本发明属于多组分生化药物技术分析领域，具体涉及一种转移因子胶囊的总氨基酸定量检测方法。
背景技术：
转移因子(transterfactor，简称tf)又称传输因子，是一种天然双向免疫调节剂，是目前治疗免疫功能低下、缺陷等相关疾病的理想药物。转移因子属于多肽类物质，是由多核苷酸、多肽及其他成分组成的复合分子。其中小分子肽类物质是转移因子的功能标示物，并作为其主要功效成分。而氨基酸是组成多肽的基本单元，是转移因子的关键质量指标。因此，准确测定转移因子中的总氨基酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。但现有技术仅检测转移因子中游离氨基酸含量，并不能检测到组成多肽类物质的键合氨基酸；且由于转移因子组分复杂，采用现有的检测技术检测存在相邻组分峰间有较大程度重叠的情况，导致检测结果出现较大偏差。同时，现有技术采用外标法进行定量检测，需要18种氨基酸对照品，检测成本较高，操作繁琐。技术实现要素：为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种转移因子胶囊的总氨基酸定量检测方法，该方法操作简单，检测成本较低，能够实现对转移因子胶囊中总氨基酸进行准确定量分析，从而实现对转移因子胶囊的生产实施有效的监督控制。本发明是通过以下技术方案来实现：本发明公开的一种转移因子胶囊的总氨基酸定量检测方法，包括以下步骤：1)制备总氨基酸测定衍生用供试品溶液精密称取转移因子胶囊内容物0.9～1.2g，加入0.1mol/l盐酸溶液使转移因子被充分溶解，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜过滤，然后精密量取续滤液2.0ml，置于反应容器中，加入浓盐酸溶液6ml，充氮封口，于110℃条件下水解24h后，冷却，制得转移因子酸水解液，将转移因子酸水解液启封、水浴蒸发至干，加入0.1mol/l盐酸溶液10ml溶解残留物，制得总氨基酸测定衍生用供试品溶液；2)制备总氨基酸含量测定供试品溶液精密量取总氨基酸测定衍生用供试品溶液4.0ml、0.1mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0ml和1mol/l三乙胺乙腈溶液1.0ml，混合后摇匀，室温下反应1h后，用8.0ml正己烷萃取，静置10min，取下层溶液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得总氨基酸含量测定供试品溶液；3)测定标准曲线以谷氨酸为对照品，配制标准曲线系列溶液，并通过高效液相色谱法，得到色谱图，以谷氨酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，求得标准曲线方程及线性相关系数；4)精密量取步骤2)制得的总氨基酸含量测定供试品溶液2μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，得到总氨基酸含量测定供试品溶液中以谷氨酸为内参物，以相对保留时间定位的18种氨基酸色谱峰，将各色谱峰的面积代入标准曲线方程中求出各氨基酸含量，并乘以各氨基酸相对于谷氨酸的相对校正因子，再求和计算出转移因子胶囊中总氨基酸含量。优选地，步骤3)和步骤4)中，高效液相色谱检测条件为：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；梯度洗脱所用流动相为：流动相a：按甲醇：乙腈：水＝20：60：20的体积比配成的溶液；流动相b：按醋酸钠缓冲溶液：流动相a＝97:3的体积比配成的溶液；醋酸钠缓冲溶液浓度为0.1mol/l，ph值为6.0～6.5；检测波长：210～320nm；进样量为1～10μl；流速为0.5～2ml/min；柱温为25～50℃。更进一步优选地，梯度洗脱时，流动相a与流动相b的变化比例如下：0min，流动相b：100％；15min，流动相a：14％、流动相b：86％；20min，流动相a：17％、流动相b：83％；50min，流动相a：44％、流动相b：56％；50.1min，流动相a：100％；55min，流动相b：100％；65min，流动相b：100％。更进一步优选地，十八烷基硅烷键合硅胶的粒度为5～10μm；色谱柱的内径为2～5mm，长度为10cm～30cm。优选地，步骤1)中，转移因子酸水解液中含总氨基酸1.6～2.4mg/ml；步骤2)中，总氨基酸含量测定供试品溶液中含总氨基酸0.4～0.8mg/ml；上清液用0.45μm微孔滤膜过滤；步骤2)中，下层溶液用0.22～0.45μm微孔滤膜过滤。优选地，制得的转移因子酸水解液中含总氨基酸1.6～2.4mg/ml；制得的总氨基酸含量测定供试品溶液中含总氨基酸0.4～0.8mg/ml。优选地，步骤3)中，测定标准曲线的具体方法如下：(1)配制对照品贮备液精密称取谷氨酸对照品15.0mg，置于100ml量瓶中，加0.1mol/l盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；(2)配制标准曲线系列溶液分别精密量取对照品贮备液1ml、2ml、4ml、10ml，分置于20ml量瓶中，加水稀释至刻度、摇匀，作为对照溶液1～4，对照溶液5同对照品贮备液；(3)标准曲线系列溶液的衍生分别精密量取对照液1～5各4.0ml，分置20ml具塞试管中，加入0.1mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0ml，1mol/l三乙胺乙腈溶液1.0ml，摇匀、室温下反应1h后，加入8ml正己烷萃取，静置10min，取下层溶液用有机滤膜过滤，得到5种衍生后的标准曲线系列溶液；(4)测定并求得标准曲线分别精密量取上述5种衍生后的标准曲线系列溶液各2μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以谷氨酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，求得标准曲线方程及线性相关系数。优选地，步骤4)中，各氨基酸相对于谷氨酸的相对校正因子，是以谷氨酸为内参物，采用标准曲线法测得，18种氨基酸相对校正因子检测结果如下所示：更进一步优选地，还包括考察相对校正因子的耐用性指标，即考察相对校正因子在不同色谱条件下的耐用性。优选地，步骤4)中，总氨基酸含量测定供试品溶液中18种氨基酸的相对保留时间检测结果如下：与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：第一，本发明采用酸水解法使转移因子中多肽类物质水解成其基本组成单元氨基酸，实现对转移因子胶囊中游离氨基酸及组成多肽的氨基酸含量的同时测定。第二，本发明通过筛选色谱柱、流动相组成、流动相ph值、色谱柱柱温及优化洗脱时间梯度等措施，确定了最优检测色谱条件；通过液相色谱结果证实，采用本发明的条件进行检测，图谱中各各氨基酸峰峰形好，分离度高，大大降低了相邻组分峰间的重叠比例，提高了检测准确度。第三，通过系统的验证研究确定了色谱条件，测得18种常见氨基酸的相对校正因子及相对保留时间，说明采用本发明的“一测多评”方法，可以以谷氨酸为内参物实现18种常见氨基酸的定量检测，从而解决了本领域现有技术所用外标法需要对照品较多、检测成本较高及操作繁琐的技术难题。综上所述，本发明的方法能够实现对转移因子胶囊中总氨基酸准确定量分析，从而实现对转移因子胶囊的生产实施有效的监督控制。附图说明图1为18种氨基酸对照品溶液的液相色谱图。图2为本发明实施例中转移因子胶囊供试品溶液的液相色谱图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明公开的转移因子胶囊的总氨基酸定量检测方法，包括以下步骤：1)制备总氨基酸测定衍生用供试品溶液；2)制备总氨基酸含量测定供试品溶液；3)采用“一测多评”法，测定转移因子胶囊中总氨基酸含量。步骤1)中，转移因子胶囊总氨基酸含量测定供试品溶液的制备方法，具体包括下述步骤：a、精密称取转移因子胶囊内容物约1.0g，置20ml具塞试管中，加入0.1mol/l盐酸溶液，置振荡器上振荡使转移因子溶解，摇匀，静置；取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤，精密量取续滤液2.0ml，置消化管中，加浓盐酸6ml，充氮封口，置110℃条件下水解24小时，放冷，制得转移因子酸水解液。b、将转移因子酸水解液启封，置蒸发皿中，水浴蒸发至干；加0.1mol/l盐酸溶液10ml使残留物溶解，作为总氨基酸测定衍生用供试品溶液。优选地，步骤a中，振荡时间应不少于2分钟，充氮时间应不少于30秒。优选地，步骤a中，转移因子酸水解液中的样品浓度对其总氨基酸含量测定结果影响较大，水解样品浓度过高，样品中氨基酸水解不完全，总氨基酸含量检测结果偏低；水解样品浓度过低，样品中氨基酸被破坏程度较大，总氨基酸含量检测结果也偏低。水解样品浓度含总氨基酸1.6～2.4mg/ml，优选2.0mg/ml。步骤2)中，精密量取步骤1)制得的总氨基酸测定衍生用供试品溶液4.0ml，置20ml具塞试管中；加入0.1mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0ml，1mol/l三乙胺乙腈溶液1ml，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用微孔滤膜(孔径为0.22～0.45μm)滤过，取续滤液，即得总氨基酸含量测定供试品溶液。优选地，总氨基酸含量测定供试品溶液的浓度对其总氨基酸含量测定结果影响较大，检测供试品溶液浓度过高，氨基酸峰面积与浓度不成线性，总氨基酸含量检测结果偏低；检测供试品溶液浓度过低，检测灵敏度降低，检测结果不准确。检测供试品浓度优选含总氨基酸0.4～0.8mg/ml，最优选0.6mg/ml。步骤3)，采用“一测多评”法，测定转移因子胶囊中总氨基酸含量，具体方法包括以下步骤：a、相对校正因子的测定，以转移因子胶囊中含量最高及性质相对稳定的氨基酸，即谷氨酸为内参物，测定其余氨基酸的相对校正因子。b、相对校正因子耐用性考察，考察内容包括：相对校正因子在各种色谱条件(流动相的组成比例、ph值、柱温、流速及检测波长等的微小改变时和使用不同仪器、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、不同操作人员等)的耐用性。c、18种氨基酸在拟定色谱条件下色谱峰的定位，在上述相对校正因子耐用性考察时，以谷氨酸为内参物计算其余氨基酸峰的相对保留时间，同时考察其耐用性。d、依据上述测得的相对校正因子及相对保留时间，以谷氨酸为对照品，配制线性系列溶液，测得标准曲线；由相对保留时间定位其余17种氨基酸的色谱峰，从标准曲线中求出各氨基酸峰的含量，乘以相应的相对校正因子并加和即得总氨基酸含量。18种氨基酸包括：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及盐酸赖氨酸。步骤d中，以谷氨酸对照品测定标准曲线时，线性浓度范围对转移因子胶囊总氨基酸含量测定结果影响较大，谷氨酸对照品浓度过高，谷氨酸峰面积与浓度不成线性，总氨基酸含量检测结果偏低；谷氨酸对照品浓度过低，检测灵敏度降低，检测结果不准确。谷氨酸对照品浓度范围优选7.5～150μg/ml。本发明转移因子胶囊总氨基酸含量采用高效液相色谱法，依据18种常见氨基酸的性质及转移因子胶囊中所含游离氨基酸的情况，建立检测色谱条件；对建立的色谱条件进行系统的方法学验证研究，保证所建立色谱条件的耐用性、重现性及准确性。所述检测色谱条件包括：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相a，以0.1mol/l醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节ph值为6.3)-流动相a(97:3)为流动相b进行梯度洗脱。所述的十八烷基键合硅胶色谱柱填料粒度为5～10μm，优选5μm；内径为2～5mm，优选4.6mm；长度为10cm～30cm，优选25cm。所述流动相b中醋酸钠缓冲溶液的ph值为6.0～6.5，优选6.3。所述流动相a-流动相b梯度洗脱的体积比为0:100(0min)，14:86(15min)，17:83(20min)，44:56(50min)，100:0(50.1min)，100:0(55min)，0:100(56min)，0:100(65min)。所述的检测方法中，检测波长为210～320nm，优选254nm。所述的检测方法中进样量为1～10μl，优选2μl。所述的检测方法中流速为0.5～2ml/min，优选1ml/min。所述的检测方法中柱温为20～50℃，优选30℃。下面具体阐述本发明总氨基酸定量检测方法过程中所用测定条件的筛选实例。实施例1转移因子胶囊水解条件的筛选以3因素3水平正交试验筛选转移因子胶囊水解条件，水解条件考察的3个因素分别为水解样品浓度、水解时间、水解酸体积；依据上述3个因素的最佳水平值设计的3因素3水平正交试验表见表1，正交试验结果分析见表2：表1转移因子胶囊水解条件筛选正交试验表水平水解样品浓度a水解时间b水解酸体积c12.0mg/ml22h3ml22.4mg/ml24h6ml32.8mg/ml26h9ml表2转移因子胶囊水解条件筛选正交试验结果分析表由表2可见，通过3因素3水平正交试验确定最佳的水解条件组合为：水解样品浓度2.4mg/ml、水解时间24小时、水解酸体积6ml。并经极差分析发现影响样品检测结果的最显著因素为水解样品浓度。实施例2转移因子胶囊总氨基酸含量测定色谱条件的筛选以3因素3水平正交试验筛选转移因子胶囊总氨基酸含量测定色谱条件，色谱条件考察的3个因素分别为流动相b组成比例、色谱柱柱温、流动相流速；依据上述3个因素的最佳水平值设计的3因素3水平正交试验表见表3，正交试验结果分析见表4。表3转移因子胶囊总氨基酸含量测定色谱条件筛选正交试验表水平动相b组成比例a色谱柱柱温b流动相流速c198:225℃0.8ml/min297:330℃1.0ml/min396:435℃1.2ml/min表4转移因子胶囊总氨基酸含量测定色谱条件筛选正交试验结果分析表由表4可见，通过3因素3水平正交试验确定最佳的水解条件组合为：流动相b组成比例为0.1mol/l醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节ph值为6.3)-流动相a(97:3)、色谱柱柱温30℃及流动相流速1.0ml/min；并经极差分析发现影响样品检测结果的最显著因素为流动相b组成比例。实施例3单对照“一测多评”法测定转移因子胶囊中总氨基酸含量1、相对校正因子的测定以转移因子胶囊中含量最高及性质相对稳定的氨基酸，即谷氨酸为内参物，测定其余氨基酸的相对校正因子。相对校正因子的具体计算方法可以依据检测原理朗博比尔定律算得，即根据朗博比尔定律，在一定的线性范围，成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比。在多指标(s，a，b，…，i，…)质量评价时，以待测物中某一典型有效成分作内参物(s)，建立内参物与其它待测成分(a，b，…，i，…)间的相对校正因子(rcf，fsa，fsb，fsc，…)，按下式计算:fsi＝fs/fi＝(as/cs)/(ai/ci)；按照上述方法测定18种氨基酸的标准曲线方程，以内参物谷氨酸的标准曲线斜率除以其他待测氨基酸的标准曲线斜率即得校正因子。经计算，本发明涉及的18种氨基酸相对校正因子检测结果如下表5所示：表5相对校正因子检测结果2、相对校正因子耐用性考察考察内容包括：相对校正因子在各种色谱条件(流动相的组成比例、ph值、柱温、流速及检测波长等的微小改变时和使用不同仪器、不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱、不同操作人员等)的耐用性。耐用性考察条件如下表6所示，可以看出，考察结果均符合要求。表6相对校正因子耐用性考察条件条件拟定值考察值1考察值2流动相b组成比例97：398：296：4流动相ph值6.36.16.5柱温30℃25℃35℃流速1.0ml/min0.8ml/min1.2ml/min检测波长254nm252nm256nm不同色谱柱kromasil岛津菲罗门不同仪器安捷伦戴安(uv)戴安(dad)不同人员检验员a检验员b检验员c3、相对保留时间18种氨基酸在拟定色谱条件下色谱峰的定位，在上述相对校正因子耐用性考察时，以谷氨酸为内参物计算其余氨基酸峰的相对保留时间，同时考察其耐用性。18种氨基酸相对保留时间检测结果如下表7所示：表7相对保留时间检测结果4、色谱条件采用agilent高效液相色谱仪，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相a，以0.1mol/l醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节ph值为6.3)-流动相a(97:3)为流动相b进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，检测波长为254nm，柱温为30℃，进样体积为2μl。表7洗脱梯度时间表时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0010015148620178350445650.110005510005601006501005、标准曲线的测定1)对照品贮备液的制备精密称取谷氨酸对照品15.0mg，置100ml量瓶中，加0.1mol/l盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。2)标准曲线系列溶液的制备分别精密量取对照品贮备液1ml、2ml、4ml、10ml，分置于20ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液1～4；对照溶液5同对照品贮备液。3)标准曲线系列溶液的衍生分别精密量取上述标准曲线系列溶液各4.0ml，分置20ml具塞试管中；加入0.1mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0ml，1mol/l三乙胺乙腈溶液1.0ml，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液即得。4)测定分别精密量取上述衍生后的标准曲线系列溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以谷氨酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数(r>0.999)。下表8为连续3天测得的谷氨酸标准曲线方程：表8谷氨酸标准曲线方程序号谷氨酸标准曲线方程1y(峰面积)＝5.68*c(谷氨酸浓度)-1.592y(峰面积)＝5.49*c(谷氨酸浓度)-2.583y(峰面积)＝5.58*c(谷氨酸浓度)-3.246、样品的测定1)供试品溶液的制备精密称取转移因子胶囊内容物约1.5g，置25ml量瓶中，加0.1mol/l盐酸溶液适量，振荡2min使转移因子溶解后，加0.1mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置消化管中，加盐酸6ml，充氮封口，置110℃条件下水解24小时。上述溶液水解24小时候；放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸发至干；加0.1mol/l盐酸溶液10ml使残留物溶解，作为总氨基酸测定衍生用供试品溶液。2)供试品溶液的衍生精密量取上述供试品溶液4.0ml，置20ml具塞试管中；加入0.1mol/l异硫氰酸苯酯乙腈溶液2.0ml，1mol/l三乙胺乙腈溶液1.0ml，摇匀，室温下反应1小时后，加入8ml正己烷萃取，静置10分钟，取下层溶液用0.45um有机滤膜过滤，取续滤液即得。3)测定精密量取上述衍生后的供试品溶液2μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。依据表7中各氨基酸的相对保留时间定位18种氨基酸的色谱峰，各色谱峰面积代入标准曲线方程中求出各氨基酸含量，乘以表5中各氨基酸相应的相对校正因子并加和即得总氨基酸含量。实施例4单对照“一测多评”法及多对照外标法测定转移因子胶囊总氨基酸含量结果比较分别采用单对照“一测多评”法及多对照外标法测定同10批转移因子胶囊中总氨基酸含量，结果显示单对照“一测多评”法及多对照外标法测定结果基本一致；检测结果见表9。表9两种方法测定转移因子胶囊总氨基酸含量结果比较表可以看出，单对照本发明的总氨基酸定量检测方法相对多对照外标法检测效率高且需要对照品少、检测成本显著降低。综上所述，本发明公开的方法，采用异硫氰酸苯酯(pitc)衍生化法对游离氨基酸进行柱前衍生；检测色谱条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；以甲醇-乙腈-水(20:60:20)为流动相a，以0.1mol/l醋酸钠缓冲溶液(用冰醋酸调节ph值为6.3)-流动相a(97:3)为流动相b进行梯度洗脱，梯度洗脱的体积比为0:100(0min)，14:86(15min)，17:83(20min)，44:56(50min)，100:0(50.1min)，100:0(55min)，0:100(56min)，0:100(65min)；使用uv检测器，检测波长为254nm；柱温为30℃；进样体积为2μl。解决了现有技术中仅检测游离氨基酸，并不能检测到组成多肽类物质的键合氨基酸，及在氨基酸检测过程中由于转移因子为多组分生化药而使得各氨基酸峰与未知组分峰分离度差的技术难题；同时本发明采用“一测多评”的方法通过一个谷氨酸对照品实现18种常见氨基酸的定量检测，解决了外标法需要对照品较多，检测成本较高，操作繁琐的技术难题。以谷氨酸为内参物，经过系统的验证研究，确定其他17种氨基酸的相对校正因子及相对保留时间；实现18种氨基酸的定量检测。该检测方法准确可靠、分离效果好、专属性强，能有效地对转移因子胶囊中的总氨基酸进行检测与监控。图1和图2系转移因子胶囊总氨基酸含量测定过程中的代表性图谱，图1为18种氨基酸混合对照溶液色谱图，图2为总氨基酸含量测定供试品溶液色谱图。图谱反映了采用本发明方法测定转移因子胶囊中的总氨基酸各氨基酸峰峰形好，分离度高，大大降低了相邻组分峰间的重叠比例，提高了检测准确度。当前第1页12