本发明属于分析检测技术领域，具体涉及基于dna-银纳米簇与聚吡咯纳米粒的转录因子检测方法。
背景技术：
转录因子(transcriptionfactors,tfs)是细胞中的一种调控蛋白。当细胞接受外在或内在刺激后，信号通路将所接受到的刺激传导到tfs，调节tfs的状态使其与基因的结合能力发生改变。这种结合能力的改变影响了相关基因的表达，从而起到调控生命过程的作用。由于转录因子决定了被调控基因的表达水平，因此在基因表达中起着至关重要的作用。同时，大量研究指出，tfs的非正常表达与活化，与大量的人类疾病存在关联性，包括癌症的产生与转移、病毒感染、自身免疫疾病等包含了tfs的异常调控或变异。因此，tfs既可以成为临床治疗的靶点，又可以作为一种潜在的诊断标志物。但是现有的技术尚无法实现高效检测tfs，已普及的基于抗体的tfs检测方法只能限于实验室检测，而新近发表的研究大多应用了昂贵的荧光标记、难以保存的工具酶等，降低了这些分析技术的效率。
近期出现了一种无酶的基于空间位阻效应的石墨烯tfs检测平台，虽然具有简便灵敏的优点，但是荧光标记的使用使其分析成本仍然偏高。与此同时，由于石墨烯与生物分子具有广泛的吸引作用，使得这一类分析方法的灵敏度往往偏低。
综上所述，实现免标记，快速、灵敏检测转录因子是现在研究的热点之一。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用由dna-银纳米簇(dna-agnanoclusters，dna-agncs)与聚吡咯纳米粒(polypyrrolenanoparticles，ppynps)构建的tfs传感系统进行检测转录因子的方法。该传感系统基于空间位阻效应，但与已有的由石墨烯构建的传感系统相比，具有更高灵敏度的特点，我们认为这一特点与ppynps的低非特异性蛋白吸附性质有关，这也是ppynps首次应用于tfs分析领域。此外，dna-agncs的应用使得该传感平台具有免标记、低成本的特点。我们综合利用了dna-agncs可以模块化设计的优势，合成了两种具有不同荧光性质的dna-agncs，成功构建了可以实现多路复用检测(multiplexeddetection)的传感平台。这一发明能够克服现有转录因子检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。
一种基于dna-银纳米簇与聚吡咯纳米粒的转录因子检测方法，包括如下步骤：
a)将dna-银纳米簇与聚吡咯纳米粒在缓冲液1中混合并孵育；
b)将多个不同浓度的转录因子与步骤c)得到的混合系统孵育反应；
c)测定样品在537nm激发波长下，627nm处的荧光值；或在770nm激发波长下，833nm处的荧光值。利用测得的i627与i833的值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系；
d)将待测样品根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度，得到待测样品中转录因子的浓度。其中，待测样品可以是从实际细胞或组织样品中获得的核蛋白提取物。
上述dna-银纳米簇是用以下dna序列制备agp1和agp2两种dna-银纳米簇：
agp1模板：acccgaacctgggctaccacccttaatccccgggactttcctcaaaaattctgccttggaaagtccc
agp2模板：cccacccaccctcccaggacatgcccgggcatgtcctcaaaaattctgccttggacatgcccgggcatgtcc。
上述步骤a)中dna-银纳米簇与聚吡咯纳米粒在缓冲液1中混合步骤为：用缓冲液1将聚吡咯纳米粒稀释至15mg/ml，随后，将1μl,10μm的agp1，1μl,10μm的agp2与50μl,15mg/ml的聚吡咯纳米粒混合。
上述缓冲液1的具体配方为10mmna2hpo4/nah2po4、100mmch3coona和10mmmg(ch3cooh)2,ph＝7.4。
上述孵育为在36-38℃下孵育10-15min，优选孵育为在37℃下孵育10min。
上述转录因子为nf-κbp50和p53，转录因子nf-κbp50的浓度范围是0.1nm-50nm，转录因子p53的浓度范围是0.15nm-50nm。
上述步骤b)具体为：每52μl步骤a)制备的混合体系与体积为38μl浓度为0.1nm-50nm的转录因子nf-κbp50溶液或体积为38μl浓度为0.15nm-50nm的转录因子p53混合，再加入10μl缓冲液3，在37℃下反应1h；其中，缓冲液3为10mm三羟甲基氨基甲烷–醋酸,100mm氯化钾,2mm氯化镁,0.1mmedta和占缓冲液3体积分数10％的丙三醇,ph7.5。
上述步骤c)具体为：将样品在激发波长为537nm，测定627nm处的荧光值；770nm激发波长下，测定833nm处的荧光值；扫描速度为1200nm/min，光电倍增管电压为750v，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm，利用测得的i627与i833的值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系。
本发明所述的dna-银纳米簇是以发卡状dna为模板，加入硝酸银、硼氢化钠，使其原位还原生成；所述的聚吡咯纳米粒是以吡咯单体、聚乙烯吡咯烷酮、氯化铁为原料，合成得到。
上述的dna-银纳米簇是通过以下步骤制备得到的：将1od的agp1模板溶解于975μl缓冲液2中，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h，随后加入12μl，10mm新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入12μl，10mm新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；将1od的agp2模板溶解于975μl缓冲液2中，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h，随后加入16μl，10mm新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入8μl，10mm新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；其中，所述的缓冲液2为10mm柠檬酸盐缓冲液,ph6.8。
上述的聚吡咯纳米粒是通过以下步骤制备得到的：将2g分子量为24000的pvp溶解于50ml超纯水中，持续搅拌30min使其完全溶解。随后加入250μl吡咯单体，避光搅拌15min；接着逐滴缓慢加入2ml,0.75g/ml的fecl3·6h2o溶液，温和搅拌下常温反应3h，最后用体积比为1:1的甲醇-丙酮溶液离心洗涤，得到聚吡咯纳米粒。
制备dna-银纳米簇也可以使用现有技术，如journaloftheamericanchemicalsociety,2013,135(32),11832-11839中记载的方法；制备聚吡咯纳米粒也可以使用现有技术,如chemicalcommunications,2015,51(31),6800-6803中记载的方法。
本发明的有益效果：
1)本方法采用dna-agncs作为荧光探针，参与tfs的检测。这种荧光探针与常用的有机荧光分子相比，具有低成本、强荧光的优点。同时，dna-agncs具有模块化设计的优点，本发明中合成了具有不同荧光性质的agp1与agp2，其中agp1的茎部分能够与nf-κbp50结合，而agp2的茎部分能够与p53结合。
2)本发明首次将ppynps用于构建基于空间位阻效应的tfs传感平台。与已有的基于同一机理的文献报道相比，本发明使检测灵敏度提高了1-2个数量级。并且，本分析方法不需要复杂的温度控制，只需要简单的一步加样就能在均相溶液中检测转录因子。可以用于癌细胞中tfs的定量检测，具有良好的回收率。
3)与现有技术相比，本发明具有对转录因子进行免标记、无酶、高灵敏、低成本、高通量检测的优势，具有良好的应用前景。
附图说明
图1a是dna-银纳米簇的结构；1b是基于dna-银纳米簇与聚吡咯纳米粒的转录因子荧光传感系统的原理图；
图2a是加入不同浓度nf-κbp50检测荧光所得到的线性，图2b是加入不同浓度p53检测荧光所得到的线性；图2c和2d是基于ppynps与石墨烯构建的传感平台对于基质蛋白的抗干扰能力。
图3a和b是本检测方法对于nf-κbp50与p53的选择性；
图中，blank是空白样品，bsa是牛血清白蛋白，has是人血清白蛋白，insulin是人胰岛素，nf-κbp65是与nf-κbp50结合序列不同的同家族转录因子，从图中可以看出本方法对目标转录因子具有良好的选择性。
图4中abcd是本方法进行多路复用检测的荧光光谱图，e是检测经h2o2和tnf-α处理过的dld-1细胞核蛋白提取物的结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅仅限定于这些实施例。
药品和试剂：实验中使用的dna均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经hplc纯化。分析纯的agno3、nabh4、吡咯、聚乙烯吡咯烷酮、六水合氯化铁购买自阿拉丁试剂(上海，中国)。荧光光谱实验由hitachif-4600荧光分光光度计获得(日本)，荧光读数数据获得自tecaninfinitem200多功能酶标仪(瑞士)。核蛋白提取试剂盒购买自生工生物工程(上海，中国)。其他试剂均购买自国药试剂(上海，中国)，并且均为分析纯。
实施例1
一种转录因子的检测方法，包括以下步骤：
1)dna-agncs的合成：将1od的agp1模板溶解于975μl缓冲液2中，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h，随后加入12μl，10mm新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入12μl，10mm新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；将1od的agp2模板溶解于975μl缓冲液2中，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h，随后加入16μl，10mm新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入8μl，10mm新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜其中。
其中，agp1模板与agp2模板的dna序列为：
agp1模板：acccgaacctgggctaccacccttaatccccgggactttcctcaaaaattctgccttggaaagtccc
agp2模板：cccacccaccctcccaggacatgcccgggcatgtcctcaaaaattctgccttggacatgcccgggcatgtcc。
2)ppynps的合成：将2gpvp(分子量24000)溶解于50ml超纯水中，持续搅拌30min使其完全溶解。随后加入250μl吡咯单体，避光搅拌15min。接着逐滴缓慢加入2ml,0.75g/ml的fecl3·6h2o溶液，温和搅拌下常温反应3h。最后用甲醇-丙酮(v/v＝1:1)溶液离心洗涤，得到聚吡咯纳米粒。
3)dna-agncs与ppynps的吸附：用缓冲液1将聚吡咯纳米粒稀释至15mg/ml。随后，将1μl,10μm的agp1，1μl,10μm的agp2与50μl,15mg/ml的聚吡咯纳米粒混合，在37℃下孵育10min。
4)检测nf-κbp50的线性：每52μl步骤3)制备的混合体系与体积为38μl浓度分别为0.1nm、0.5nm、2nm、5nm、7nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm的转录因子nf-κbp50溶液，或体积为38μl浓度为0.15nm、3nm、8nm、11nm、14nm、17nm、20nm、23nm、40nm、50nm的转录因子p53混合，再加入10μl缓冲液3，在37℃下反应1h。根据i627的荧光读数与nf-κbp50的浓度关系，获得对nf-κbp50的线性方程。根据i833的荧光读数与p53的浓度关系，获得对p53的线性方程。
4)实际样品中nf-κbp50的检测：每52μl步骤3)制备的混合体系与体积为38μl的核蛋白提取物混合，再加入10μl缓冲液3，在37℃下反应1h。将i627的荧光读数代入步骤3)得到的线性方程，得到nf-κbp50的浓度；将i833的荧光读数代入步骤3)得到的线性方程，获得p53的浓度。
本实施例中使用的缓冲液配方见表1：
表1缓冲液配方
实施例2
本发明检测方法的选择性实验
重复实施例1中的步骤1)-3)，将步骤3)中的tfs更换为牛血清白蛋白、人胰岛素、人血清白蛋白、nf-κbp65等干扰物，其它条件不变，检测荧光，得到本方法检测目标tfs的选择性结果图。
实施例3
本发明检测方法的回收率实验
重复实施例中1)的步骤1)-4)，在步骤4)中，进行加样检测，分别添加50、100、250、500、1000pm的nf-κbp50，进行检测，获得本方法在实际样品检测中的回收率，结果见表2。
表2本方法检测nf-κbp50的回收率
实施例4
重复实施例1中的步骤1)-4)，在步骤4)中，分别加入既有nf-κbp50又有p53的样品、只有nf-κbp50与只有p53的样品、以及不含nf-κbp50与p53的样品。分别用荧光分光光度计记录这些样品在537nm与770nm激发下的荧光发射光谱。记录到的发射光谱见图4a/b/c/d。
实施例5
本发明方法用于检测经h2o2和tnf-α处理的dld-1细胞核蛋白提取物中的nf-κbp50在培养dld-1细胞的过程中，分别加入h2o2和tnf-α处理30min，提取其核蛋白。
重复实施例1)中的步骤1)-4)，在步骤4)中，将上述处理后的样品的荧光值代入线性方程，得到相对应的nf-κbp50与p53的浓度，做出热度图见图4e。
实施例6
本发明与已报道的基于空间位阻效应的转录因子检测方法在分析性能上的比较，见表3。
表3本方法与已报道的基于空间位阻效应的转录因子检测方法的比较