本发明涉及中药质量控制技术领域，特别涉及一种人工牛黄的电化学指纹图谱的检测方法。
背景技术：
牛黄(bostaurusdomesticusgmelin)，为牛科动物牛干燥的胆结石。中医认为牛黄气清香，味微苦而后甜，性凉。可用于解热、解毒、定惊。内服治高热神志昏迷、癫狂、小儿惊风、抽搐等症。由于天然牛黄很珍贵，国际上的价格要高于黄金，所以现在大部分使用的是人工牛黄。人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成，由于其成分复杂，故传统的鉴别方法较为繁琐，由四步骤化学鉴别方法组成。
感康(复方氨酚烷胺片)为复方制剂，由对乙酰氨基酚、盐酸金刚烷胺、人工牛黄、咖啡因、马来酸氯苯那敏组成，其成分中人工牛黄的鉴别在实际生产检验中耗时较长、耗材较多。因此，提供一种耗材价格相对低廉、重现性好、准确性高、鉴别效果优良的人工牛黄鉴别方法对感康(复方氨酚烷胺片)的生产过程中原料药人工牛黄的鉴别具有重要意义。
公布号cn103115841a的中国专利申请公开了一种人工牛黄原料的质量控制方法，通过测定人工牛黄原料的醇溶性浸出物含量、三氯甲烷浸出物的含量和测定胆红素含量三种成分，与标准要求进行比较，从而对人工牛黄原料投料进行控制。公布号cn107328875a的中国专利申请公开了一种用于人工牛黄原料药质量控制的指纹图谱，其参照物为胆酸对照品，采用液相色谱法对人工牛黄检测。上述检测方法只是对人工牛黄中的一种或有限的几种药效物质进行检测，无法实现对人工牛黄中所有的化学成分进行检测，且色谱技术不能直接用于中成药和固体天然药物指纹图谱的测定，测定前必须对其成分进行提取、分离等预处理，试验步骤繁琐，操作流程长，试剂消耗量大。
电化学指纹图谱是在bro3—mn2+-h+-丙酮振荡体系中，调整振荡体系中各物质的浓度，中药参与电化学振荡反应并作为振荡耗散底物，获得的特征振荡波形。在保持振荡体系各物质浓度不变的条件下，只改变中药的种类，可获得的不同中药特征振荡波形。不同中药因含有的化学成份不同，而具有形状迥异的电化学指纹图谱。同种中药，所含成分相同但相对含量不同，其电化学指纹图谱形状相似，但特征参数不同。电化学指纹图谱具有指纹性、专属性和特征性。b-z振荡反应的发现，开启了非线性化学复杂体系的研究，其适用于所有中药体系，征值明显，重现性好图谱信息含量大，特检测费用低廉。但目前研究结果显示该方法只能用于定性分析无法用于定量检测。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种人工牛黄的电化学指纹图谱的检测方法。本发明使用电化学指纹图谱法对人工牛黄进行鉴别，操作简便，结果准确，生产成本低廉，重现性好，不但可对人工牛黄进行定性分析，还可用于人工牛黄的定量分析。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种人工牛黄的电化学指纹图谱的检测方法，包括如下步骤：
在恒温条件下将人工牛黄加入bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中，然后以铂电极作指示电极，以饱和甘汞电极作参比电极，在搅拌状态下进行电化学检测，绘制e-t曲线，得到人工牛黄的电化学指纹图谱；以g/ml计，人工牛黄与bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系的质量体积比为(1～4)：100。
本发明以bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸为振荡体系，以人工牛黄为振荡底物，测定不同产地、厂家人工牛黄的电化学指纹图谱，并将其与党参、白术、黄芪、甘草比较，达到对中药人工牛黄进行鉴别、产地优选、质量控制的目的。
作为优选，人工牛黄为同一产地、厂家4～8个批次的人工牛黄。
作为优选，电化学检测的检测仪器为chi600e型电化学工作站。
作为优选，恒温条件为310±0.05k。
作为优选，铂电极为213型铂电极。
作为优选，饱和甘汞电极为232型饱和甘汞电极。
作为优选，搅拌的转速为400～600r/min。
在本发明提供的具体实施例中，搅拌的转速为500r/min。
在本发明中，bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系包括水、浓硫酸、丙二酸、硫酸锰和溴酸钾。
作为优选，浓硫酸为质量分数98％的浓硫酸，浓硫酸与bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系的体积比为1：(8～12)。
在本发明提供的具体实施例中，浓硫酸与bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系的体积比为1：10。
作为优选，丙二酸在bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中的浓度为0.04～0.05mol/l。
在本发明提供的具体实施例中，丙二酸在bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中的浓度为0.045mol/l。
作为优选，硫酸锰在bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中的浓度为0.001～0.003mol/l。
在本发明提供的具体实施例中，硫酸锰在bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中的浓度为0.002mol/l。
作为优选，溴酸钾在bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中的浓度为0.035～0.045mol/l。
在本发明提供的具体实施例中，溴酸钾在bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中的浓度为0.04mol/l。
在本发明中，e-t曲线采用origin软件绘制。
本发明还提供了一种鉴别人工牛黄的方法，包括如下步骤：
a：建立人工牛黄化学成分的电化学指纹图谱：
将同一产地、厂家的一种人工牛黄作为标准样品，通过电化学振荡反应建立其所有化学成分的电化学指纹图谱；所述电化学指纹图谱的检测方法包括：在恒温条件下将人工牛黄加入bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中，然后以铂电极作指示电极，以饱和甘汞电极作参比电极，在搅拌状态下进行电化学检测，绘制e-t曲线，得到人工牛黄的电化学指纹图谱；以g/ml计，所述人工牛黄与所述bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系的质量体积比为(1～4)：100；
b：检测样品：
取待检测的人工牛黄样品，使用与标准样品相同的条件检测，得出检测样品的电化学指纹图谱，将其与标准样品的电化学指纹图谱比较，如果两者的电化学指纹图谱特征参数的rsd＜10％，则认为是同一产品，如果rsd≥10％则认为是非同一产品。
本发明还提供了一种人工牛黄的定量检测方法，包括如下步骤：
取人工牛黄标准品，采用电化学指纹图谱检测方法，获得特征参数的标准曲线；所述电化学指纹图谱检测方法包括：在恒温条件下将人工牛黄加入bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中，然后以铂电极作指示电极，以饱和甘汞电极作参比电极，在搅拌状态下进行电化学检测，绘制e-t曲线，得到人工牛黄的电化学指纹图谱；以g/ml计，所述人工牛黄与所述bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系的质量体积比为(1～4)：100；所述电化学指纹图谱特征参数为最高电位(v)、诱导时间(s)、振荡寿命(s)、振荡周期(t)中的一种或几种；
取待检测的人工牛黄样品，使用与标准品相同的条件检测，得出检测样品的电化学指纹图谱，根据外标法得到检测样品的浓度或检测量。
本发明提供了一种人工牛黄的电化学指纹图谱的检测方法。该检测方法包括如下步骤：在恒温条件下将人工牛黄加入bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系中，然后以铂电极作指示电极，以饱和甘汞电极作参比电极，在搅拌状态下进行电化学检测，绘制e-t曲线，得到人工牛黄的电化学指纹图谱；以g/ml计，人工牛黄与bro3ˉ-mnso4-h2so4-丙二酸振荡反应体系的质量体积比为(1～4)：100。本发明具有的技术效果为：
1、本发明对人工牛黄所有化学成分反映出的电化学指纹图谱，操作方法快捷便利，所用耗材价格相对低廉，且重现性好，准确性高，有很好的鉴别效果；可达到对中药人工牛黄进行鉴别、产地优选、质量控制的目的，信息可靠，适用于在人工牛黄安全检测技术领域广泛推广应用。
2、在实验中发现振荡反应体系中人工牛黄的质量体积浓度在1％～4％范围内时，诱导时间随着人工牛黄加入量的增加而减小，这是由于人工牛黄中有效成份的量随着其浓度增加而增大，从而使振荡反应速率加快。在此加入量范围内，人工牛黄的加入量和诱导时间呈现较好的线性关系，回归方程为tin＝120.71c+32.24，相关系数为0.96。这一结果显示本发明电化学指纹图谱的检测方法可以用于人工牛黄的定量检测。
附图说明
图1为本发明人工牛黄电化学指纹图谱；
图2为不同产地、品牌人工牛黄电化学指纹图谱；
图3-5为人工牛黄与诱导时间的线性关系；
图6为党参、白术、黄芪、甘草的电化学指纹图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种人工牛黄的电化学指纹图谱的检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，该电化学指纹图谱鉴别方法包括如下步骤：
a：建立人工牛黄化学成分的电化学指纹图谱：
将同一产地、厂家的一种人工牛黄作为标准样品，通过电化学振荡反应建立其所有化学成分的电化学指纹图谱；
b：检测样品：
取待检测的人工牛黄样品，使用与标准样品相同的条件检测，得出检测样品的电化学指纹图谱，将两者的电化学指纹图谱直接观察并且以origin软件分析作为定性依据。
进一步，该电化学指纹图谱鉴别方法包括如下步骤：
a-1：标准品选择：
同一产地、厂家的一种人工牛黄4～8个批次为样品建立其化学成分电化学指纹图；
a-2：电化学指纹图谱分析条件：
检测仪器：chi600e型电化学工作站，232型饱和甘汞电极，213型铂电极；温度(310±0.05)k；磁力搅拌(转速500r/min)至恒温。
a-3：电化学指纹图谱信息参数分析：
用origin软件绘制e-t曲线，即获得人工牛黄电化学指纹图谱以及其特征参数。电化学指纹图谱特征参数包括：最高电位(v)，诱导时间(s)，振荡寿命(s)，振荡周期(t)。测得的电化学指纹图谱的各种特征参数的rsd＜3％。
b：检测样品：
取待检测的人工牛黄样品进行检测，得出检测样品的电化学指纹图谱，将其与标准样品的电化学指纹图谱比较，如果两者的电化学指纹图谱特征参数的rsd＜10％，则认为是同一产品，如果rsd≥10％则认为是非同一产品。
本发明还提供了上述的人工牛黄鉴别方法在感康(复方氨酚烷胺片)生产中原料药人工牛黄的鉴别中的应用。
本发明还提供了该检测方法在人工牛黄定量检测或质量控制中应用。
本发明提供的人工牛黄的电化学指纹图谱的检测方法中所用原料药或试剂、仪器等均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1建立人工牛黄化学成份的电化学指纹图谱
以湖南某正规厂家6个批次的人工牛黄，采用液相色谱技术检测其均为合格产品，以此为标准样品建立其电化学指纹图谱。
使用仪器：chi600e型电化学工作站，hh.s214型电热恒温水浴锅，85-1型磁力搅拌器，znhw-iv型智能恒温控温仪，232型饱和甘汞电极，213型铂电极；
检测方法：电化学振荡反应在连续搅拌得带夹套的反应器中进行，开启超级恒温水浴锅调节水浴温度为(310±0.05)k后恒温，加入0.5g人工牛黄、10ml蒸馏水、2ml98％浓硫酸溶液、2ml丙二酸溶液(0.45mol/l)和2ml硫酸锰溶液(0.02mol/l)于反应器中，开启磁力搅拌器，恒速搅拌(转速500r/min)至恒温后，通过移液枪迅速加入4ml预恒温(310±0.05)k的溴酸钾溶液(0.2mol/l)，即刻点击菜单采集数据，记录e-t曲线至电位振荡消失为止，用origin软件绘制e-t曲线，即获得人工牛黄的电化学指纹图谱，如图1所示。
获得6个人工牛黄的电化学指纹图谱及其特征参数。测得的电化学指纹图谱最高电位、诱导时间、振荡周期、振荡寿命的rsd值分别为：2.37％、1.54％、2.15％、0.97％，各项特征参数的rsd均小于3％。
实施例2检测样品
使用上述与标准样品相同的测定条件，分别测定不同产地、厂家(河北、安徽、广西、湖南)的人工牛黄，其电化学指纹图谱的结果如图2所示。从整个电化学指纹图谱来看，不同产地、厂家的e-t曲线有明显的区别，肉眼即可辨别。测得的电化学指纹图谱的各种特征参数的rsd＞10％，可见该方法可用于人工牛黄的定性检测。
本发明鉴别人工牛黄的电化学指纹法对于特定样品的化学成分电化学指纹图谱的各种特征参数是稳定的。进行鉴别时只需要将被测定样品的电化学指纹图谱与其相同产地、厂家的人工牛黄标准电化学指纹图谱使用origin软件进行比对，如果两者电化学指纹图谱特征参数的rsd＜10％，则为同一产品，rsd≥10％则为非同一产品。此方法可达到对中药人工牛黄进行鉴别、产地优选、质量控制的目的，信息可靠，适用于在人工牛黄安全检测技术领域广泛推广应用。
本发明上述的人工牛黄鉴别方法还可在感康(复方氨酚烷胺片)生产中原料药人工牛黄的鉴别中的应用。
实施例3重现性考察
取6份待测人工牛黄样品，测定其电化学指纹图谱，测得的电化学指纹图谱的最高电位、诱导时间、振荡周期、振荡寿命的rsd值分别为：2.37％、1.54％、2.15％、0.97％，各项特征参数的rsd均小于3％，表明方法具有很好的重现性。
实施例4线性考察
在实验中发现人工牛黄的加入量在0.2g-0.8g范围内时，采用实施例1的方法建立人工牛黄的电化学指纹图谱，诱导时间随着人工牛黄加入量的增加而减小，这是由于人工牛黄中有效成份的量随着其浓度增加而增大，从而使振荡反应速率加快。在此加入量范围内，人工牛黄的加入量和诱导时间呈现较好的线性关系(图3)，回归方程为tin＝120.71c+32.24，相关系数为0.96。这一结果可以用于定量检测。
而当人工牛黄的加入量在0.2g-0.8g范围之外时，人工牛黄的加入量和诱导时间呈现非线性关系，如0.01～0.1g、1～2g时的线性关系图见图4、5。
实施例5
查找文献，将本发明建立的某品牌人工牛黄的电化学指纹图谱与党参、白术、黄芪、甘草的电化学指纹图谱(见图6)及其相关特征参数进行比较，见表1，发现可直观地观察到有很大的不同，比较其各项特征参数，rsd值均大于10％，证明其为不同产品。可知电化学指纹图谱鉴别方法可对中药人工牛黄进行鉴别。
表1本发明电化学指纹图谱鉴别方法对不同中药的鉴别
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。