背影技术：维生素a棕榈酸酯为黄色粘稠油状液体，储存过程中可能形成固体，属维生素类药，对空气、热、光和湿度敏感，不溶于水，溶于乙醇，易溶于乙醚、三氯甲烷、丙酮和油脂中。具体化学结构为：维生素a棕榈酸酯是一种重要的注射级原料药，是“注射用多种维生素(12)”、“多种维生素注射液(13)”等药品的必需原料药，维生素a棕榈酸酯对热很不稳定，自身所含杂质成分也较多，其在合成和制剂的储存过程中经常相伴出现脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯三种杂质。其中脱水视黄醇分子式：c20h28；分子量：268.44；化学式为：(3e,5e,7e)-3,7-二甲基-9-[(1z)-2,6,6-三甲基环己基-2-烯亚基]-1,3,5,7-壬四烯，是由烯丙型醇结构在h+下，发生脱水反应，生成的，其生物活性只有维生素a的0.4％，结构式如下：视黄醇硬脂酸酯分子式c38h64o2，分子量552.91；化学式为：(2e,4e,6e,8e)-3,7-二甲基-9-(2,6,6-三甲基环己基-l-烯基)-2,4,6,8-壬四烯-l-硬脂酸酯，结构式如下：维生素a醋酸酯分子式c22h32o2；分子量328.49；结构式如下：在关于维生素a棕榈酸酯的现有技术中，cn201511027562.6一种维生素a棕榈酸酯的合成方法中公开了采用美国药典usp28的方法对合成后的维生素a棕榈酸酯进行分析，结果表明维生素a棕榈酸酯的含量88.63％。转化率90.93％(实施例2)，说明其中有大量的杂质，但并没有公开具体的杂质和相应的分析方法。陈红丽等公开发表的hplc法测定脂溶性维生素注射液中维生素a棕榈酸酯的有关物质的文献中没有公开上述杂质的测量方法，且维生素a棕榈酸酯的线性范围为：0.206-5.14mg/l，检测限为0.041mg/l，检测限较高，该方法灵敏度不高。现有技术中并没有公开维生素a棕榈酸酯中关于脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯杂质的分析方法；且现有的维生素a棕榈酸酯原料药和其制剂药品质量标准中欧洲药典(ep)、英国药典(bp)、日本药典(jp)、美国药典(usp)中也没有明确收录有关以上三种杂质的定量和定性的方法。技术实现要素：：针对以上问题，本申请主要针对维生素a棕榈酸酯中关于脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯三种杂质的定性和定量方法进行研究，本申请的技术方案如下：一种检测维生素a棕榈酸酯中杂质的分析方法，采用高效液相色谱仪测定，其色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相a：5mmol/l醋酸铵溶液-甲醇；流动相b：甲醇-异丙醇；流速：0.8-1.2ml/min；柱温：25-35℃；进样量：20μl；紫外检测器检测波长：325nm；流动相a、b按梯度程序进行。优选的，色谱柱为：ace3c18；规格为：4.6mm×100mm，3μm。优选的，流动相a中5mmol/l醋酸铵溶液用冰醋酸调节ph值至4.0-5.0；流动相a中5mmol/l醋酸铵溶液-甲醇的体积比为20-40∶60-80；流动相b中甲醇-异丙醇的体积比为45-65∶35-55。优选的，流动相a中5mmol/l醋酸铵溶液用冰醋酸调节ph值至4.0-4.5；流动相a中5mmol/l醋酸铵溶液-甲醇的体积比为20-30∶70-80；流动相b中甲醇-异丙醇的体积比为45-55∶45-55。更优选的，流动相a中5mmol/l醋酸铵溶液用冰醋酸调节ph值至4.5；流动相a中5mmol/l醋酸铵溶液-甲醇的体积比为30∶70；流动相b中甲醇-异丙醇的体积比为55∶45。上述色谱条件总流动相的流速为1.0ml/min，柱温为30℃。上述色谱条件中，梯度洗脱程序为：优选的，梯度洗脱程序优选为：上述方法可用于检测维生素a棕榈酸酯中脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯三种杂质的方法；其中的维生素a棕榈酸酯为任何含有维生素a棕榈酸酯的制剂、原料或产品中。有益效果：通过本申请的技术方案，可以达到以下分析效果：1、能同时分析维生素a棕榈酸酯含有脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯三种杂质的方法，各物质的线性范围较宽：维生素a棕榈酸酯在0.0637～0.2387μg/ml浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998；脱水视黄醇在0.0596～0.2234μg/ml浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998；视黄醇硬脂酸酯在0.0242～0.2271μg/ml浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998；维生素a醋酸酯在0.0129～0.2418μg/ml浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998；以上都符合可接受标准，说明以上物质在相应的浓度范围内线性关系良好。2、定量限相对较低：维生素a棕榈酸酯的定量限为0.40ng；脱水视黄醇的定量限为1.19ng；视黄醇硬脂酸酯的定量限为0.48ng；维生素a醋酸酯的定量限为0.26ng。3、检测限较低：维生素a棕榈酸酯的检测限为0.12ng；脱水视黄醇的检测限为0.36ng；视黄醇硬脂酸酯的检测限为0.14ng；维生素a醋酸酯的检测限为0.08ng。4、回收率在可接受的范围内：脱水视黄醇回收率在94.24％～101.0％之间，rsd值为2.8％；视黄醇硬脂酸酯回收率在91.50％～95.00％之间，rsd值为1.4％；维生素a醋酸酯回收率在93.35％～99.50％之间，rsd值为2.5％；上述结果均符合可接受标准，说明该方法准确度良好。总之，利用本申请中的技术方案进行分析，检测限、定量限都相对较低，线性范围较广、准确度较高，符合精确的检测要求。实施例为便于理解
发明内容，下面结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但不以任何方式限制本发明。以下为实施例1-4中的色谱条件：色谱柱：ace3c18，4.6mm×100mm，3μm；流动相a：5mmol/l醋酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至4.5)-甲醇，体积比为30∶70；流动相b：甲醇-异丙醇，体积比为55∶45；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；紫外检测器检测波长：325nm；流动相a、b按梯度程序进行：实施例1：检测限(1)溶液的配置各物质检测限贮备液的配置：精密称取脱水视黄醇对照品2mg、视黄醇硬脂酸酯对照品2mg、维生素a醋酸酯对照品5mg、维生素a棕榈酸酯对照品2mg，分别置100ml量瓶中，加流动相b溶解并稀释至刻度，作为各物质的检测限贮备液。检测限测定溶液的配置：对脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯、维生素a棕榈酸酯储备液进行梯次稀释，得出s/n≈3时的溶液作为各物质检测限测定溶液；(2)测定结果精密量取检测限测试溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如下：表1检测限测定结果名称检测限浓度(μg/ml)检测限(ng)维生素a棕榈酸酯0.00610.12脱水视黄醇0.01790.36视黄醇硬脂酸酯0.00730.14维生素a醋酸酯0.00390.08结论：维生素a棕榈酸酯的检测限为0.12ng，检测限浓度为0.0061μg/ml；脱水视黄醇的检测限为0.36ng，检测限浓度为0.0179μg/ml；视黄醇硬脂酸酯的检测限为0.14ng，检测限浓度为0.0073μg/ml；维生素a醋酸酯的检测限为0.08ng，检测限浓度为0.0039μg/ml。实施例2定量限(1)溶液的配置各物质定量限测试溶液的配置：取实施例1步骤(1)中的各物质检测限贮备液，用流动相b逐级稀释到信噪比s/n≈10的浓度，即得；(2)测定结果精密量取定量限测试溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，测定结果如下：表2定量限测定结果名称定量限浓度(μg/ml)定量限(ng)维生素a棕榈酸酯0.02020.40脱水视黄醇0.05961.19视黄醇硬脂酸酯0.02420.48维生素a醋酸酯0.01290.26结论：主成分的定量限为0.40ng，定量限浓度为0.020μg/ml；脱水视黄醇的定量限为1.19ng，定量限浓度为0.060μg/ml；视黄醇硬脂酸酯的定量限为0.48ng，定量限浓度为0.024μg/ml；维生素a醋酸酯的定量限为0.26ng，定量限浓度为0.013μg/ml。实施例3：线性关系试验溶液的配置：(1)对照品贮备液：称取脱水视黄醇对照品约2mg、视黄醇硬脂酸酯对照品约2mg、维生素a醋酸酯对照品约5mg、维生素a棕榈酸酯对照品约2mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相b溶解并稀释至刻度，再精密量取上述溶液10ml，置100ml量瓶中，加流动相b溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液；(2)精密量取步骤(1)中的溶液1ml、2.5ml、5ml、10ml、15ml、20ml分别置100ml量瓶中，加流动相b稀释至刻度，摇匀，分别作为线性溶液1、线性溶液2、线性溶液3、线性溶液4、线性溶液5、线性溶液6；(3)精密量取步骤(2)中的线性溶液1-6各20μl，注入液相色谱仪，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果如下：a维生素a棕榈酸酯的线性方程为：y＝105884.2209c-763.6745r2＝0.9995；其在0.0202～0.2387μg/ml浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998，符合可接受标准，说明维生素a棕榈酸酯在此浓度范围内线性关系良好；b脱水视黄醇的线性方程为：y＝29068.8162c+335.8353r2＝0.9996；其在0.0596～0.2234μg/ml浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998，符合可接受标准，说明脱水视黄醇在此浓度范围内线性关系良好；c视黄醇硬脂酸酯的线性方程为：y＝77673.3316c+339.3889r2＝0.9997；其在0.0242～0.2271μg/ml(定量限～限度浓度的150％)浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998，符合可接受标准，说明视黄醇硬脂酸酯在此浓度范围内线性关系良好；d维生素a醋酸酯的线性方程为：y＝156973.1346c+401.5236r2＝0.9995；其在0.0129～0.2418μg/ml浓度范围内线性方程的相关系数r为0.9998，符合可接受标准，说明维生素a醋酸酯在此浓度范围内线性关系良好。实施例4回收率实验(1)溶液的配置供试品溶液：取供试品约10mg，精密称定，置100ml量瓶中，加异丙醇3ml使溶解，再加流动相b溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。对照品贮备液：取脱水视黄醇对照品约20mg、视黄醇硬脂酸酯对照品约20mg、维生素a醋酸酯对照品约55mg，精密称定，置50ml量瓶中，加流动相b溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1ml，置25ml量瓶中，加流动相b稀释至刻度，摇匀，即得。对照品溶液：分别精密量取对照品贮备液1、2、3各1ml，置100ml量瓶中，加流动相b稀释至刻度，摇匀，即得。80％准确度溶液：取本品约10mg，精密称定3份，置100ml量瓶中，分别精密加入对照品贮备液1、2、3各0.8ml，加流动相b溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；同样方法配置3份。100％准确度溶液：取本品约10mg，精密称定3份，置100ml量瓶中，分别精密加入对照品贮备液1、2、3各1.0ml，加流动相b溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；同样方法配置3份。120％准确度溶液：取本品约10mg，精密称定3份，置100ml量瓶中，分别精密加入对照品贮备液1、2、3各1.2ml，加流动相b溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；同样方法配置3份。(2)精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，结果如下：表3脱水视黄醇准确度试验结果表4视黄醇硬脂酸酯准确度试验结果表5维生素a醋酸酯准确度试验结果结论：脱水视黄醇回收率在94.24％～101.0％之间，rsd值为2.8％；视黄醇硬脂酸酯回收率在91.50％～95.00％之间，rsd值为1.4％；维生素a醋酸酯回收率在93.35％～99.50％之间，rsd值为2.5％。上述结果均符合可接受标准，说明该方法准确度良好。实施例5(1)溶液的配制对照品贮备液的配置：取脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯对照品约1mg，精密称定，置100ml量瓶中，加流动相b溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；对照品溶液的配置：精密量取1ml，置100ml量瓶中，加流动相b稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；供试品溶液的配置：取维生素a棕榈酸酯原料药适量，精密称定，加流动相b溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；避光操作，临用新制。(2)色谱条件高效液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相a：5mmol/l醋酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至4.0)-甲醇，体积比为20∶80；流动相b：甲醇-异丙醇，体积比为45∶55；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；进样量：20μl；紫外检测器检测波长：325nm。流动相a、b按梯度程序进行。(3)测定结果精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，供试品溶液色谱图中杂质封按外标法以峰面积计算，三种杂质完全分开，分析结果如下：实施例6(1)溶液的配制对照品贮备液的配置和对照品溶液的配置同实施例5供试品溶液的配置：取含维生素a棕榈酸酯的制剂适量，精密称定，加流动相b溶解并稀释制成每1ml中约含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；避光操作，临用新制。(2)色谱条件：色谱柱：ace3c18规格为：4.6mm×100mm，3μm；流动相a：5mmol/l醋酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至5.0)-甲醇，体积比为40∶60；流动相b：甲醇-异丙醇，体积比为65∶35；流速：1.2ml/min；柱温：35℃；进样量：20μl；紫外检测器检测波长：325nm。流动相a、b按梯度程序进行。(3)测定结果精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，供试品溶液色谱图中杂质封按外标法以峰面积计算，三种杂质完全分开，分析结果如下：保留时间含量(μg/ml)维生素a棕榈酸酯34.5360.143脱水视黄醇14.5620.125视黄醇硬脂酸酯43.2580.035维生素a醋酸酯10.2560.078实施例7(1)溶液的配制对照品贮备液的配置和对照品溶液的配置同实施例6供试品溶液的配置：实施例6中的供试品溶液(2)色谱条件：流动相a：5mmol/l醋酸铵溶液(用冰醋酸调节ph值至3.5)-甲醇，体积比为40∶60；其它条件同实施例6；(3)测定结果精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，供试品溶液色谱图中杂质封按外标法以峰面积计算，三种杂质完全分开，分析结果如下：保留时间含量(μg/ml)维生素a棕榈酸酯32.5620.142脱水视黄醇未检测到未检测到视黄醇硬脂酸酯41.2570.042维生素a醋酸酯8.3500.069结论：由于改变流动相a的ph范围，导致相同的供试品(同为实施例6中的供试品)却不能同时检测到脱水视黄醇、视黄醇硬脂酸酯、维生素a醋酸酯三种物质，而且实施例7中视黄醇硬脂酸酯和维生素a醋酸酯定量结果和实施例6中两种物质的定量结果不同，(实施例6中两者的含量为0.035μg/ml和0.078μg/ml)具有很大的偏差；所以本技术方案中的流动相a的ph值对测定结果具有很大的影响。当前第1页12