本发明涉及微藻生物能源领域，尤其涉及一种微量、快速测定藻油含量的方法。
背景技术：
人类文明的进步很大程度上依赖于能源的发展，目前人类所使用的能源中以化石燃料为主，而文明经济的迅速增长导致人类对于能源的需求量迅速上升。当今世界能源危机加深，化石燃料的短缺及其带来的环境问题也日益凸显，因此寻找环境友好的可再生能源已成为世界各国所关注的问题。生物柴油作为一种可再生、环境友好型的新型能源已备受关注，其来源以微藻最受关注，原因在于微藻具有产油量高、生长速度快并且易于培养等优点，因此最适宜作为生物柴油的生产原料。基于此，微藻生物柴油已成为新能源领域中的研究热点，其发展对于减少化石燃料的使用及保证国家能源安全具有重要意义。
富油微藻的筛选、培养及其油脂含量的测定是获取高质量藻种的必经之路，在此过程中，往往需要针对较多的微藻样品进行频繁的油脂定量，而对于不同培养时期微藻油脂的跟踪测定也较为重要。传统的微藻油脂含量测定方法为有机溶剂提取法，即称取一定量干藻粉样品，使用醚类、正己烷或氯仿等有机溶剂进行回流提取，收集提取液待溶剂挥干后烘至恒重，根据最后所获得的油脂干重及藻粉质量计算油脂含量。该方法所需的样品多(一般为干藻粉2～5g)、有机溶剂消耗量大且操作步骤繁琐、所需时间冗长，易因外界因素干扰而产生误差，因此不利于系统操作。新兴的荧光分光光度法是使用荧光染料尼罗红配制成一定浓度的染液，并将该染液直接加入已知浓度的微藻藻液中，黑暗条件下孵育5～10min后测定其荧光强度(荧光条件：激发光波长480nm，发射光波长570～590nm)，再依据标准曲线公式及样品藻液染色的荧光强度计算油脂含量。该方法大大减少了样品消耗量与测定时间，简便易行，但昂贵的荧光染料及检测设备限制了该方法在生产中的应用，加之需要毒性较强的二甲基亚砜(dmso)或丙酮作为染色液溶剂，不利于实际操作。因此，寻找样品消耗量低、操作快捷安全、成本低廉的油脂含量测定方法具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的主要目的在于提供一种微量、快速测定藻油含量的方法。
为实现上述目的，本发明提供的一种微量、快速测定藻油含量的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取进行微藻培养的藻液，计算藻液中微藻细胞的数量浓度c，c的单位为cell/ml；
(2)称取0.5-1.0g经脱盐分的湿藻样，加入50-100ml蒸馏水，充分混合均匀，然后稀释成1/2、1/3、1/4、1/5、1/10的5个不同藻浓度的藻溶液；
(3)称取0.4-0.8g荧光染色亲脂性荧光染料粉末，溶于中有机溶剂中，室温下放置4-6天，期间经常摇动，让其充分溶解后过滤，配制成母液；
(4)上述每个藻浓度分别取2支试管，各加入5-10ml藻液和5-10ml1mol/l的hcl，充分混合后，每个藻浓度一支管加入0.1ul母液，另一支管加入步骤(3)中的有机溶剂，作为对照管，充分混匀；
(5)使用激发波长400-600nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录单细胞油脂积累变化情况；
(6)根据照片记录单细胞油滴颗粒数目，并测定油滴直径，按照球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和；
(7)根据微藻细胞的数量浓度c和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：vt＝cv，c为微藻细胞的数量浓度，v为单细胞油脂体积，vt为单位体积油脂含量。
优选地，所述步骤(2)之前还包括：：
(11)重复稀释溶剂洗涤、去除微藻细胞的盐分、离心数次后，藻液离心浓缩。
优选地，步骤(11)中的稀释溶剂为蒸馏水、自来水、去离子水、超净水或矿泉水。
优选地，所述荧光染色亲脂性荧光染料为苏丹三、苏丹iv或者苏丹黑b，所述有机溶剂为100-200ml70％乙醇。
优选地，所述步骤(5)具体为：微藻细胞染色后在507nm激发波长下，使用激光扫描共聚焦显微镜每隔0.01-0.5μm对微藻细胞断层扫描并拍照记录，后经3d图像合成软件重建油滴3d图片，采用显微镜照相软件测定油滴颗粒直径。
本发明微量、快速测定藻油含量的方法包括(1)取进行微藻培养的藻液，计算藻液中微藻细胞的数量浓度c，c的单位为cell/ml；(2)称取0.5-1.0g经脱盐分的湿藻样，加入50-100ml蒸馏水，充分混合均匀，然后稀释成1/2、1/3、1/4、1/5、1/10的5个不同藻浓度的藻溶液；(3)称取0.4-0.8g克荧光染色亲脂性荧光染料粉末，溶于中有机溶剂中，室温下放置4-6天，期间经常摇动，让其充分溶解后过滤，配制成母液；(4)上述每个藻浓度分别取2支试管，各加入5-10ml藻液和5-10ml1mol/l的hcl，充分混合后，每个藻浓度一支管加入0.1ul母液，另一支管加入步骤(3)中的有机溶剂，作为对照管，充分混匀；(5)使用激发波长400-600nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录单细胞油脂积累变化情况；(6)根据照片记录单细胞油滴颗粒数目，并测定油滴直径，按照球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和；(7)根据微藻细胞的数量浓度c和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：vt＝cv，c为微藻细胞的数量浓度，v为单细胞油脂体积，vt为单位体积油脂含量。
1.检测快速简单。本发明将微藻培养与检测方法融为一体，过程简单方便，即通过活体检测测定微藻油脂含量。需要时间较常规方法明显减少，单个样品检测只需要2分钟。
v＝πd13/6+πd23/6+…πdn3/6
2.可以近似定量检测单位体积油脂的含量。荧光显微镜观察并测定油滴数目(n)和油滴直径(d)后，采用计算单个微藻的油滴体积，从而通过生长曲线计算单位培养液中油脂的总量。
3.成本低。检测过程不需要高端的仪器设备和耗材，因此较常规方法成本低廉。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例：
(1)取进行微藻培养的藻液，计算藻液中微藻细胞的数量浓度c，c的单位为cell/ml；
(11)重复稀释溶剂洗涤、去除微藻细胞的盐分、离心数次后，藻液离心浓缩；其中，所述稀释溶剂为蒸馏水、自来水、去离子水、超净水或矿泉水
(2)称取0.5-1.0g经脱盐分的湿藻样，加入50-100ml蒸馏水，充分混合均匀，然后稀释成1/2、1/3、1/4、1/5、1/10的5个不同藻浓度的藻溶液；
(3)称取0.4-0.8g克荧光染色亲脂性荧光染料粉末苏丹三，溶于100-200ml70％乙醇中，室温下放置4-6天，期间经常摇动，让其充分溶解后过滤，配制成母液；
(4)上述每个藻浓度分别取2支试管，各加入5-10ml藻液和5-10ml1mol/l的hcl，充分混合后，每个藻浓度一支管加入0.1ul母液，另一支管加入步骤(3)中的有机溶剂，作为对照管，充分混匀；
(5)使用激发波长400-600nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录单细胞油脂积累变化情况；
(6)根据照片记录单细胞油滴颗粒数目，并测定油滴直径，按照球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和；
(7)根据微藻细胞的数量浓度c和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：vt＝cv，c为微藻细胞的数量浓度，v为单细胞油脂体积，vt为单位体积油脂含量。
具体实验方法：
1、实验设计在上述培养条件下，取对数生长期藻种作为实验材料接种至上述培养液中，初始接种密度为2.375±0.916(×104cell/ml)。设置3个平行样，测定扁藻生长曲线和油脂积累情况。
2、生长测定每隔2d从各实验组中取1ml藻液，加1～2滴鲁哥氏液固定藻细胞，以血球计数板在显微镜下计数藻细胞。每个样品计数3次，3次的计数结果相比较标准偏差不超过20％，否则要进行第4次计数。
3、光染色亲脂性荧光染料苏丹三溶解于有机溶剂100-200ml70％乙醇中，配制10mm/l的母液。使用时，取0.1μl母液注入1ml藻液中染色1min左右。使用荧光显微镜(nikoneclipse80i)在507nm下随机选取6个视野观察并拍照记录细胞内油脂颗粒分布情况。
v＝πd13/6+πd23/6+…πdn3/6
4、油脂含量测定藻细胞染色后在507nm激发波长下，使用激光扫描共聚焦显微镜(nikoneclipsete2000-u)每隔0.5μm对藻细胞断层扫描并拍照记录，后经尼康ez-c1软件处理系统，重建油滴3d图片表明油滴近似正球体。采用尼康nis-elementsbr软件测定油滴颗粒直径，根据球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和：(其中d为油滴直径，n为单细胞油滴数)。根据扁藻生长曲线和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：vt＝cv(c为扁藻细胞浓度，v为单细胞油脂体积，vt单位体积油脂含量)。
4)数据方法实验所有数据均表示为平均值±标准差(mean±sd)，采用spss17.0统计软件进行单因子方差分析(one-wayanova)和组间多重比较分析(lsdanova)，p＜0.05为差异显著水平。
其中，本实施例中的所述的微藻包括裂殖壶藻、等鞭金藻、寇式隐甲藻、微绿球藻、绿色巴夫藻、布朗葡萄藻、三角褐指藻、菱形藻、小球藻、栅藻或者杜氏藻。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。