一种烟草及烟草制品的处理方法、烟草及烟草制品中N-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法与流程

本发明涉及一种烟草及烟草制品的处理方法、烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法，属于烟草及烟草制品中有害成分检测
技术领域：
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背景技术：
n-亚硝基二乙醇胺是一种非挥发性亚硝胺，其具有毒性，而且被国际癌症研究机构(iarc)列为2级人类致癌物，同时2012年fda烟草制品中心发布的“烟草制品和卷烟烟气中的有害和潜在有害物质指南草案”中也将n-亚硝基二乙醇胺列为了烟草及烟草制品有害物质名单。因此，建立烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法对烟草及烟草制品的风险评估具有着重要意义。根据文献调研，虽然烟草中亚硝胺相关的文献数量较多，但主要聚焦在烟草特有亚硝胺、非极性挥发性亚硝胺的检测上，现有文献较少涉及烟草中n-亚硝基二乙醇胺的检测。在化妆品、环境等领域，鉴于n-亚硝基二乙醇胺的毒性和致癌性，相关的文献报道数量较多，但主要采用的是基于液相色谱的方法，如hplc-uv，hplc-ms/ms，而且也需要引入固相萃取进行净化。如，王峰等hplc-ms/ms测定化妆品中的ndela，该方法的定量限时50ng/g。也有少量文献采用gc-tea(气相色谱-热能分析联用仪)对化妆品等基质中的n-亚硝基二乙醇胺进行检测，但tea并非常规实验室所具备，仪器普及率很小，且同样需要引入固相萃取步骤，且无法消除n-亚硝基二乙醇胺在色谱柱、衬管上的吸附问题。n-亚硝基二乙醇胺在质谱上的响应较低，且由于带有羟基极性基团，容易在色谱柱上吸附造成峰形展宽，造成其检测灵敏度较挥发性亚硝胺、烟草特有亚硝胺低近两个量级，造成了目前无法直接采用gc-ms/ms直接检测n-亚硝基二乙醇胺的现状。技术实现要素：本发明的目的是提供一种烟草及烟草制品的处理方法，能够提高n-亚硝基二乙醇胺在检测时的灵敏度。本发明还提供了一种烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法。为了实现以上目的，本发明的烟草及烟草制品的处理方法所采用的技术方案是：一种烟草及烟草制品的处理方法，包括以下步骤：采用碱性的盐析剂溶液对待测品进行提取，然后加入有机溶剂进行萃取，分层；取有机相加入硅烷衍生化试剂或取有机相挥发溶剂后加入硅烷衍生化试剂，待n-亚硝基二乙醇胺反应完全，得到样品溶液。本发明的烟草及烟草制品的处理方法，适用于对烟丝、烟叶、无烟气烟草制品的处理，其中无烟气烟草制品可以为袋装口含烟、散装口含烟、嚼烟、含化型烟草制品、胶基型烟草制品中的任意一种。本发明的烟草及烟草制品的处理方法中，采用碱性的盐析剂溶液将n-亚硝基二乙醇胺从烟草及烟草制品中提取出来，采用与水不互溶的有机溶剂，将提取出的n-亚硝基二乙醇胺从水相转移至有机相，再将n-亚硝基二乙醇胺与硅烷衍生化试剂反应，避免羟基极性基团在色谱柱中的吸附，提高了n-亚硝基二乙醇胺在检测时的灵敏度；特别是挥发有机相中的有机溶剂，还能去除有机相中的易挥发成分，减少杂质成分对检测结果的干扰，进一步提高检测的灵敏度。碱性的盐析剂溶液为碱性的盐析剂水溶液。优选的，采用碱性的盐析剂溶液对待测品进行提取是将待测品加入碱性的盐析剂溶液中进行浸泡。所述浸泡的时间为5～20min。所述碱性的盐析剂溶液为碱性的饱和盐析剂溶液。所述碱性的盐析剂溶液中oh-离子的浓度为0.2～1.5mol/l。所述碱性的盐析剂溶液中的盐析剂为氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾。优选的，采用碱性的盐析剂溶液对待测品进行提取时，每0.5～1g待测品采用的碱性的盐析剂溶液的体积为2～5ml。优选的，所述碱性的盐析剂溶液为含氢氧化钠1～5％(重量)的饱和盐析剂溶液。所述有机溶剂与水不互溶。优选的，所述有机溶剂为乙醚、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、氯仿中的至少一种。所采用的碱性的盐析剂溶液的体积与采用有机溶剂的体积比为2～5:5～10。所述萃取为涡旋震荡。所述涡旋震荡的时间为20～40min。上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括在加入有机溶剂进行萃取后进行离心。通过离心能够加快实现固液分离并促进有机相和水相分层，减少分层后有机相中分散的提取渣。所述离心的转速为3000～10000r/min。挥发有机溶剂时的温度为20～35℃。由于挥发溶剂的温度不高，为了加快挥发溶剂的速度，可以采用吹干的方式。优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括在取有机相加入硅烷衍生化试剂前或在取有机相挥发溶剂前，先对有机相进行除水处理。可以通过在有机相中加无机固体干燥剂进行除水。在有机相中加入无机固体干燥剂后震荡后静置，然后取有机相计入硅烷衍生化试剂或取有机相挥发溶剂后加入硅烷衍生化试剂。所述无机固体干燥剂为中性无机固体干燥剂。所述无机固体干燥剂为无水硫酸钠、无水氯化钙、无水硫酸镁中的至少一种。加入的硅烷衍生化试剂要足以使所取有机相中的n-亚硝基二乙醇胺完全反应。常规的硅烷衍生化试剂均可用于本发明的技术方案。优选的，所述硅烷衍生化试剂为n,o-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺、n-甲基-n-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺中的至少一种。优选的，所述反应的温度为35～60℃。所述反应的时间为30～60min。采用碱性的盐析剂溶液对待测品提取后，得到提取液、与提取液混合在一起的提取渣。将提取渣保留在提取液中，在将提取液与有机溶剂混匀时，能够将水相中的n-亚硝基二乙醇胺转移入有机相中，降低水相中的n-亚硝基二乙醇胺的浓度，促进n-亚硝基二乙醇胺在水相中的溶出。本发明的烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法，一种烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺的检测定方法，包括以下步骤：1)采用碱性的盐析剂溶液对加入内标物的待测品进行提取，然后加入有机溶剂进行萃取，分层；取有机相加入硅烷衍生化试剂或取有机相挥发溶剂后加入硅烷衍生化试剂，待至n-亚硝基二乙醇胺反应完全，得到样品溶液；2)对将样品溶液中的n-亚硝基二乙醇胺含量采用气相色谱-质谱法进行测定。本发明的烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法，能够有效检测烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺，色谱峰形好、灵敏度高、重现性好、基质干扰小、回收率高，能够满足烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺的气相色谱-质谱法的检测需求，且适合大批量样品的测定，并对食品、植物、环境等其它样品体系中n-亚硝基二乙醇胺的检测可提供参考。所述内标物为n-亚硝基二乙醇胺-d8。在待测品中加入内标物是先将内标物溶于水中制成内标溶液，再将内标溶液加入待测品中。所述内标溶液的浓度为50～500ng/ml。每0.5～1g待测品对应采用的内标溶液的体积为20～100μl。碱性的盐析剂溶液为碱性的盐析剂水溶液。优选的，采用碱性的盐析剂溶液对待测品进行提取是将待测品加入碱性的盐析剂溶液中进行浸泡。所述浸泡的时间为5～20min。所述碱性的盐析剂溶液为碱性的饱和盐析剂溶液。所述碱性的盐析剂溶液中oh-离子的浓度为0.2～1.5mol/l。所述碱性的盐析剂溶液中的盐析剂为氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾。优选的，采用碱性的盐析剂溶液对待测品进行提取时，每0.5～1g待测品采用的碱性的盐析剂溶液的体积为2～5ml。优选的，所述碱性的盐析剂溶液为含氢氧化钠1～5％(重量)的饱和盐析剂溶液。所述有机溶剂与水不互溶。优选的，所述有机溶剂为乙醚、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、氯仿中的至少一种。所采用的碱性的盐析剂溶液的体积与采用有机溶剂的体积比为2～5:5～10。所述萃取为涡旋震荡。所述涡旋震荡的时间为20～40min。上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括在加入有机溶剂进行萃取后进行离心。通过离心能够加快实现固液分离，减少分层后有机相中分散的提取渣。所述离心转速为3000～10000r/min。挥发有机溶剂时的温度为20～35℃。由于挥发溶剂的温度不高，为了加快挥发溶剂的速度，可以采用吹干的方式。优选的，上述烟草及烟草制品的处理方法，还包括取有机相加入硅烷衍生化试剂前或在取有机相挥发溶剂前，先对有机相进行除水处理。可以通过在有机相中加无机固体干燥剂进行除水。在有机相中加入无机固体干燥剂后震荡后静置，然后取有机相计入硅烷衍生化试剂或取有机相挥发溶剂后加入硅烷衍生化试剂。所述无机固体干燥剂为中性无机固体干燥剂。所述无机固体干燥剂为无水硫酸钠、无水氯化钙、无水氯化镁中的至少一种。加入的硅烷衍生化试剂要足以使所取有机相中的n-亚硝基二乙醇胺完全反应。常规的硅烷衍生化试剂均可用于本发明的技术方案。优选的，所述硅烷衍生化试剂为n,o-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(即bstfa)、n-甲基-n-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(即mstfa)中的至少一种。优选的，所述反应的温度为35～60℃。所述反应的时间为30～60min。所述气相色谱-质谱法采用gc-ms/ms检测。gc-ms/ms检测的色谱条件为：载气流速：1.0～2.0ml/min；进样口温度：200℃～280℃；进样量：1μl；分流比为2:1～10:1；升温程序：50℃保持2min，然后以10℃/min的升温速度升到280℃，保持10min。gc-ms/ms检测时气相色谱仪所采用的色谱柱：db-5(长30m～60m，内径0.25mm，膜厚0.25μm)。gc-ms/ms检测时气相色谱仪所采用的载气：he。gc-ms/ms检测的质谱条件为：ei电离源，mrm模式；n-亚硝基二乙醇胺的定量离子对为130/116,电离能量为15ev。以n-亚硝基二乙醇胺-d8作为内标物时，所述质谱条件还包括：n-亚硝基二乙醇胺-d8的定量离子为136/119，电离能量为15ev。附图说明图1为实施例1中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法的流程图；图2为实施例1中的散装口含烟样品及标样中n-亚硝基二乙醇胺的mrm图谱。具体实施方式以下结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的说明。实施例1本实施例的烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法，如图1所述，包括以下步骤：1)将散装口含烟在加入液氮的条件下研磨，称取0.5g磨碎后样品并转移至50ml离心管中，加入50μl内标溶液(100ng/ml的n-亚硝基二乙醇胺-d8溶液)，再加入5ml含氢氧化钠2％(质量)的饱和氯化钠水溶液，静置15min；2)静置完成后，在离心管中加入10ml乙酸乙酯，涡旋振荡20min，再在6000r/min下离心5min，分层；取5ml上层有机相加入2g无水硫酸钠混匀并静置1h，取200μl上清液置于5ml离心管，加入200μlbstfa，在60℃水浴下反应30min，得到样品溶液；3)取样品溶液采用gc-ms/ms对其中的n-亚硝基二乙醇胺进行检测，结果见图2；gc-ms/ms参数如下：色谱柱：db-5(30m×0.25mm×0.25μm)；载气：he，流速：2.0ml/min；进样口温度：280℃；进样量：1μl；分流比为10:1；升温程序：50℃保持2min，然后以10℃/min的升温速度升到280℃，保持10min；ms/ms参数：ei电离源(离子源温度为300℃，四级杆温度为180℃)，采用mrm模式检测，其中n-亚硝基二乙醇胺的定量离子对为130/116，电离能量为15ev；n-亚硝基二乙醇胺-d8的定量离子为136/119，电离能量为15ev；4)分别配制不同浓度的n-亚硝基二乙醇胺标准溶液，在步骤3)中gc-ms/ms检测的条件下，以峰面积对浓度作图得到的工作曲线，见表1，并以5倍信噪比作为定量限，获得检出限和定量限。表1工作曲线线性方程线性系数(r)线性范围(ng/g)检出限(ng/g)定量限(ng/g)y＝5.234x-0.0320.99910.5-500.10.3实施例2本实施例的烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法，包括以下步骤：1)直接取1袋袋装型口含烟a(质量约为1g)作为待测品，称重；然后将袋装型口含烟a从中间撕开，将口含烟粉末转移至50ml离心管，并将撕开后的袋子也置放于该50ml的离心管中，加入100μl内标溶液(50ng/ml的n-亚硝基二乙醇胺-d8溶液)，再加入5ml的含氢氧化钠5％(重量)的饱和氯化钠水溶液，静置20min；2)静置完成后，在离心管中加入12ml乙酸乙酯，涡旋振荡15min，再在5000r/min下离心3min，分层；取8ml上层有机相加入3g无水硫酸钠并静置1h，取100μl上清液置于5ml离心管，加入200μlbstfa，在60℃水浴下反应30min，得到样品溶液；3)取样品溶液采用gc-ms/ms对其中的n-亚硝基二乙醇胺进行检测，并按照表1中的工作曲线计算n-亚硝基二乙醇胺的含量；gc-ms/ms参数同实施例1。按照本实施例中的烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法进行5次平行实验，所测定的精密度(n＝5)为5.6％，证明该方法的重现性好。实施例3本实施例的烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法，包括以下步骤：1)直接称量1.0g烟丝粉末样品转移至50ml离心管，加入50μl内标溶液(40ng/ml的n-亚硝基二乙醇胺-d8溶液)，再加入5ml的含5％氢氧化钠的饱和氯化钠水溶液，静置20min；2)静置完成后，在离心管中加入12ml二氯甲烷，涡旋振荡15min，再在5000r/min下离心3min，分层；取8ml下层有机相，加入3g无水硫酸钠并静置1h，取200μl上清液置于5ml离心管，加入200μlmstfa，在37℃水浴下反应30min，得到样品溶液；3)取样品溶液采用gc-ms/ms对其中的n-亚硝基二乙醇胺进行检测，并按照表1中的工作曲线计算n-亚硝基二乙醇胺的含量；gc-ms/ms参数同实施例1，测定结果为2.3ng/g。实施例4本实施例的烟草及烟草制品中n-亚硝基二乙醇胺含量的测定方法，包括以下步骤：1)将散装口含烟在加入液氮的条件下研磨，称取0.5g磨碎后样品并转移至50ml离心管中，加入50μl内标溶液(100ng/ml的n-亚硝基二乙醇胺-d8溶液)，再加入2ml含氢氧化钠1％(质量)的饱和氯化钠水溶液，静置5min；2)静置完成后，在离心管中加入10ml乙酸乙酯，涡旋振荡40min，再在3000r/min下离心5min，分层；取5ml上层有机相加入2g无水硫酸钠混匀并静置1h，取1.5ml上清液置于5ml离心管，在常温下吹干，然后加入500μlbstfa，在45℃水浴下反应45min，得到样品溶液；3)取样品溶液采用gc-ms/ms对其中的n-亚硝基二乙醇胺进行检测，并按照表1中的工作曲线计算n-亚硝基二乙醇胺的含量；gc-ms/ms参数同实施例1，测定结果为1.8ng/g。实验例5本实施例为加标回收试验，试验方法包括以下步骤：1)平行放置3个50ml离心管，分别标记为离心管a、离心管b、离心管c；取3袋袋装型口含烟b分别称重，袋装型口含烟b中不含n-亚硝基二乙醇胺；2)在各个离心管中分别放入1袋袋装型口含烟b(质量约为1g)，放入时将袋装口含烟b从中间撕开，将口含烟粉末转移至离心管中，并将撕开后的袋子也置于同一个离心管中；然后分别在各离心管中依次加入100μl内标溶液(50ng/ml的n-亚硝基二乙醇胺-d8溶液)，n-亚硝基二乙醇胺标准品溶液、5ml的含5％氢氧化钠的饱和氯化钠水溶液，静置20min；其中，离心管a、b、c中加入的n-亚硝基二乙醇胺标准品试剂量分别为低、中、高三个水平，离心管a中的添加量为2ng/g、离心管b中的添加量为4ng/g、离心管c中的添加量为8ng/g；3)静置完成后，在离心管a中加入12ml乙酸乙酯，涡旋振荡15min，再在5000r/min下离心3min，分层；取8ml上层有机相加入3g无水硫酸钠并静置1h，取100μl上清液置于5ml离心管，加入200μlbstfa，在60℃水浴下反应30min，得到样品溶液a；对离心管b和离心管c同样作上述处理，分别得到的样品溶液b和样品溶液c；4)分别取样品溶液a、样品溶液b和样品溶液c采用gc-ms/ms对其中的n-亚硝基二乙醇胺进行检测；gc-ms/ms参数同实施例1。根据测定结果，分别计算加标回收率，结果见表2。表2袋装型口含烟样品b中n-亚硝基二乙醇胺的测定结果及加标回收率化合物含量回收率(低)回收率(中)回收率(高)n-亚硝基二乙醇胺0ng/g81％102％106％由表2中数据可知，所测定回收率在81～106％之间，表明该分析方法准确率高。当前第1页12