790.9＞95，与之对应的碰撞能量为25ev、25ev和30ev，定量离子对为790.9＞1089，与之对应的碰撞能量为25ev。本发明的方法具有如下有益效果：1)本发明的方法根据恩拉霉素的结构特性，优选出一定比例的酸化甲醇水作为提取溶剂，通过env固相萃取小柱净化，有效减少了基质干扰，可有效地对恩拉霉素进行提取。2)本发明进一步优化了液相色谱检测的方法和质谱检测的方法，可准确地对动物组织中的恩拉霉素进行检测，该方法具有操作简单、检测限低、重现性好，且测定费用低的特点，适用于检测动物性食品中恩拉霉素残留的定量分析。3)本发明的方法适用范围广，可应用于任何种类的动物组织。附图说明图1为恩拉霉素a不同比例甲醇回收率；图2为恩拉霉素b不同比例甲醇回收率；图3为恩拉霉素a洗脱不同比例的0.1mhcl回收率；图4为恩拉霉素b洗脱不同比例的0.1mhcl回收率；图5空白肌肉恩拉霉素amrm色谱图；图6空白肌肉恩拉霉素bmrm色谱图；图7空白肌肉添加恩拉霉素a(50μg/kg)mrm色谱图；图8空白肌肉添加恩拉霉素b(50μg/kg)mrm色谱图；图9空白脂肪恩拉霉素amrm色谱图；图10空白脂肪恩拉霉素bmrm色谱图；图11空白脂肪添加恩拉霉素a(50μg/kg)mrm色谱图；图12空白脂肪添加恩拉霉素b(50μg/kg)mrm色谱图；图13空白肝脏恩拉霉素amrm色谱图；图14空白肝脏恩拉霉素bmrm色谱图；图15空白肝脏添加恩拉霉素a(50μg/kg)mrm色谱图；图16空白肝脏添加恩拉霉素b(50μg/kg)mrm色谱图；图17空白肾脏恩拉霉素amrm色谱图；图18空白肾脏恩拉霉素bmrm色谱图；图19空白肾脏添加恩拉霉素a(50μg/kg)mrm色谱图；图20空白肾脏添加恩拉霉素b(50μg/kg)mrm色谱图；图21恩拉霉素a标准溶液mrm色谱图(25μg/kg)；图22恩拉霉素b标准溶液mrm色谱图(25μg/kg)；图23a猪肌肉组织的基质添加恩拉霉素a的标准曲线；图23b猪肾的基质添加恩拉霉素a的标准曲线；图23c猪肝的基质添加恩拉霉素a的标准曲线；图23d猪脂肪的基质添加恩拉霉素a的标准曲线；图24a猪肌肉组织的基质添加恩拉霉素b的标准曲线；图24b猪肾的基质添加恩拉霉素b的标准曲线；图24c猪肝的基质添加恩拉霉素b的标准曲线；图24d猪脂肪的基质添加恩拉霉素b的标准曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1本实施例涉及对猪的肌肉组织中恩拉霉素的检测，：1.1实验中所使用的仪器和试剂：超高效液相色谱-串联质谱仪：6470，美国agilent公司；高速冷冻离心机：sigmr3k15，北京五洲东方科技发展有限公司；涡旋混合仪：vx-iii，北京踏锦科技有限公司；超声波清洗器：hs3120，天津恒奥科技发展有限公司；氮吹仪：dc-12，上海安谱科学仪器有限公司；固相萃取柱：env(200mg/3ml)，美国agilent公司；恩拉霉素a标准品：含量≥95％，bocsciences公司；恩拉霉素b标准品：含量≥85％，bocsciences公司；甲醇、乙酸乙酯、甲酸色谱纯；盐酸、氨水，分析纯。水，符合gb/t6682规定的二级水。1.2主要试液的配制恩拉霉素标准储备液(1mg/ml)：准确称取恩拉霉素标准品5.0mg，置于5ml容量瓶内，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀即得。-20℃冰箱中保存。恩拉霉素标准工作液的配制：准确吸取恩拉霉素储备液1ml于10ml容量瓶中，用甲醇：0.1m盐酸(8:2)溶解并稀释至刻度，稀释成浓度为100μg/ml的工作液，再依次稀释浓度为0.05、0.1、0.5、1、2μg/ml的标准工作液，-20℃贮藏，有效期6个月。1.8％盐酸甲醇溶液：移取491ml甲醇和9ml盐酸于500ml的试剂瓶中，超声混匀备用。55％(1.8％盐酸)甲醇水溶液：取1.8％盐酸甲醇220ml和180ml水于500ml的试剂瓶中，超声混匀备用。0.1m盐酸：移取1ml盐酸于120ml的容量瓶中加水定容至刻度，超声混匀备用。1％甲酸乙酸乙酯：移取495ml乙酸乙酯和5ml甲酸于500ml的试剂瓶中，超声混匀备用。甲醇-0.1m盐酸(80:20)：将甲醇和0.1m盐酸按8:2比例，超声混合即可。5％氨水溶液：移取5ml氨水和95ml水于100ml的试剂瓶中，超声混匀备用。甲醇-5％氨水溶液(20:80)：移取80ml5％氨水溶液和20ml的甲醇于100ml试剂瓶中，超声混匀备用。1.3样品前处理1.3.1试料制备取出冷冻试料30～50g，解冻、切碎、高速均质，匀浆备用。1.3.2样品提取准确称取(2.0±0.05)g均质组织样品于50ml离心管中，加入10ml55％(1.8％盐酸)甲醇水溶液涡旋混匀，涡旋震荡10min，1000r/min。低温离心10000r/min,离心10min，将上清液转移至50ml离心管中，残渣再加入10ml55％(1.8％盐酸)甲醇水溶液重复两次提取。合并三次提取液，氮吹吹至12.5ml；再加入2.5ml0.1m盐酸涡旋混匀，超声5min，低温离心10000r/min,离心10min,取上清待上柱净化。1.3.3样品净化依次用5ml甲醇、5ml水活化env(200mg，3ml)固相萃取柱，将全部备用液过柱，待样品液全部流出之后，用6ml甲醇-5％氨水溶液(20:80)溶液淋洗，抽干1min。再用6ml1％甲酸乙酸乙酯淋洗一次，抽干2min。最后使用8ml甲醇-0.1m盐酸(80:20)洗脱，抽干1min，涡旋混匀过微孔有机滤膜，待测。1.4样品测定1.4.1仪器条件1.4.1.1色谱工作条件色谱柱：agilentec-c18色谱柱(dim：2.1×100mm，粒径：2.7μm)；流动相：0.2％甲酸水和甲醇梯度洗脱，梯度见表1；柱温：30℃；进样体积：10μl。表1梯度洗脱条件1.4.1.2质谱条件离子源：电喷雾离子源ajsesi(+)；干燥气温度(gastemp)：300℃；干燥气流量(gasflow)：7l/min；雾化气压力(nebulier)：35psi；鞘气温度(sheathgastemp)：300℃；鞘气流量(sheathgasflow)：11l/min；毛细管电压(capillary)：3500v；喷嘴电压(nozzlevoltage)：1500v；电晕电流(coronacurrent)：0.16ua。定性定量离子对及锥孔电压、碰撞能量见表2表2定性定量检测离子对1.5测定法单点校准：或基质匹配标准曲线校准：由as＝acs+b，求得a和b，则按下式计算恩拉霉素的残留量：式中：x——供试试料中恩拉霉素的残留量(μg/kg)；cs——基质匹配溶液中相应恩拉霉素药物浓度(ng/ml)；c——供试试料溶液中相应恩拉霉素药物浓度(ng/ml)；as——基质匹配溶液中相应恩拉霉素药物峰面积；a——供试试料溶液中相应恩拉霉素药物峰面积；v——残余物定容体积(ml)；m——供试试料质量(g)。注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。经检测，喂药5天以后，猪肌肉恩拉霉素a残留量为0，恩拉霉素b的残留量为17.34μg/kg。实施例2与实施例1相比，其区别在于，所检测的样品为猪肝脏。经检测，喂药5天后，猪肝脏中恩拉霉素a和恩拉霉素b的残留量为0。实施例3与实施例1相比，其区别在于，所检测的样品为猪肾。经检测，喂药5天以后，猪肾脏中恩拉霉素a残留量为19.12μg/kg，恩拉霉素b的残留量为14.92μg/kg。实施例4与实施例1相比，其区别在于，所检测的样品为猪脂肪。经检测，猪脂肪中没有恩拉霉素a和恩拉霉素b的残留。对比例1本对比例比较了不同的提取液对提取效果的影响，所选择的提取液分别为：a、2％甲酸(fa)的甲醇溶液，其中甲酸的体积为2％；b、乙腈；c、2％三氯乙酸-edta磷酸盐缓冲液溶液：甲醇(40:60，v/v)，d、edta磷酸盐缓冲液溶液：甲醇(40:60，v/v)，e、1％三氟乙酸(tfa)的甲醇溶液：1％三氟乙酸(tfa)的水溶液(5：3，v/v))，f、0.1mhcl溶液：甲醇(20：80，v/v)，g、1％hcl甲醇采用与实施例1中相同的方法提取恩拉霉素。实验发现：(1)相同的操作步骤下，提取溶剂a、f、g能得到较好的恩拉霉素添加回收率；(2)酸化有机溶剂有较强的蛋白沉淀能力，其提取液中含有很多内源性干扰物，尤其是对肝脏和肾脏试样的处理；(3)由于恩拉霉素易溶于稀盐酸，虽然f、g的回收率较好，但还是达不到理想回收率。进一步的，采用不同比例的甲醇含有1％hcl来进行提取样品，比例分别为：50％甲醇(2％hcl)水、55％甲醇(1.8％hcl)水、60％甲醇(1.6％hcl)水、70％甲醇(1.4％hcl)水，重复三天比较回收率，结果见图1和图2。(上述溶液的配制方法与说明书中提及的提取液的配制方法相同)由图可得出重复三天的结果55％甲醇(1.8％hcl)水的回收率比较稳定，故选用55％甲醇(1.8％hcl)水为提取液。对样品进行一次提取，二次提取，三次提取，来提高回收率。相比较三次的提取效果会比一次，两次提取好；定为三次提取。对比例2本对比例涉及不同的固相萃取柱效果比对。比较了c18、hlb和wcx，pcx和mcx柱的净化能力。不同的净化步骤操作(表3)。表3不同萃取柱的净化条件试验发现c18、hlb和wcx，pcx和mcx的柱回收率都不好，相比较c18的回收率比较好；但还是没有达到60％以上。根据分析，恩拉霉素的分子量比较大，以上实验比较的柱子内径都比较小，恩拉霉素没有保留在e柱上。故而选用大孔径填料的柱子env(200mg/3ml)。对比例3本对比例比较固相萃取的过程中不同的淋洗液和洗脱液的效果。用不同比例的5％氨水与甲醇的混合液作为淋洗液，分别用6ml5％的氨水的体积比为50％、60％、70％、80％的甲醇混合液淋洗env小柱，检测发现氨水的体积比为70％、80％的甲醇溶液中没有目标物，为避免过多的有机相，选择氨水的体积分数为80％的甲醇溶液为淋洗液1。根据恩拉霉素的溶解性，选择甲醇与0.1m的盐酸的混合液作为洗脱液，比较不同比例的0.1mhcl与甲醇的比例，分别用9ml0.1mhcl：甲醇(70:30v/v)、0.1mhcl：甲醇(50:50v/v)、0.1mhcl：甲醇(40:60v/v)、0.1mhcl：甲醇(30:70v/v)、0.1mhcl：甲醇(20:80v/v)洗脱液，上机测试0.1mhcl：甲醇(20:80v/v)的回收率较好可以达到80％以上(如图3、4)。选0.1mhcl：甲醇溶液(20:80v/v)为洗脱液。对比例4本对比例比较了不同的流动相对液相色谱分析结果的影响。分别选择乙腈，甲醇和甲酸溶液作为流动相，考察了上述流动相对恩拉霉素出峰的影响，结果表明：甲醇作为流动相优于乙腈；若流动相中含有0.2％甲酸的水溶液能显著地增强恩拉霉素及其内标的离子响应程度；故选择甲醇：0.2％甲酸水作为流动相。实验例1、专属性测试准确称取空白样品与空白加标样品2g±0.02g，按照实施例1中样品处理方法操作，经uplc-ms/ms分析，结果见图5～图22(图中的横坐标为采集时间)。通过和标准溶液色谱图比较可知，试料中不含有待测组分，试料中其他成分不干扰恩拉霉素a和恩拉霉素b的测定，方法专属性良好。2、方法线性试验空白猪的肌肉、肝脏、肾脏和脂肪基质，采用实施例1的样品前处理方法提取和净化，制得空白基质，分别精密量取恩拉霉素标准液工作液100μl，加入至900μl基质中，制得2、10、12.5、25、50、100μg/l系列基质添加浓度，按实施例1的检测条件进行液相色谱-串联质谱测定，每个浓度重复测定3次。将测得的峰面积与相对应的浓度绘制标准曲线，拟合，求回归方程和相关系数。结果表明，在2～100.0μg/l浓度范围内，线性关系良好，相关系数均在0.999以上，具体数据见表4，5和图23-24。表4恩拉霉素a在猪可食性组织中的基质匹配标准曲线组织回归方程线性范围(μg/l)相关系数猪肉y＝706.83x-700.682～1000.9997猪肾y＝829.52x-746.962～1000.9990猪肝y＝614.26-347.362～1000.9985猪脂肪y＝1920.85x-1404.062～1000.9997表5恩拉霉素b在猪可食性组织中的基质匹配标准曲线组织回归方程线性范围(μg/l)相关系数猪肉y＝319.27x-91.332～1000.9993猪肾y＝257.95x+89.662～1000.9989猪肝y＝206.21x+424.302～1000.9995猪脂肪y＝1035.20x-742.52～1000.99923、灵敏度配制系列浓度的恩拉霉素a与恩拉霉素b标准工作液添加于空白试料(猪肌肉、脂肪、肾脏和肝脏)中，得到相应的试料添加浓度(10～100μg/kg)，按照实施例1的样品前处理方法操作，经uplc-ms/ms分析，测定药物保留时间处定性离子基线噪音值(s/n)，重复5次，求平均值。取信噪比(s/n)≥3时的浓度为检测限；取信噪比(s/n)≥10时，且rsd≤20％的浓度为定量限。通过试验，确定猪肌肉、脂肪、肝脏、肾脏检测限均为5μg/kg，定量限均为10μg/kg。4、方法的准确度和精密度采用标准添加法进行方法回收率测定。准确称取空白猪肌肉、脂肪、肝脏、肾脏样品若干份，分别添加标准工作液制得肌肉试料中药物含量为10，50，100μg/kg；脂肪试料中药物含量为10，50，100μg/kg；肝脏试料中药物含量为10，50，100μg/kg；肾脏试料中药物含量为10，50，100μg/kg，每个添加浓度5个平行，连续考察3天。采用单点或标准曲线校准回收率，回收率及日内、日间变异系数见表6-13。由表可知，在低(或定量限)、中、高各个浓度下，本方法的回收率在60.10-106.77％，日内变异系数≤11.24％；日间变异系数≤10.92％。数据表明方法稳定可靠，符合准确度和精密度要求。表6猪肌肉中恩拉霉素a添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day＝3)表7猪肾脏中恩拉霉素a添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day＝3)表8猪肝脏中恩拉霉素a添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day＝3)表9猪脂肪中恩拉霉素a添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day3)表10猪肌肉中恩拉霉素b添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day＝3)表11猪肾脏中恩拉霉素b添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day＝3)表12猪肝脏中恩拉霉素b添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day＝3)表13猪脂肪中恩拉霉素b添加回收率和日内和日间精密度(n＝5，day3)虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12