本发明属于农业技术领域，具体地说，涉及一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法。
背景技术
随着人民生活水平的不断提高，对作物产品品质的要求愈来愈高，而农产品的品质与外界环境因素有直接的关系，如温度、光照、养分、水分和土壤等因素，肥料是现代农业生产中养分的主要供给源，直接参与协调营养代谢与循环，必然极大地制约着作物的产量与品质。近年来，氮肥对玉米籽粒蛋白的研究较多，这些研究大多是籽粒蛋白含量变化和相对短期的实验结果，并没有更深入的研究且对土壤肥力、肥力等没有延续性。玉米种子清蛋白是玉米4种主要蛋白质成分之一，遗传背景不同的玉米材料，通过电泳分析，将显示出不同的蛋白谱带，谱带的差异在一定程度上反映出基因型的差异，分析同一杂交种或自交系不同子粒的清蛋白谱带，可以看出个体间是否存在遗传上的分歧，从而便检验了纯度。利用蛋白质电泳技术鉴定玉米种子纯度的研究已有报道。但在长期定位施肥条件下的夏玉米籽粒清蛋白的蛋白组学研究尚属空白。
技术实现要素：
为了弥补现有技术中的空白，本发明提出了一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，基于非石灰性潮土33年的长期定位施肥试验，研究长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白的影响，为科学施用氮肥和品质遗传改良提供科学依据。
其技术方案如下：
一种长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白影响的试验方法，包括以下步骤：
步骤1、试验设计
供试土壤为非石灰性潮土，发育于冲积母质，表土质地轻壤，有机质含量为4.10g/kg，全氮量为0.50g/kg，全磷量为0.46g/kg，土壤有效磷为15mg/kg，土壤速效钾为38mg/kg，土壤阳离子代换量为11.80cmol/kg。试验共设3个处理：对照组、低氮、高氮，每个处理设3次重复；试验地实行冬小麦—夏玉米轮作制，每年两作，夏玉米品种为鲁玉16，高量氮肥年施用量为276kg/hm2，低量氮肥年施用量为138kg/hm2。
步骤2、测定项目与方法
2.1籽粒清蛋白的提取及测定
取0.5g样品加入2ml水，研磨至匀浆，再加入3ml水转移至离心管中，用3ml水冲洗研钵并振荡5min，4500r/min离心8min，倒出上清液，加水8ml，搅拌，振荡5min，离心，合并上清液，共4次，用水定容至50ml。分别吸取各样液1ml，加入考马斯亮蓝5ml，混匀，放置2min，595nm比色。
2.2籽粒清蛋白的sds-page
电泳装置为dyzc-24b型电泳仪，板胶厚1mm。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。将200μg样品加入点样孔。开始时电压为100v，待溴酚兰完全进入浓缩胶界面后，换成120v恒压电泳至结束。电泳后，用考马斯亮蓝染色，并脱色，扫描成像。
2.3籽粒清蛋白的纯化与定量
取上述清蛋白提取液用丙酮沉淀，12000r/min离心1h，用裂解液溶解。用2-dclean-upkit纯化蛋白试剂盒纯化蛋白后，用水化液溶解蛋白。采用bradford法定量，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
2.4籽粒清蛋白的2-de
取含200μg蛋白质的上述蛋白质提取液，用上样水化缓冲液补充体积到450μl后，将24cm、ph4～7的固相ph梯度线性胶条覆盖于该蛋白溶液上方，被动水化17h，然后进行等电聚焦：20℃，100v，1h；300v，1h；500v，1h；1000v，2h；8000v，3h；8000v，10h；聚焦结束后，分别用含1％dtt和2.5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液平衡胶条各15min。平衡完毕后，将胶条紧贴在12％的聚丙烯酰胺凝胶上方，进行第二向电泳。电泳结束后采用改进的银染方法对凝胶进行染色，然后用umaxpowerlook2100xl扫描仪扫描图像，所获图像用imagemasterplatinum6分析软件进行分析，实验重复3次。通过分析，选取具有代表性的差异蛋白点送至深圳华大基因科技服务有限公司进行质谱鉴定。
步骤3、数据处理
用dps9.50对数据进行统计分析，microsoftword2003绘制表格。
进一步，步骤2.3中，所述的裂解液为：7mol/l尿素,2mol/l硫脲，4％chaps，40mmol/ldtt，0.2％(w/v)ipg-bufffer，ph4～7。
进一步，步骤2.3中，所述的水化液为：8mol/l尿素，2％chaps，20mmol/ldtt，0.5％ipg-bufffer，ph4～7。
进一步，步骤2.4中，所述的上样水化缓冲液为水化液+0.002％溴酚蓝+0.012％destreakreagent。
进一步，步骤2.4中，所述的2.5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液为6mol/l尿素，2％sds，0.075mol/ltris-hclph8.8，30％甘油，0.002％溴酚蓝。
进一步，步骤2.4中，进行第二向电泳时，每根胶条3w，进行时间为24～27h。
本发明的有益效果为：
本发明的试验结果表明，对照组的清蛋白含量高于两处理组且在定量单向sds-page中可以看出有明显的差异条带。双向电泳结果显示，长期低氮处理与对照组相比共有7个差异蛋白点，1个上调，6个下调；长期高氮处理与对照组相比共有6个差异蛋白点，1个上调，5个下调。通过质谱鉴定并对其进行功能分类，分别为蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白、能量代谢相关蛋白、表达调控及防御抗逆相关的蛋白、细胞代谢相关的蛋白及功能未知蛋白。
附图说明
图1是不同处理玉米籽粒清蛋白的单向sds-page图谱；
图2是长期定位施肥对夏玉米籽粒清蛋白的影响，其中，图2a：长期定位施肥对照组清蛋白的双向电泳图；图2b：长期定位低氮施肥清蛋白的双向电泳图；图2c：长期定位高氮施肥清蛋白的双向电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1试验设计
试验设在青岛农业大学莱阳试验站，始于1978年。供试土壤为非石灰性潮土，发育于冲积母质，表土质地轻壤，有机质含量为4.10g/kg，全氮量为0.50g/kg，全磷(p2o5)量为0.46g/kg，土壤有效磷(p2o5)为15mg/kg，土壤速效钾(k2o)为38mg/kg，土壤阳离子代换量为11.80cmol/kg。试验共设3个处理(对照组、低氮、高氮)，每个处理设3次重复。试验地实行冬小麦—夏玉米轮作制，每年两作，夏玉米品种为鲁玉16。高量氮肥年施用量为276kg/hm2，低量氮肥年施用量为138kg/hm2。
1.2测定项目与方法
1.2.1籽粒清蛋白的提取及测定
取0.5g样品加入2ml水，研磨至匀浆，再加入3ml水转移至离心管中，用3ml水冲洗研钵并振荡5min，4500r/min离心8min，倒出上清液，加水8ml，搅拌，振荡5min，离心，合并上清液，共4次，用水定容至50ml。分别吸取各样液1ml，加入考马斯亮蓝5ml，混匀，放置2min，595nm比色。
1.2.2籽粒清蛋白的sds-page
电泳装置为dyzc-24b型电泳仪(北京市六一仪器厂)，板胶厚1mm。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。将200μg样品加入点样孔。开始时电压为100v，待溴酚兰完全进入浓缩胶界面后，换成120v恒压电泳至结束。电泳后，用考马斯亮蓝染色，并脱色，扫描成像。
1.2.3籽粒清蛋白的纯化与定量
取上述清蛋白提取液用丙酮沉淀，12000r/min离心1h，用裂解液(7mol/l尿素,2mol/l硫脲，4％chaps，40mmol/ldtt，0.2％(w/v)ipg-bufffer，ph4～7)溶解。用2-dclean-upkit纯化蛋白试剂盒纯化蛋白后，用水化液(8mol/l尿素，2％chaps，20mmol/ldtt，0.5％ipg-bufffer，ph4～7)溶解蛋白。采用bradford法定量，以牛血清白蛋白为标准蛋白。
1.2.4籽粒清蛋白的2-de
取含200μg蛋白质的上述蛋白质提取液，用上样水化缓冲液(水化液+0.002％溴酚蓝+0.012％destreakreagent)补充体积到450μl后，将24cm、ph4～7的固相ph梯度线性胶条覆盖于该蛋白溶液上方，被动水化17h，然后进行等电聚焦(20℃，100v，1h；300v，1h；500v，1h；1000v，2h；8000v，3h；8000，10h)。聚焦结束后，分别用含1％dtt和2.5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液(6mol/l尿素，2％sds，0.075mol/ltris-hclph8.8，30％甘油，0.002％溴酚蓝)平衡胶条各15min。平衡完毕后，将胶条紧贴在12％的聚丙烯酰胺凝胶上方，进行第二向电泳(每根胶条3w，24～27h)。电泳结束后采用改进的银染方法对凝胶进行染色，然后用umaxpowerlook2100xl扫描仪扫描图像，所获图像用imagemasterplatinum6分析软件进行分析，实验重复3次。通过分析，选取具有代表性的差异蛋白点送至深圳华大基因科技服务有限公司进行质谱鉴定。
1.3数据处理
用dps9.50对数据进行统计分析，microsoftword2003绘制表格。
2结果与分析
2.1长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白含量的影响
表1长期施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白含量的影响
注：同列不同字母表示达差异显著性水平
从表1可以看出，长期高低氮施肥处理，玉米籽粒清蛋白含量存在差异性。对照和高氮处理不存在显著差异，低氮处理和对照、高氮处理存在显著差异。
2.2玉米籽粒清蛋白的单向sds-page分析
不同处理籽粒清蛋白进行定量单向电泳图，如图1。可以看出高低氮处理与对照组相比明显有表达差异的蛋白质谱带，所以进一步进行双向电泳的检测，检测其差异的蛋白质点。
2.3玉米籽粒清蛋白的蛋白组学分析
如图2所示，长期低氮处理的玉米籽粒清蛋白与对照组相比共有7个差异蛋白点，其中1个点表达量上调，6个点表达量下调；长期高氮处理的籽粒清蛋白与对照组相比共有6个差异蛋白点，其中1个点表达量上调，5个点表达量下调。高氮处理与低氮处理的差异蛋白点中有3个是相同点，所以共有10个差异蛋白点。
对上述的10个差异蛋白点72、102、110、115、123、133、177、213、218和232进行质谱检测，10个点的检测结果全部为阳性，分别是60s酸性核糖体蛋白p3、一般应激的39链脱氢蛋白/还原酶sdr家族蛋白、果胶酯酶抑制剂结构域蛋白前体、rab28蛋白、半胱氨酸合酶亚型3、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、加氧酶2、乙二醛酶i、胚胎发育晚期丰富蛋白d-34和一个假设蛋白。详细信息如表2所示。
2.4差异蛋白的功能分类
通过对鉴定的蛋白质进行功能分类，探讨籽粒在长期定位不同氮肥处理下的蛋白变化。根据蛋白质的功能可以将鉴定到的10个蛋白点分成五大类：与蛋白质及氨基酸代谢相关的蛋白3个：213、218、72；与能量代谢相关的1个：102；表达调控及防御抗逆相关的蛋白3个：115、132、133；细胞代谢相关的蛋白：110；功能未知蛋白2个：232、177。
表2长期定位施肥玉米籽粒清蛋白差异点的质谱鉴定结果
3讨论
3.1长期定位施用高低氮肥对玉米籽粒清蛋白的影响
硝态氮是土壤中矿质态氮素的重要组成成分，无论是有机态氮，还是铵态氮，在一定条件下均有可能转化为硝态氮。长期定位施高低氮肥的土壤中的硝态氮明显高于对照组，主要是施肥不合理，作物产量低，养分利用率低的缘故。由表1可以看出长期定位施用高低氮肥导致玉米籽粒清蛋白含量下降。
3.2差异表达蛋白质的功能分析
3.2.1蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白
真核生物的核糖体为80s，包括60s和40s两个大小亚基，含有4种rna分子和80多种不同的蛋白质。有研究认为，许多核糖体蛋白具有结构上的功能，但同时又是翻译过程中必不可少的因子。60s酸性核糖体蛋白既能参与蛋白质的生物合成，又具有调控植物发育的功能。本试验鉴定的60s酸性核糖体蛋白p3(点213)在长期低氮处理条件下表达下降，而对照组和高氮处理没有差异，与清蛋白含量差异性一致。长期定位施高低氮肥的土壤中的硝态氨明显高于对照组，主要是施肥不合理，作物产量低，养分利用率低的缘故。由此说明可能是氮素过高抑制了这种蛋白的表达。
果胶酯酶或称果胶甲酯酶，是一种重要的果胶酶，普遍存在于高等植物的不同组织器官，如根、茎、叶、果实等。其对细胞壁组成和降解，种子萌发、根尖延伸、种子开裂、果实软化成熟、抗病等方面具有重要作用。果胶酯酶抑制剂是一种对果胶甲酯酶有抑制作用的蛋白，其对果胶甲酯酶的活性具有一点调控作用。果胶酯酶抑制剂结构域蛋白前体(点218)构成果胶酯酶抑制剂，在籽粒形成过程中起到一定的调控作用。在高低氮处理下，有效地抑制其表达，有可能使细胞壁增厚。
半胱氨酸合酶是半胱氨酸到谷胱甘肽合成途径的一个关键酶，它可能改变细胞内的谷胱甘肽库，以抵抗逆境下的氧化胁迫。研究表明半胱氨酸合酶基因明显得编码半胱氨酸合酶的异构体，并且受硫、氮及光照条件协调的控制。半胱氨酸合酶亚型3(点72)构成半胱氨酸合酶。实验表明长期定位低氮处理与对照组没有差异，而高氮处理表达量下降，可能是氮素过高抑制了半胱氨酸合酶的表达。3.2.2能量代谢相关蛋白
短链脱氢/还原酶(short-chaindehydrogenase/reductase，sdr)是一个非常大的蛋白家族。现在sdr蛋白家族基因超过10，000条序列。sdr蛋白家族包括许多不同的氧化还原酶、异构酶和裂解酶等，这些酶催化多种底物，包括类固醇、维生素a、前列腺素、糖类化合物、醇类化合物以及其它许多的小分子化合物。点102为一般应激的39链脱氢蛋白，可能是由于长期施用氮肥导致土壤氮磷钾含量不平衡，氮素过高导致的应激蛋白含量下降。
3.2.3表达调控及防御抗逆相关蛋白
rab28蛋白(点115)是rab蛋白家族的成员，在植物学中研究较多。它在种子胚芽和成熟植物体的分生组织中表达，定位于细胞核上，调控脱落酸(absciscacid)的表达。籽粒中脱落酸含量的变化与籽粒灌浆速率的变化相一致，脱落酸含量与籽粒灌浆速率呈极显著正相关。长期定位施肥使土壤内氮素含量很高，脱落酸含量降低，rab28含量下降。
点132为谷胱甘肽s-转移酶(gst)：参与有毒物质的解除。长期定位高氮处理使谷胱甘肽s-转移酶的降低速度明显低于低氮处理，实验表明低氮处理条件下，谷胱甘肽s-转移酶的含量下降。
胚胎发育晚期丰富蛋白d-34(点133)是植物胚胎发生后期种子中大量积累的一类蛋白质。lea蛋白可受外源脱落酸、干早、渗透和低温胁迫诱导产生，长期氮肥处理导致细胞内的脱落酸含量下降，从而表达量降低。
3.2.4细胞代谢相关蛋白
乙二醛酶i(点110)是一种胞内酶，普遍存在于各种细胞中，尤其是线粒体中，它的活性贯穿整个生命的始终。生物体内对甲基乙二醛酶的代谢主要是在乙二醛酶i的作用下将甲基乙二醛(mg)和谷胱甘肽(gsh)缩合成生成s-d-乳酸谷胱甘肽，降低mg的生理活性浓度，接着在gloii的作用下将s-d乳酸谷胱甘肽水解成无毒的gsh和d-乳酸。细胞内积累太多的mg会抑制细胞分裂，它会和rna、dna和蛋白质发生反应产生很多负效应。高等植物在快速分裂的细胞、幼苗和根尖积累大量的乙二醛酶i，并表现出极强的活性。光照、胞生长的刺激物如生长素类物质能增强乙二醛酶i的活性。氮素过高导致生物体内生长素含量上升，增强乙二醛酶i的活性，从而降低了生物体乙二醛的浓度。生物体内乙二醛的含量变化不大，所以长期定位施肥导致氮素过高乙二醛酶i含量下降。
3.2.5其他蛋白
1,2-dihydroxy-3-keto-5-methylthiopentenedioxygenase2(点177)是一种加氧酶，其功能未知。
假定蛋白(点232)是一类已经证明存在于生物体内，但是其结构和功能均未知的蛋白质。玉米中假想蛋白很多，目前不知道其是否与长期定位施用氮肥有关。
总之，蛋白质及氨基酸代谢相关蛋白，能量代谢相关蛋白，表达调控及防御抗逆相关的蛋白，细胞代谢相关的蛋白等蛋白在玉米籽粒灌浆期相互协调、共同作用，充分体现了长期施用氮肥对玉米籽粒清蛋白的影响。相信本实验从蛋白水平对玉米施肥机理和品质遗传改良的研究提供新的思路和启示。
3.3从本质上讲，品种鉴定就是基因型鉴定。蛋白质是结构基因表达的初级产物，可以看作是结构基因的标记，分析品种间关系，就要分析鉴定那些有多种分子形式的蛋白质，如果蛋白质有足够的多态性，分析方法又能够检测这种多态性，那么鉴定蛋白质的多态性也就了解了作物品种的遗传组成，从而也就是鉴定了品种。本实验结果表明长期定位施用高低氮肥并没有存在遗传上的分歧，只是改变了鲁玉16玉米籽粒蛋白的含量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。