本发明涉及液相色谱串联质谱同时检测血清24,25(oh)2d和25ohd的方法。
背景技术：
维生素d不仅在维持骨骼健康中具有重要作用，同时与肾脏疾病、肿瘤、心血管疾病等密切相关，经外源性补充或阳光照射皮肤中7-脱氢胆固醇合成的维生素d经血液循环进入肝脏，在25-羟化酶cyp2r1的作用下转化为单羟维生素d：25ohd(25ohd2和25ohd3)，继而在肾脏1α羟化酶cyp27b1的作用下代谢为具有生物学活性的1,25(oh)2d。25ohd也可被肾脏中24羟化酶cyp24a1(cyp24a1(细胞色素p450家族成员24a1)催化生成24,25(oh)2d(24,25(oh)2d2和24,25(oh)2d3)，cyp24a1也可使过量的活性1,25(oh)2d失活，经进一步代谢后随胆汁排出体外。
25ohd作为评价维生素d的营养指标方法已经比较成熟。而24,25(oh)2d一方面可以用来作为预测cyp24a1突变引发的特发性高钙血症，另一方面研究认为测定24,25(oh)2d可以更好的预测维生素d补充效果。然而对24,25(oh)2d目前尚无免疫学方法可以检测，国外有报道使用液相色谱串联质谱进行测定，但是需要使用衍生化法(mamorusatoh,etal.developmentandvalidationofthesimultaneousmeasurementoffourvitamindmetabolitesinserumbylc–ms/msforclinicallaboratoryapplications.analbioanalchem(2016)408:7617–7627)，操作复杂费时，个别未借助于衍生化手段的方法样本用量大(至少2ml血清)，或者未能够对24,25(oh)2d3和24,25(oh)2d2进行同时测定。在我国，临床经常会有使用维生素d2进行补充的患者，因此两者同时测定才能保证24,25(oh)2d检测结果的准确性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供样本用量少、前处理方法简单、基于液相色谱串联质谱法同时测定24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3的快速检测方法，同时可区分3-epi24,25(oh)2d3和3-epi25(oh)d3的干扰。
本发明构思如下：根据液相色谱串联质谱的检测特异性设计，结合维生素d的分子量，其在质谱中产生特异的质量/电荷比(质荷比)以及在色谱中的极性进行监测和分离。首先通过样本制备液沉淀蛋白、提取血清24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3，之后将提取后的样本通过色谱仪取样进入色谱质谱系统，通过色谱柱的初步分离(本步是分离3-epi24,25(oh)2d3和3-epi25(oh)d3的关键)；进入质谱中，再根据质谱中产生不同的质荷比检测24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3(此处选择不同的特异性质荷比对各成分进行区分及监测是关键)。采用稳定同位素标记的24,25(oh)2d3-d6作为24,25(oh)2d3和24,25(oh)2d2的内标；25ohd2-d3，25ohd3-d3分别作为25ohd2和25ohd3的内标。通过制备一系列不同浓度的标准品，制作标准曲线，以标准溶液浓度为x轴，标准和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析。将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算血清样品中各待测成分的浓度。样本检测信号强度与同位素内标的比值与样本中待测成分的浓度呈正比。
为了实现本发明目的，本发明提供一种液相色谱串联质谱同时检测血清24,25(oh)2d和25ohd的方法，包括以下步骤：
1)向待测血清样品或标准品溶液中加入稳定同位素内标进行样品的制备；
2)用液相色谱法分离样品，以去除干扰物质3-epi24,25(oh)2d3和3-epi25(oh)d3；
3)分离得到的样本进行质谱分析，分别获得24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3以及它们的同位素内标的检测信号；
4)以标准品溶液的浓度作为横坐标，以标准品溶液信号强度与内标信号强度的比值作为纵坐标，分别绘制24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3的标准曲线；
5)分别检测待测样本中24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3的信号强度，将其与内标信号强度的比值分别代入上述标准曲线进行计算，得到待测样本中各检测目标的浓度，实现对血清中24,25(oh)2d和25ohd的定量检测。
前述的方法，步骤1)具体为：取50～200ul待测血清样品或标准品溶液至5ml玻璃管，加入10-100ul稳定同位素内标溶液，混合震荡，依次加入100-500ul甲醇或乙腈、500ul0.05-0.5m硫酸锌溶液；再加入1ml按体积比1-8:1混合的正己烷-乙酸乙酯混合液，混合震荡，取上清液800ul，氮气吹干，加入80-200ul复溶液复溶后等待上机测试。
本发明中，复溶液为甲醇-水按1-10:1(优选8:1)体积比混合的混合液。
优选地，步骤1)具体为：取100ul待测血清样品或标准品溶液至5ml玻璃管，加入50ul稳定同位素内标溶液，混合震荡，依次加入200ul甲醇或乙腈、500ul0.1m硫酸锌溶液；再加入1ml按等体积比混合的正己烷-乙酸乙酯混合液，混合震荡，取上清液800ul，氮气吹干，加入100ul复溶液复溶后等待上机测试；其中，所述复溶液为甲醇-水按8:1体积比混合的混合液。
可选地，通过spe柱制备血清样品，先用甲醇、水活化spe柱，然后加入预先添加有稳定同位素内标的待测血清样品或标准品溶液，用有机溶剂洗脱，收集洗脱液，直接上机检测，或者用氮气吹干，再用复溶液复溶后等待上机检测。其中，所述有机溶剂包括但不限于甲醇、乙腈。
本发明中，甲醇为色谱级纯甲醇溶液。正己烷为色谱级纯正己烷溶液。乙酸乙酯为色谱级纯乙酸乙酯溶液。
前述的方法，步骤2)中所用液相色谱柱可选ascentisexpressf5柱(2.1mm×100mm，2.7μm)。以含有0.01％-0.5％甲酸的甲醇溶液为流动相a、含有0.01％-0.5％甲酸的水溶液为流动相b，采用梯度洗脱：0-0.2min25％a，0.2-1.0min72％a，1.0-3.8min，72％a，3.8-3.9min80％a，3.9-6.5min80％a，6.5-7.0min95％a，7.0-7.5min25％a，流速0.3ml/min，柱温为25℃，进样量20μl。
前述的方法，步骤3)中所述24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3在质谱中所产生的检测信号的母离子分别具有417.3、429.3、413.4、401.4的质荷比；24,25(oh)2d3的子离子包含质荷比为381.3、159.1的子离子，24,25(oh)2d2的子离子包含质荷比为393.4、271.2的子离子，25ohd2的子离子包含质荷比为395.5、355.4的子离子，25ohd3的子离子包含质荷比为365.4、383.4的子离子。
本领域技术人员应理解，基于被测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正负离子模式的选择等，来选择合适的电离方法。可使用多种方法产生离子，包括但不限于，电子电离、快速原子轰击、场脱附和基质辅助激光解吸电离(maldi)、表面增强激光解吸电离(seldi)、光子电离、大气压化学电离(apci)、电喷雾电离(esi)等。
本发明中，优选电喷雾电离方法。更优选地，电喷雾电离法中，采用多离子反应检测模式，离子源温度300-600℃。
前述的方法，步骤1)中所述稳定同位素内标溶液中含有1-10ng/ml24,25(oh)2d3-d6内标(24,25(oh)2d2&3内标)、10-100ng/ml25ohd2-d3内标(25ohd2内标)和10-100ng/ml25ohd3-d3内标(25ohd3内标)。优选地，所述稳定同位素内标溶液中含有5ng/ml24,25(oh)2d3-d6内标、40ng/ml25ohd2-d3内标和50ng/ml25ohd3-d3内标。
前述的方法，步骤3)中所述内标24,25(oh)2d3-d6、内标25ohd2-d3、内标25ohd3-d3的母离子质荷比分别为423.3、416.3、404.3。内标24,25(oh)2d3-d6的子离子质荷比为387.3，内标25ohd2-d3的子离子质荷比为358.3，内标25ohd3-d3的子离子包含质荷比为368.3。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明使用较少样本量(200ul血清)、基于液相色谱串联质谱方法同时测定24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3的快速检测方法，同时可区分3-epi24,25(oh)2d3和3-epi25(oh)d3的干扰，对各组分的测定更加准确。
(一)本方法样品前处理简单，无需衍生、血清用量较少。
(二)本方法可精确地定量样品中0.5-40ng/ml含量水平存在的24,25(oh)2d3、0.5-40ng/ml含量水平存在的24,25(oh)2d2、1.25-200ng/ml含量水平存在的25ohd2以及1.25-200ng/ml含量水平存在的25ohd3。对24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3的检测限分别可达0.125ng/ml,0.25ng/ml,0.25ng/ml,0.25ng/ml。
(三)该方法可为临床补充维生素d疗效进行准确监测，同时可应用于cyp24a1突变患者的筛查。
附图说明
图1为本发明实施例3中25ohd3。对24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3的质谱检测结果。
图2为本发明实施例3中干扰物质3-epi24,25(oh)2d3和3epi25ohd3的分离结果。
图3a-图3d分别为本发明实施例3中绘制的25ohd3，25ohd2，24,25oh2d3，24,25oh2d2标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1样品制备
取200ul血清样本或校准品至5ml玻璃管，加入50ul同位素内标溶液，混合震荡，依次加入200ul甲醇、500ul0.1m硫酸锌溶液；再加入1ml按等体积比混合的正己烷-乙酸乙酯混合液，混合震荡，取上清液800ul，氮气吹干，加入100ul复溶液(甲醇-水体积比8:1)复溶后等待上机测试。
所述同位素内标溶液中含有5ng/ml24,25(oh)2d3-d6内标、40ng/ml25ohd2-d3内标和50ng/ml25ohd3-d3内标。
实施例2色谱分离
本实施例中所用液相色谱柱为ascentisexpressf5柱(2.1mm×100mm，2.7μm)。以含有0.01％-0.5％甲酸的甲醇溶液为流动相a、含有0.01％-0.5％甲酸的水溶液为流动相b，采用梯度洗脱：0-0.2min25％a，0.2-1.0min72％a，1.0-3.8min，72％a，3.8-3.9min80％a，3.9-6.5min80％a，6.5-7.0min95％a，7.0-7.5min25％a，流速0.3ml/min，柱温为25℃，进样量20μl。hplc主要为了去除干扰物质3-epi24,25(oh)2d3和3-epi25(oh)d3对靶标物24,25(oh)2d3、24,25(oh)2d2、25ohd2、25ohd3质谱检测的影响。
实施例3串联质谱分析
本实施例中通过三重四级杆质谱系统(absciex4000qtrap)来完成检测。
质谱选择多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度300-600℃，本方法选择为550℃，gs1：选择为45(可选30-80)，gs2：选择为60(可选30-80),具体监测的离子对以及碰撞能量(ce)、去簇电压(dp)等见表1(dp，ep，ce，cxp不固定，根据仪器进行调整)。
表1质谱参数
检测得到的典型谱图见图1。本方法可以完全分离3-epi24,25(oh)2d3和3epi25ohd3(图2)。
以标准品溶液的浓度作为横坐标，以标准品溶液信号强度与内标信号强度的比值作为纵坐标，制作标准曲线；得到各自的标准曲线，25ohd3，25ohd2，24,25oh2d3，24,25oh2d2线性方程相关系数均大于0.999(图3a-图3d)。
检测待测样本的信号强度，将其与内标信号强度的比值代入上述标准曲线进行计算，得到待测样本中检测目标的浓度，实现对血清中24,25(oh)2d和25ohd的定量检测。
实施例4回收率、准确性及精密度考察
本方法回收率为91.2％～105.0％，与预期结果偏差均在10％以内(表2)。
表2本方法的回收率和准确性
本方法的精密度均在10％以内(表3)。
表3本方法精密度评价
实施例5灵敏度考察
以信噪比(signaltonoise，s/n)为10、十次测定变异(cv)小于20％为各待测物的定量限(limitofquantification，loq)，24,25(oh)2d2、24,25(oh)2d3、25ohd2,和25ohd3的loq分别为0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml和0.25ng/ml。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。