本发明属于氨基酸的检测领域，具体涉及一种同时检测干血斑、血液和尿液中四十种氨基酸的方法。
背景技术：
：氨基酸是生命的基石，是人体基本营养物质，与生物的生命活动有着密切的关系。氨基酸既是蛋白质的基本组成单位，又是合成核酸的重要氮源并且提供能量。自然界中已发现的氨基酸有180多种，人体内重要的氨基酸有40多种，包含10种必需氨基酸、20多种组成蛋白的氨基酸和一些有重要生理意义的氨基酸，统称为全谱氨基酸。全谱氨基酸在体内是一个平衡状态，全谱氨基酸的失衡是众多疾病的诱因或表现形式，涉及代谢、肿瘤、免疫、病毒感染、心脑血管、神经系统、肾病、糖尿病、亚健康、老年病等各类疾病和儿童生长发育、营养健康、肌肉骨骼生长、激素分泌、解毒功能等人体各种健康环节。目前，氨基酸代谢障碍所引起的疾病已超过400多种。全谱氨基酸检测通过对人体内的氨基酸精确定量，揭示人体内详细的氨基酸代谢状况，从而从不同的代谢路径提示人体的健康状况。全谱氨基酸检测打破以往只注重蛋白类氨基酸的传统，以全面的视角来检测和评估氨基酸代谢平衡，可以作为健康诊断和疾病筛查的重要手段，可以为及早预防疾病、改善身体营养状态和营养补充提供参考标准。目前，氨基酸的测定方法有很多种，包括分光光度法、高效液相色谱法(hplc)、毛细管电泳法(ce)、液相色谱质谱联用技术(hplc-ms/ms)等。分光光度法只能测定一种或一类氨基酸的总量，并不能进行氨基酸的分离分析。高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上发展起来的一种色谱方法，已被广泛应用于医药、生化、石油、化工、环境卫生和食品等领域。hplc一般分为柱前衍生和柱后衍生两大类，不论是柱前衍生离子交换色谱法和柱后衍生高效液相色谱法都需要对样品中的氨基酸进行衍生后才能利用紫外检测器或荧光检测器检测，衍生步骤繁琐、操作复杂，衍生试剂昂贵、耗时较长。ce以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分间淌度和分配行为上的差异实现组分分离的技术，具有分离效率高、无须梯度洗脱、分析速度快、溶剂消耗少等特点，尤其适用于氨基酸的手性分离。但ce分离后通过光度法或电化学检测方法检测复杂样品进行精确而可靠的定量以及重复性方面还是稍显欠缺。hplc-ms/ms分析氨基酸是一种新的趋势之一，其具有较好的分离能力、较高的选择性和灵敏度，较短的分析时间。目前，市面上基于hplc-ms/ms技术同时检测氨基酸的种类最多已达到45种，但是需要对样品进行稳定同位素itraq标记处理，导致检测成本和预处理步骤的增加，以及检测时间的延长。迄今为止，已知hplc-ms/ms对非衍生化氨基酸的检测种类最多只能达到33种。目前还没有一种同时检测40种以上非衍生化氨基酸的有效方法。技术实现要素：针对上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种同时检测干血斑、血液和尿液中四十种氨基酸的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种同时检测干血斑、血液和尿液中四十种氨基酸的方法，采用hplc-ms/ms方法对四十种氨基酸进行检测，液相色谱的流动相a为含十三氟庚酸的水，b为含十三氟庚酸的乙腈，梯度洗脱；质谱采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；四十种氨基酸为：甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、β-丙氨酸(β-ala)、肌氨酸(sar)、α-氨基正丁酸(α-abu)、γ-氨基丁酸(gaba)、丝氨酸(ser)、脯氨酸(pro)、缬氨酸(val)、苏氨酸(thr)、牛磺酸(tau)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、5-氨基乙酰丙酸(δ-ala)、鸟氨酸(orn)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、赖氨酸(lys)、蛋氨酸(met)、组氨酸(his)、苯丙氨酸(phe)、精氨酸(arg)、瓜氨酸(cit)、酪氨酸(tyr)、肌肽(carn)、色氨酸(trp)、同型半胱氨酸(hcy)2、乙醇胺(ea)、肌酸酐(creatinine)、乙酸胍(gaa)、别异亮氨酸(a-ile)、肌酸(creatine)、α-氨基乙二酸(α-aad)、3-甲基组氨酸(3-me-his)、1-甲基组氨酸(1-me-his)、高丝氨酸(hse)、精氨基琥珀酸(asa)、3-羟基脯氨酸(3-hyp)。优选的，具体的液相色谱条件为：色谱柱：c18柱，supelcodiscoveryc18，50×2.1mm，5.0μm，柱温：40℃；流动相a：含0.1％含十三氟庚酸的水，流动相b：含0.1％十三氟庚酸的乙腈；梯度洗脱条件(如表1)：0～1min，90％a，1～3min，90％a，3～5min，85％a，5～6min，80％a，6～7min，75％a，7～8.9min，60％a，8.9～9min，25％a，9～10min，2％a，流速0.3ml/min，进样量，50μl。表1梯度洗脱条件优选的，质谱的具体条件为：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kpa，加热气：50kpa，气帘气：20kpa，喷雾电压：5000v，去溶剂温度：550℃；mrm质谱参数如表2所示：表2mrm质谱参数优选的，上述方法还包括对干血斑、血液或尿液样品进行预处理的步骤。进一步优选的，所述预处理步骤为：首先采用体积比为1:1的甲醇乙腈溶液对样品进行萃取，氮气吹干后，将残留物复溶于0.1％十三氟庚酸水溶液中，过滤得待测样本。更进一步优选的，干血斑样品处理：在干血斑上打三个直径3.2mm的圆孔并将其溶于水中，超声破碎20min，离心取上清液，向上清液中加入体积比为1:1的甲醇乙腈溶液，涡旋震荡后离心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于0.1％十三氟庚酸水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；或，血清样品处理：向血清样本中加入体积比为1:1的甲醇乙腈溶液，涡旋震荡后离心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于0.1％十三氟庚酸水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；或，尿液样品处理：向尿液样本中加入体积比为1:1的甲醇乙腈溶液，涡旋震荡后离心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于0.1％十三氟庚酸水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本。优选的，所述四十种氨基酸的标准工作液的浓度为10-1000μm，配制溶液为0.1nhcl溶液。进一步优选的，所述标准工作液盛装于棕色瓶中，-20℃保存备用。一种同时检测干血斑、血液、尿液样品中四十种氨基酸的试剂盒，包括以下浓度的多种溶液：甘氨酸(gly)：10、50、100、250、500、1000μm；丙氨酸(ala)：10、50、100、250、500、1000μm；β-丙氨酸(β-ala)：10、50、100、250、500、1000μm；肌氨酸(sar)：0.25、1.25、2.5、5、10、25μm；α-氨基正丁酸(α-abu)：10、50、100、250、500、1000μm；γ-氨基丁酸(gaba)：10、50、100、250、500、1000μm；丝氨酸(ser)：10、50、100、250、500、1000μm、脯氨酸(pro)：10、50、100、250、500、1000μm；缬氨酸(val)：10、50、100、250、500、1000μm；苏氨酸(thr)：10、50、100、250、500、1000μm；牛磺酸(tau)：10、50、100、250、500、1000μm；亮氨酸(leu)：10、50、100、250、500、1000μm；异亮氨酸(ile)：10、50、100、250、500、1000μm；5-氨基乙酰丙酸(δ-ala)：0.125、0.25、0.5、1、5、25μm；鸟氨酸(orn)：10、50、100、250、500、1000μm；天冬酰胺(asn)：10、50、100、250、500、1000μm；天冬氨酸(asp)：6.25、12.5、25、50、100、500μm；谷氨酰胺(gln)：10、50、100、250、500、1000μm；谷氨酸(glu)：10、50、100、250、500、1000μm；赖氨酸(lys)：10、50、100、250、500、1000μm；蛋氨酸(met)：10、50、100、250、500、1000μm；组氨酸(his)：10、50、100、250、500、1000μm；苯丙氨酸(phe)：10、50、100、250、500、1000μm；精氨酸(arg)：10、50、100、250、500、1000μm；瓜氨酸(cit)：10、50、100、250、500、1000μm；酪氨酸(tyr)：10、50、100、250、500、1000μm；肌肽(carn)：10、50、100、250、500、1000μm；色氨酸(trp)：10、50、100、250、500、1000μm；同型半胱氨酸(hcy)2：0.25、0.5、1、2、10、50μm；乙醇胺(ea)：10、50、100、250、500、1000μm；肌酸酐(creatinine)：10、50、100、250、500、1000μm；乙酸胍(gaa)：10、50、100、250、500、1000μm；别异亮氨酸(a-ile)：10、50、100、250、500、1000μm；肌酸(creatine)：10、50、100、250、500、1000μm；α-氨基乙二酸(α-aad)：0.125、0.25、0.5、1、5、25μm；3-甲基组氨酸(3-me-his)：6.25、12.5、25、50、100、500μm；1-甲基组氨酸(1-me-his)：6.25、12.5、25、50、100、500μm；高丝氨酸(hse)：10、50、100、250、500、1000μm；精氨基琥珀酸(asa)：10、50、100、250、500、1000μm；3-羟基脯氨酸(3-hyp)：10、50、100、250、500、1000μm的混合标准溶液，甲醇，乙腈，体积分数为0.1％十三氟庚酸的乙腈，体积分数0.1％的十三氟庚酸水溶液，质控品。混合标准溶液是六个浓度梯度的四十种氨基酸标准品的混合溶液，也就是每个梯度是单独的一瓶混合标准溶液，所述标准品有六个梯度，因此有六个标准品混合溶液。所述试剂盒在同时检测甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、β-丙氨酸(β-ala)、肌氨酸(sar)、α-氨基正丁酸(α-abu)、γ-氨基丁酸(gaba)、丝氨酸(ser)、脯氨酸(pro)、缬氨酸(val)、苏氨酸(thr)、牛磺酸(tau)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、5-氨基乙酰丙酸(δ-ala)、鸟氨酸(orn)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、赖氨酸(lys)、蛋氨酸(met)、组氨酸(his)、苯丙氨酸(phe)、精氨酸(arg)、瓜氨酸(cit)、酪氨酸(tyr)、肌肽(carn)、色氨酸(trp)、同型半胱氨酸(hcy)2、乙醇胺(ea)、肌酸酐(creatinine)、乙酸胍(gaa)、别异亮氨酸(a-ile)、肌酸(creatine)、α-氨基乙二酸(α-aad)、3-甲基组氨酸(3-me-his)、1-甲基组氨酸(1-me-his)、高丝氨酸(hse)、精氨基琥珀酸(asa)、3-羟基脯氨酸(3-hyp)中的应用。应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为x轴，标准品峰面积为y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应维生素峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中激素的浓度。优选的，上述方法中包括质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由人工血清添加混合氨基酸标准物质制得，每种氨基酸的浓度与混合标准溶液六个梯度浓度中的第一、第四和第六个梯度浓度相一致，并通过检测确定靶值。本发明的有益效果为：本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种同时检测样品中四十种非衍生化氨基酸的方法，采用本发明可以同时检测甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、β-丙氨酸(β-ala)、肌氨酸(sar)、α-氨基正丁酸(α-abu)、γ-氨基丁酸(gaba)、丝氨酸(ser)、脯氨酸(pro)、缬氨酸(val)、苏氨酸(thr)、牛磺酸(tau)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、5-氨基乙酰丙酸(δ-ala)、鸟氨酸(orn)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、赖氨酸(lys)、蛋氨酸(met)、组氨酸(his)、苯丙氨酸(phe)、精氨酸(arg)、瓜氨酸(cit)、酪氨酸(tyr)、肌肽(carn)、色氨酸(trp)、同型半胱氨酸(hcy)2、乙醇胺(ea)、肌酸酐(creatinine)、乙酸胍(gaa)、别异亮氨酸(a-ile)、肌酸(creatine)、α-氨基乙二酸(α-aad)、3-甲基组氨酸(3-me-his)、1-甲基组氨酸(1-me-his)、高丝氨酸(hse)、精氨基琥珀酸(asa)、3-羟基脯氨酸(3-hyp)，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。氨基酸的研究是代谢组学中最为重要的一环，目前科学对氨基酸的研究是比较广泛和系统的。氨基酸在体内是一个动态的平衡体系，很多氨基酸是相互关联的，快速检测肿瘤、重症监控、术后、肝病、糖尿病、心血管病及前列腺癌患者的全谱氨基酸水平，并作营养健康评估，结合氨基酸代谢组学分析可以指导临床营养补充。同时通过对全谱氨基酸检测结果的系统分析，可以提示检测结果的临床意义和干预调节建议，给医师和营养师进一步诊断、分析提供参考；此外运用质谱技术检测全谱氨基酸检测还可以为营养保健品开发、环境检测等领域提供参考。本发明中使用的提取方法，可以去除样品杂质，降低基质效应，且操作简单快捷，检测结果精确。本发明的方法以各种氨基酸的相对保留时间和定性离子对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。本发明首次实现了应用液相色谱串联质谱技术对一份样本中的四十种非衍生化氨基酸同时检测的目的，该方法操作简便快速分析，通量高、成本低，可实现对人体激素水平的实时监测。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。图1为本发明实施例的甘氨酸(gly)色谱图；图2为本发明实施例的丙氨酸(ala)色谱图；图3为本发明实施例的β-丙氨酸(β-ala)色谱图；图4为本发明实施例的肌氨酸(sar)色谱图；图5为本发明实施例的α-氨基正丁酸(α-abu)色谱图；图6为本发明实施例的γ-氨基丁酸(gaba)色谱图；图7为本发明实施例的丝氨酸(ser)色谱图；图8为本发明实施例的脯氨酸(pro)色谱图；图9为本发明实施例的缬氨酸(val)色谱图；图10为本发明实施例的苏氨酸(thr)色谱图；图11为本发明实施例的牛磺酸(tau)色谱图；图12为本发明实施例的亮氨酸(leu)色谱图；图13为本发明实施例的异亮氨酸(ile)色谱图；图14为本发明实施例的5-氨基乙酰丙酸(δ-ala)色谱图；图15为本发明实施例的鸟氨酸(orn)色谱图；图16为本发明实施例的天冬酰胺(asn)色谱图；图17为本发明实施例的天冬氨酸(asp)色谱图；图18为本发明实施例的谷氨酰胺(gln)色谱图；图19为本发明实施例的谷氨酸(glu)色谱图；图20为本发明实施例的赖氨酸(lys)色谱图；图21为本发明实施例的蛋氨酸(met)色谱图；图22为本发明实施例的组氨酸(his)色谱图；图23为本发明实施例的苯丙氨酸(phe)色谱图；图24为本发明实施例的精氨酸(arg)色谱图；图25为本发明实施例的瓜氨酸(cit)色谱图；图26为本发明实施例的酪氨酸(tyr)色谱图；图27为本发明实施例的肌肽(carn)色谱图；图28为本发明实施例的色氨酸(trp)色谱图；图29为本发明实施例的同型半胱氨酸(hcy)2谱图；图30为本发明实施例的乙醇胺(ea)色谱图；图31为本发明实施例的肌酸酐(creatinine)色谱图；图32为本发明实施例的乙酸胍(gaa)色谱图；图33为本发明实施例的别异亮氨酸(a-ile)色谱图；图34为本发明实施例的肌酸(creatine)色谱图；图35为本发明实施例的α-氨基乙二酸(α-aad)色谱图；图36为本发明实施例的3-甲基组氨酸(3-me-his)色谱图；图37为本发明实施例的1-甲基组氨酸(1-me-his)色谱图；图38为本发明实施例的高丝氨酸(hse)色谱图；图39为本发明实施例的精氨基琥珀酸(asa)色谱图；图40为本发明实施例的3-羟基脯氨酸(3-hyp)色谱图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。实施例(1)制备待测样本a干血斑样品处理：在干血斑上打三个直径3.2mm的圆孔并将其溶于水中超声破碎20min，离心取上清，向上清中加入等体积甲醇：乙腈(体积比为1:1)溶液，涡旋震荡后离心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于0.1％十三氟庚酸水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；b血清样品处理：向血清样本中加入等体积甲醇：乙腈(体积比为1:1)溶液，涡旋震荡后离心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于0.1％十三氟庚酸水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；c尿液样品处理：向尿液样本中加入等体积甲醇：乙腈(体积比为1:1)溶液，涡旋震荡后离心，取上清液至样品瓶中，氮气吹干，将样品复溶于0.1％十三氟庚酸水溶液中，0.2μm滤膜过滤，获得待测样本；(2)超高效液相色谱-质谱检测待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离，液相色谱参考条件：色谱柱：c18柱(supelcodiscoveryc18，50×2.1mm，5.0μm)柱温：40℃进样体积：50μl流速：300μl/min流动相a：含0.1％含十三氟庚酸的水流动相b：含0.1％含十三氟庚酸的乙腈梯度洗脱条件：时间(min)a相比例(％)b相比例(％)0901019010385155802067525760408.92575929810298质谱参数参考条件：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式雾化气：60kpa加热气：50kpa气帘气：20kpa喷雾电压：5000v去溶剂温度：550℃mrm质谱参数：(3)计算结果标准工作液的配制：以水配制1000μm各氨基酸标准品储备液，然后以0.1nhcl溶液制备6个梯度的混合标准溶液分装于1.5ml棕色瓶中，-20℃保存备用，标准品需参与样本提取。具体为：以0.1nhcl溶液配制一系列浓度的标准溶液建立校正工作曲线(甘氨酸(gly)：10、50、100、250、500、1000μm、丙氨酸(ala)：10、50、100、250、500、1000μm、β-丙氨酸(β-ala)：10、50、100、250、500、1000μm、肌氨酸(sar)：0.25、1.25、2.5、5、10、25μm、α-氨基正丁酸(α-abu)：10、50、100、250、500、1000μm、γ-氨基丁酸(gaba)：10、50、100、250、500、1000μm、丝氨酸(ser)：10、50、100、250、500、1000μm、脯氨酸(pro)：10、50、100、250、500、1000μm、缬氨酸(val)：10、50、100、250、500、1000μm、苏氨酸(thr)：10、50、100、250、500、1000μm、牛磺酸(tau)：10、50、100、250、500、1000μm、亮氨酸(leu)：10、50、100、250、500、1000μm、异亮氨酸(ile)：10、50、100、250、500、1000μm、5-氨基乙酰丙酸(δ-ala)：0.125、0.25、0.5、1、5、25μm、鸟氨酸(orn)：10、50、100、250、500、1000μm、天冬酰胺(asn)：10、50、100、250、500、1000μm、天冬氨酸(asp)：6.25、12.5、25、50、100、500μm、谷氨酰胺(gln)：10、50、100、250、500、1000μm、谷氨酸(glu)：10、50、100、250、500、1000μm、赖氨酸(lys)：10、50、100、250、500、1000μm、蛋氨酸(met)：10、50、100、250、500、1000μm、组氨酸(his)：10、50、100、250、500、1000μm、苯丙氨酸(phe)：10、50、100、250、500、1000μm、精氨酸(arg)：10、50、100、250、500、1000μm、瓜氨酸(cit)：10、50、100、250、500、1000μm、酪氨酸(tyr)：10、50、100、250、500、1000μm、肌肽(carn)：10、50、100、250、500、1000μm、色氨酸(trp)：10、50、100、250、500、1000μm、同型半胱氨酸(hcy)2：0.25、0.5、1、2、10、50μm、乙醇胺(ea)：10、50、100、250、500、1000μm、肌酸酐(creatinine)：10、50、100、250、500、1000μm、乙酸胍(gaa)：10、50、100、250、500、1000μm、别异亮氨酸(a-ile)：10、50、100、250、500、1000μm、肌酸(creatine)：10、50、100、250、500、1000μm、α-氨基乙二酸(α-aad)：0.125、0.25、0.5、1、5、25μm、3-甲基组氨酸(3-me-his)：6.25、12.5、25、50、100、500μm、1-甲基组氨酸(1-me-his)：6.25、12.5、25、50、100、500μm、高丝氨酸(hse)：10、50、100、250、500、1000μm、精氨基琥珀酸(asa)：10、50、100、250、500、1000μm、3-羟基脯氨酸(3-hyp)：10、50、100、250、500、1000μm)的混合标准溶液分装于1.5ml棕色瓶中，-20℃保存备用。应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为x轴，标准品峰面积为y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中四十种氨基酸的浓度。如图1，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本甘氨酸(gly)含量为233.96μm。如图2，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本丙氨酸(ala)含量为300.26μm。如图3，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本β-丙氨酸(β-ala)含量为27.80μm。如图4，用本发明方法测定0.25～25μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本肌氨酸(sar)含量为0.70μm。如图5，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本α-氨基正丁酸(α-abu)含量为28.96μm。如图6，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本γ-氨基丁酸(gaba)含量为323.57μm。如图7，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本丝氨酸(ser)含量为97.78μm。如图8，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本脯氨酸(pro)含量为234.06μm。如图9，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本缬氨酸(val)含量为242.34μm。如图10，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本苏氨酸(thr)含量为153.78μm。如图11，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本牛磺酸(tau)含量为195.97μm。如图12，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本亮氨酸(leu)含量为125.33μm。如图13，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本异亮氨酸(ile)含量为85.41μm。如图14，用本发明方法测定0.125～25μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本5-氨基乙酰丙酸(δ-ala)含量为0.15μm。如图15，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本鸟氨酸(orn)含量为139.44μm。如图16，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本天冬酰胺(asn)含量为66.83μm。如图17，用本发明方法测定6.25～500μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本天冬氨酸(asp)含量为7.48μm。如图18，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本谷氨酰胺(gln)含量为114.18μm。如图19，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本谷氨酸(glu)含量为31.15μm。如图20，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本赖氨酸(lys)含量为252.32μm。如图21，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本蛋氨酸(met)含量为25.49μm。如图22，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本组氨酸(his)含量为56.36μm。如图23，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本苯丙氨酸(phe)含量为84.03μm。如图24，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本精氨酸(arg)含量为54.79μm。如图25，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本瓜氨酸(cit)含量为29.10μm。如图26，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本酪氨酸(tyr)含量为85.22μm。如图27，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本肌肽(carn)含量为27.45μm。如图28，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本色氨酸(trp)含量为74.28μm。如图29，用本发明方法测定0.25～50μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本同型半胱氨酸(hcy)2含量为7.39μm。如图30，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本乙醇胺(ea)含量为13.80μm。如图31，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本肌酸酐(creatinine)含量为107.69μm。如图32，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本乙酸胍(gaa)含量为44.60μm。如图33，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本别异亮氨酸(a-ile)含量为11.30μm。如图34，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本肌酸(creatine)含量为25.32μm。如图35，用本发明方法测定0.125～25μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本α-氨基乙二酸(α-aad)含量为0.33μm。如图36，用本发明方法测定6.25～500μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本3-甲基组氨酸(3-me-his)含量为5.19μm。如图37，用本发明方法测定6.25～500μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本1-甲基组氨酸(1-me-his)含量为7.35μm。如图38，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本高丝氨酸(hse)含量为74.39μm。如图39，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本精氨基琥珀酸(asa)含量为89.24μm。如图40，用本发明方法测定10～1000μm的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本3-羟基脯氨酸(3-hyp)含量为14.08μm。以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页12