本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸（gaba）是一种四碳非蛋白氨基酸，广泛存在于动植物中。它对人体有诸多益处，如调节血压与心率；促进营养神经系统的发育，提高脑活力；抑制谷氨酸脱羧反应，降低血氨，保护肝脏等。利用微生物发酵技术来生产γ-氨基丁酸具有成本低、产量高、安全等优点，并可作为天然食品药品添加剂。现阶段对发酵液中γ-氨基丁酸的液相测定方法衍生化操作复杂，且衍生后的γ-氨基丁酸保留时间均在12min以上，使得每个样品的检测时间较长，通常在26min以上，如果样品量较多，总测定时间通常要数十个小时，给科研工作带来不便。
技术实现要素：
为克服现有文献中液相检测γ-氨基丁酸时存在的保留时间长、检测时间长的缺点，本发明提供了一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种快速测定发酵液中γ-氨基丁酸的方法，其将发酵液进行低速离心过膜衍生化后，用液相色谱法进行测定；其具体包括以下步骤：
（1）发酵液的预处理：将发酵液采用4500r/min离心10min，然后用0.22μm滤膜对上清液进行过滤，收集滤液备用；
（2）发酵液的衍生化：取步骤（1）中的滤液200μl，加入100μlopa溶液，于旋转振荡器中30℃、700r/min震荡混合2min；
（3）γ-氨基丁酸的测定：将步骤（2）衍生化后的溶液进行液相色谱测定；所用液相色谱的条件为：lunac18（2）液相色谱柱（4.6×150mm，5μm），柱温40℃，紫外检测波长338nm，进样量20μl，流动相为a相（缓冲液）：b相（100%乙腈）：c相（100%甲醇）=40：30：30（v/v/v）。
所述opa溶液的配制方法为：称取0.1g邻苯二甲醛（opa），用乙腈溶解并定容至1ml，然后加130μl巯基乙醇，用0.4mol/l的硼酸缓冲溶液定容至10ml，微孔滤膜过滤即得。
所述0.4mol/l的硼酸缓冲溶液的配制方法为：准确称取2.47g硼酸（精确至0.0001g），加水约80ml，用3mol/l氢氧化钠调ph至10.2±0.05，再加去离子水定容至100ml。
流动相中所述缓冲液的配制方法为：称取8.0g结晶乙酸钠，加990ml去离子水，再依次加入3.2ml四氢呋喃、138μl三乙胺，用7%（v/v）的乙酸调ph至7.20±0.05，最后加去离子水定容至1l，微孔滤膜过滤后超声备用。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明中样品的前处理简单，衍生化操作便捷，液相色谱的流动相配制简单，有利于实验的开展；
（2）本发明所采用液相色谱条件具有较好的加标回收率，能够对γ-氨基丁酸进行准确测定，同时其可大大缩短衍生后γ-氨基丁酸的保留时间，其保留时间仅为3.51min，节省了时间成本，利于大量样品的快速检测。
附图说明
图1为采用行业标准测定的γ-氨基丁酸衍生前的液相色谱图；
图2为采用行业标准测定的衍生后γ-氨基丁酸的液相色谱图；
图3为采用本发明方法测定的衍生后γ-氨基丁酸的液相色谱图；
图4为本发明中衍生后γ-氨基丁酸的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1
（1）红曲发酵液的预处理：将红曲发酵液4500r/min离心10min，用0.22μm滤膜对上清液进行过滤，收集滤液备用；所述红曲发酵液是将红曲霉孢子接种于液态培养基中，30℃、200r/min摇床培养6天（所用液态培养基配方为：味精22.33g，硫酸铵9.72g，籼米粉45g，无水葡萄糖12.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加去离子水定容至1000ml，自然ph）；
（2）红曲发酵液的衍生化：取步骤（1）中的滤液200μl，加入100μlopa溶液，于旋转振荡器中30℃、700r/min震荡2min；所述opa溶液的制备方法为：称取0.1g邻苯二甲醛（opa），用乙腈溶解并定容至1ml，加130μl巯基乙醇，用0.4mol/l硼酸缓冲溶液定容至10ml，微孔滤膜过滤后备用；所述0.4mol/l硼酸缓冲溶液的制备方法为：准确称取2.47g硼酸（精确至0.0001g），加水约80ml，用3mol/l氢氧化钠调ph至10.2±0.05，再加去离子水定容至100ml备用；
（3）γ-氨基丁酸的测定：将衍生后的溶液进行液相色谱测定；液相色谱的条件为：lunac18（2）液相色谱柱（4.6×150mm5μm），柱温40℃，紫外检测波长338nm，进样量20μl，流动相为a相（缓冲液）：b相（100%乙腈）：c相（100%甲醇）=40：30：30；流动相a相（缓冲液）的配制方法为：称取8.0g结晶乙酸钠，加去离子水约990ml，再依次加入3.2ml四氢呋喃、138μl三乙胺，用7%（v/v）的乙酸调ph至7.20±0.05，最后加去离子水定容至1l，微孔滤膜过滤后超声备用。
1.采用国家轻工业行业标准qb/t4587-2013分别对衍生化前、后的γ-氨基丁酸进行测定，其液相分析条件为：
柱子：c18150×4.6mm，40℃柱温，紫外检测波长338nm；
流动相a：称取8.0g结晶乙酸钠，用水溶解并定容至1l；然后加入220μl三乙胺，搅拌并滴加5%醋酸调ph至7.2；最后加入5ml四氢呋喃，混合过膜，备用；
流动相b：称取8.0g结晶乙酸钠，用水溶解并定容至1l；滴加2%醋酸将ph调至7.2；再按乙酸钠溶液：乙腈：甲醇=1：2：2的体积比混合后过膜，备用。
流动相的洗脱方法如表1所示：
表1梯度洗脱方法
20μl样品溶液与5μlopa溶液混合2min后进样。
所得结果见图1、2。
由图1、2可见，采用此方法进行梯度洗脱时，液相色谱的基线在后期均会发生漂移。γ-氨基丁酸的保留时间为25.60min左右，衍生化后物质的保留时间为24.59min。γ-氨基丁酸的峰面积从1973838减小至1576172，表明部分γ-氨基丁酸已被衍生化，可能衍生剂用量过低，同时衍生后的γ-氨基丁酸的峰面积由于底部与其他杂质峰混合，难以对目标峰的峰面积进行准确计算，从而无法得出样品中γ-氨基丁酸的准确含量。
图3为采用本发明方法检测衍生后γ-氨基丁酸所得的液相色谱图。从图中可以看出，出峰形状较尖，无裂峰，不拖尾，且出峰时间早，仅为3.51min，相较于行标中衍生物的保留时间（24.59min）提早了21.08min，并且峰形良好，无杂峰干扰，可进行峰面积计算，说明该方法可实现γ-氨基丁酸的快速测定。
2.在此基础上进行标准曲线的测定，所得标准曲线如图4所示。标准曲线的r平方为0.9993，线性较好。
3.对改进后的方法进行回收率测定，测定结果如表2。
表2样品加标回收率检测结果
对样品进行加标后，加标回收率在95%~105%范围内则说明方法的可信度高，其他因素的干扰小。由表2可见，该方法下所出的峰基本为gaba与opa的衍生峰。
综上，本发明方法能够对gaba与opa衍生后的峰进行良好分离，其保留时间短，方法可行。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。