本发明公开了一种人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
弓形虫是一种寄生原虫，几乎能感染所有的温血动物。人类感染弓形虫可以导致孕妇流产、死胎、畸形、胎儿生长发育受阻，甚至死亡。还会对免疫缺陷人群、aids感染者、器官移植者造成弓形虫眼病、弓形虫脑病等疾病。而且弓形虫尚无有效疫苗，对人类的健康造成严重威胁，因此人类弓形虫感染的检测对于疾病的预防和控制具有重要意义。建立一种有效的检测弓形虫感染的技术手段和方法，对弓形虫病的防控尤为重要。
目前弓形虫诊断的方法主要包括病原学、分子生物学和免疫学等方法。病原学方法费时、费力、敏感性低。分子生物学方法，如聚合酶链反应(pcr)、核酸探针及基因芯片等技术，具有较高的敏感性和特异性，但是需要昂贵的检测设备，并且操作过程复杂。免疫学检测方法包括染色实验(dt)、免疫荧光检测(ifa)、直接血凝试验(dat)、间接血凝试验(iha)、酶联免疫吸附实验(elisa)。dt检测需要活的虫体，存在生物安全风险，不利于临床科室检测；ifa需要专门的设备检测，且操作过程繁琐，不适合临床广泛开展；iha和dat敏感性低；elisa敏感性和特异性高、操作简单、生物安全风险低、经济有效，适合大量样本检测。综合对比各种检测方法，elisa是目前最适合检测弓形虫感染的有效方法。
通过基因分型技术，发现世界各地的弓形虫株具有丰富的遗传多样性[1]。截止2012年全球弓形虫虫株分离遗传图谱如图1所示[2]，目前为止，弓形虫数据库中已经报道并记录的基因型有225个(http://toxodb.org/toxo)。其中，目前市场上所使用的elisa检测试剂盒抗原或抗体均来自于以下三种基因型：ⅰ型(rh、gt1)强毒株，ⅱ型(me49、pru)弱毒株，ⅲ型(ctg)无毒株，然而，上述3个基因型为欧洲、美洲和非洲的优势基因型[3-5]。公布号为cn104897891a的中国专利，公开了一种弓形虫检测试剂盒，试剂盒中包括弓形虫抗原，且所述抗原包括致密颗粒蛋白gra15(toxodb:tgme49_275470)，但该抗原来源于me49虫株，是欧美流行株。
我们从我国分离了多株猫源和人源性弓形虫，基因分型结果显示与上述3个原型克隆谱系截然不同，结合国内其他学者对动物源虫株的分型结果，确定chinese1(toxodb#9)为中国流行的弓形虫优势基因型[6-10]。本发明中使用gra15蛋白分离于我国特有的弓形虫基因型chinese1，氨基酸序列不同于欧美流行虫株，尤为适用于检测我国流行的弓形虫，具有更高的准确性，提高检出率。
目前，市场上弓形虫elisa试剂盒多是针对犬、猫等家畜的弓形虫病检测，少数针对人弓形虫感染检测的elisa试剂盒所用的抗原多是虫体可溶性抗原，其成分不确定，关键问题是抗原制备批次间差别较大，不易标准化，检测结果不稳定。随着基因工程技术的不断发展，以重组抗原作为诊断抗原具有无可比拟的优势，如抗原成分稳定、易标准化、特异性强等。弓形虫所具有的致密颗粒蛋白(densegranuleprotein，gra)参与调解纳虫泡及纳虫泡膜的形成并能维持其结构稳定，在宿主体内具有免疫原性。gra15为多态分泌蛋白，能够被分泌至细胞内，并维持分泌在弓形虫速殖子感染宿主的整个阶段，强烈诱导t细胞和b细胞的免疫应答，刺激细胞大量分泌干扰素、白介素、肿瘤坏死因子。具有高度的敏感性，是一种潜在的疫苗和免疫诊断候选抗原分子。本发明中所使用的弓形虫gra15抗原分离自我国特有的弓形虫chinese1虫株，所以针对我国流行的弓形虫病的诊断具有高度的特异性。本发明公开了以重组gra15作为人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒，与其他检测方法相比，具有较强的敏感性和特异性，并且结果稳定。
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技术实现要素：
本发明提供一种以重组蛋白gra15为抗原来检测人弓形虫抗体的间接elisa试剂盒及其制备方法，其目的是在于克服现有技术存在的特异性不强、假阴性率高、结果不稳定等缺点和不足，用于人弓形虫抗体的定性检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒，包括重组抗原gra15预包被板、样品稀释液、阳性参照血清、阴性参照血清、酶结合物、封闭液、洗涤液、显色液和终止液，所述重组抗原gra15的氨基酸序列如seqidno：1所示。
优选地，所述样品稀释液为0.2％w/vbsa的磷酸盐缓冲液，酶结合物为hrp标记的山羊抗人igg，封闭液为2％w/vbsa的碳酸盐缓冲液，洗涤液为0.05％v/vtween-20的磷酸盐缓冲液，显色液为tmb-h2o2显色液，终止液为9.8％wt的硫酸溶液。
一种上述人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)弓形虫重组gra15蛋白的表达：运用pcr技术扩增我国分离的chinese1型弓形虫虫株的gra15基因，将其克隆入原核表达载体，构建重组质粒，经pcr、双酶切和序列测定鉴定分析；
(2)弓形虫重组gra15蛋白的纯化：将构建完毕的重组质粒转化到宿主中，经iptg诱导后，重组菌裂解，取上清，使用ni-nta树脂纯化，his标签蛋白与ni2+阳离子结合，固定在ni-nta树脂上，未结合的蛋白质被冲走后，目标蛋白通过咪唑洗脱回收；
(3)抗原包被：将纯化的重组蛋白gra15用包被液稀释至20μg/ml，包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜；用洗涤液清洗；加入封闭液，每孔100μl，温箱1h；随后再次用洗涤液洗涤，4℃保存备用。
优选地，步骤(1)所述pcr的引物为
f：tatctgaggataatgctttggcttg
r：acggatcctcatggagttaccgctgat。
优选地，步骤(1)所述pcr的退火温度为62～66℃。
优选地，步骤(1)所述的载体为pet-28a。
优选地，步骤(2)所述的宿主为大肠杆菌bl21(de3)。
优选地，步骤(2)所述使用ni-nta树脂纯化包括以下步骤：
(21)灌柱：去除纯化柱空壳，塞住底端，上下颠倒充分混匀ni-nta，按树脂悬浊液与柱体积比为1:4，将树脂悬浊液加入纯化柱空壳内，垂直放置，待ni-nta自然沉降后打开塞子，上清完全流出后即可使用；
(22)预平衡：加入6倍ni-nta无菌去离子水，重悬树脂凝胶，待液体流净，再加入6倍ni-nta结合缓冲液，待液体流净；
(23)纯化回收：将来源于细胞破碎产物的上清液加入纯化柱中，按5倍ni-nta体积分五次加入，然后依次加入20倍ni-nta体积结合缓冲液、12倍ni-nta体积1:17稀释后的清洗缓冲液，弃去流穿液，流速控制在1ml/min；
(24)蛋白洗脱：分四次加入4倍ni-nta体积洗脱缓冲液，收集洗脱液于ep管中，整个过程在冰上操作。
优选地，所述结合缓冲液为40mm咪唑溶液，清洗缓冲液为80mm咪唑溶液，洗脱缓冲液为1m咪唑溶液。
优选地，步骤(3)所述的包被液为0.05mol/lph9.6的碳酸盐缓冲液。
本发明的有益效果在于：
弓形虫虫株在全世界广泛分布，经过基因分型结果显示，世界各地的弓形虫虫株具有丰富的遗传多样性，弓形虫的基因分型和遗传多态性与其致病机制密切相关。弓形虫gra15蛋白在虫体感染的过程中持续表达，具有高度的免疫原性，本发明所使用的弓形虫gra15蛋白来自我国分离的主要流行株chinese1型虫株，对于检测我国人群弓形虫感染具有明显的特异性和敏感性。本发明以原核表达的重组蛋白gra15为基础，通过酶联免疫技术研发而成，具有安全、高效、操作简便、重复性好、可商品化大量生产、制造成本低、易于推广等特点。本发明可应用于人弓形虫病的检测。
附图说明
图1为截止2012年全球弓形虫虫株分离遗传图谱。
图2为本发明蛋白表达时的pcr引物扩增比较图；其中，m为dnamarker，1为本试剂盒中扩增所采用的引物，2、3为对比引物。
图3为本发明蛋白表达时pcr反应不同退火温度后的结果图；其中，m—dnamarker，1—56℃，2—58℃，3—60℃，4—62℃，5—64℃，6—66℃，7—68℃。
图4为本发明人弓形虫重组蛋白gra15表达及纯化前后sds-page的分析结果图；其中，m-蛋白marker，2-纯化后，3-空白对照，4-纯化后，5-纯化前。
图5为本发明蛋白纯化时不同稀释度清洗缓冲液作用后洗脱液sds-page结果图；其中，1—1:20，2—1：4，3—1:12，4—1:8，5—1:17。
图6为本发明人弓形虫重组蛋白gra15表达的westernblotting分析结果图；其中，1-阴性对照，2-重组蛋白gra15。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。
本发明的原理采用间接elisa法，将弓形虫致密颗粒蛋白gra15包被于96孔聚乙烯酶标板使其形成固相载体，然后用2％bsa将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性和阴性对照。样本或标准品种的弓形虫igg抗体能与酶标板中包被的抗原发生抗原-抗体反应，随后，加入辣根过氧化物酶tmb显色，终止液终止反应，通过酶标仪在450nm波长下，测定各孔吸光度(od)值。od450值的大小与相应的待检血清抗体的含量呈正相关。
本发明的目的是以原核表达的弓形虫gra15重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制的一种检测人血清抗体的试剂盒。首先是人弓形虫gra15蛋白的表达及鉴定；gra15蛋白包被酶标板；间接elisa(棋盘滴定法)确定最佳反应条件；试剂盒的组装；试剂盒阻断试验、特异性、敏感性、重复性试验；初步应用；最后成功制成人弓形虫抗体检测试剂盒。
实施例1：人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒的制备
1、制备各种溶液：
①包被液：0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml，4℃保存。
②样品稀释液：0.2gbsa加配好的0.02mol/l磷酸盐缓冲液(0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml)溶解定量至100ml。
③封闭液：2.0gbsa加配好的0.05mol/l碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml。
④洗涤液：将50μltween-20溶入100ml0.02mol/l磷酸盐缓冲液中，震荡混匀。
⑤显色液：a液:称取tmb20mg溶于10ml无水乙醇中，完全溶解后，加双蒸水至100ml。b液:称取na2hpo4·12h2o14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75％过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调ph至5.0-5.4。将a液和b液按1：l混合后即成tmb-过氧化氢尿素应用液。
⑥终止液：10ml98％浓硫酸加入60ml双蒸水中，定容至100ml，室温保存。
2、弓形虫重组gra15蛋白的表达：运用pcr技术扩增我国分离的chinese1型弓形虫虫株的gra15基因，将其克隆入原核表达载体pet-28a，构建重组质粒pet-gra15，经pcr、双酶切和序列测定鉴定分析。
在扩增全长基因的过程中，由于目的产物序列较长，经常会出现假阴性、非特异性条带、扩增产量低等问题。因此我们针对pcr引物的选择和条件进行了反复优化，确定本试剂盒中目的基因扩增引物为
f：tatctgaggataatgctttggcttg；
r：acggatcctcatggagttaccgctgat(如图2所示)。
最佳反应退火温度为64℃(如图3所示)。
3、弓形虫重组gra15蛋白的纯化：将构建完毕的重组质粒pet-gra15转化大肠杆菌bl21(de3)，经iptg诱导后，重组菌裂解，取上清使用novagenni-ntahisbindresinkit蛋白纯化试剂盒纯化，在约70kda处出现特异性表达带，与预期结果一致(图4)。
本试剂盒所使用抗原蛋白表达后，利用his标签蛋白与ni2+阳离子结合，固定在ni-nta树脂上，未结合的蛋白质被冲走后，目标蛋白通过咪唑洗脱回收的原理进行纯化。但是在操作过程中，经常会出现目的蛋白产量低、过柱流速慢、目的蛋白不纯等问题。因此我们对本试剂盒所使用抗原蛋白的表达纯化条件进行优化。由于本试剂盒所使用抗原蛋白与ni2+结合强度不同于其他蛋白，在反复摸索条件后，确定按1:17稀释度稀释清洗缓冲液可以明显提高纯化效率(如图5所示)。
具体的操作步骤如下：
1、灌柱：去除纯化柱空壳，塞住底端，上下颠倒充分混匀树脂凝胶，吸取2ml树脂悬浊液加入纯化柱空壳内，垂直放置，待树脂凝胶自然沉降后打开塞子，上清完全流出后即可使用。
2、预平衡：加入6ml无菌去离子水，重悬树脂凝胶，待液体流净，再加入6ml结合缓冲液，待液体流净。
3、纯化回收：将来源于细胞破碎产物的上清加入柱子，共5ml，分五次加入，然后依次加入20ml结合缓冲液、12ml的按1:17稀释的清洗缓冲液，弃去流穿液。
4、蛋白洗脱：分四次加入4ml洗脱缓冲液，将洗脱液收集于ep管中，整个过程在冰上操作。
其中，各缓冲液的配制方法如下：
结合缓冲液(bindingbuffer，250ml)：nah2po47.8g，nacl17.53g，咪唑0.68g，naoh调整ph至8.0，滤膜过滤。
清洗缓冲液(washingbuffer，250ml)：nah2po47.8g，nacl17.53g，咪唑1.36g，naoh调整ph至8.0，滤膜过滤。
洗脱缓冲液(elutionbuffer，250ml)：nah2po47.8g，nacl17.53g，咪唑17.0g，naoh调整ph至8.0，滤膜过滤。
纯化后蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示。westernblotting分析，表达产物能与人弓形虫阳性血清反应(图6)。
4、抗原包被：将纯化的重组蛋白gra15用包被液稀释至20μg/ml，包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜；用洗涤液洗5遍，每遍5min；加入封闭液，每孔100μl，温箱1h；随后用洗涤液洗涤5遍，每遍5min，4℃保存备用。
实施例2：人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒的操作步骤
(1)用样品稀释液将人血清按1:1000稀释后，加入gra15预包被酶标板的孔内，每孔100μl，37℃温箱孵育1h；
(2)洗涤液洗涤5遍，每遍5min；
(3)加入hrp标记的山羊抗人igg(工作浓度)，每孔100μl，37℃温箱孵育1h；
(4)洗涤液洗涤5遍，每遍5min；
(5)加入显色液，每孔50μl，避光显色5min；
(6)加入终止液，每孔50μl；
(7)利用酶标仪在450nm测定光吸收值(od)值；
(8)结果判定：测定od450值后，依据临界值来判断样品值。
实施例3：人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒性能的测定
(1)敏感性实验：应用已包被弓形虫gra15蛋白的elisa检测酶标板，对不同稀释度的阳性血清进行检测，敏感性为1:25600，如表1所示。
表1人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒敏感性检测
(2)特异性实验：应用已建立好的间接elisa方法，对人感染巨细胞病毒阳性血清和人感染风疹病毒阳性血清进行检测，结果表明该方法与两种标准阳性血清无交叉反应，特异性较好，如表2所示。
表2人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒特异性检测
(3)重复性实验：选用10份弓形虫阳性血清应用已建立好的间接elisa方法，进行批间和批内重复性实验后得到，批间变异系数最大值为4.47％，批内变异系数最大值为7.08％，表明该方法重复性较好，如表3所示。
表3人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒重复性检测
实施例4：人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒检测结果评价
将通过mat法及ifat确定为人弓形虫抗体阳性、阴性血清266份，用本研究试剂盒检测，结果经统计学分析表明，本研究elisa试剂盒检测结果与其余两法结果无显著性差异(p＞0.05)(表4)。
表4人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒重复性检测
本发明以我国分离的弓形虫chinese1虫株的gra15蛋白作为包被抗原，检测我国人群血清中弓形虫抗体，具有较高的特异性、敏感性和很好的重复性。本发明试剂盒的主要试剂均以液体工作液的形式存在，使用方便，为大样本检测及流行病学调查提供了一种方便、可靠、经济的免疫学诊断方法，为人弓形虫病的诊断提供了依据。
以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
sequencelisting
<110>安徽医科大学
<120>一种人弓形虫抗体检测的间接elisa试剂盒及其制备方法
<130>2018
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>550
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<213>chinese1（toxodb#9）
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