一种基于荧光内滤效应检测脂肪酶活的荧光分析方法与流程

本发明属于纳米生物传感器领域，具体涉及一种基于荧光内滤效应检测脂肪酶活的荧光分析方法。

背景技术：

脂肪酶(ec3.1.1)、又称三酰甘油酯水解酶，除了水解羧酸酯键的自然功能外，脂肪酶还可以催化非水介质的酯化、酯交换和相互酯化反应。脂肪酶来源多样，致使他们的催化特性差异较大。脂肪酶主要的反应发生在油一水界面，该特性将脂肪酶与其他水解酶区分开来，在脂肪酶的发现和应用中，脂肪酶活性是一个重要的参数，传统的检测脂肪酶活性的方法，例如滴定法、浊度法和色谱分析法不适合非纯化的样品和大规模的分析检测，因为耗时耗力和成本昂贵，但是酶的活性受到诸多因素的影响，如：温度、时间、ph、酶及底物浓度等，所以开发简单快速、灵敏度高、特异性好的脂肪酶活检测手段是必要的，这对脂肪酶的推广应用也具有重大意义。

纳米材料提供了新的检测酶活的方法，基于纳米生物传感器能够准确、快速地检测酶的活性。但是，由于其底物的水溶性和在水-油界面反应，脂肪酶活性的检测仍然是一块处女地。量子点由于其独特的光学特性，如高荧光量子产率、较大的斯托克斯位移、宽的激发谱和窄的发射谱，引起了特别的关注。纳米金和量子点作为供体/受体对，基于荧光内滤效应或荧光共振能量转移效应，可以开发一种新的酶活分析检测平台，该方法基于分散的纳米金能猝灭量子点荧光的原理。传统的基于荧光共振能量转移的生物传感器高度依赖于供体和受体之间的距离，而基于荧光内滤效应则不受此限制。基于荧光内滤效应的生物传感器不需要在吸收器和荧光体之间进行化学连接，因此可以避免在两个粒子表面的复杂修饰过程。受体吸光度的变化转化为供体荧光的指数变化，因此它们提供了高灵敏度、高灵活性和简单性，并且在实际应用中更有用处。

目前，基于荧光内滤效应已经成功应用于碱性磷酸酯酶，乙酰胆碱酯酶，葡萄糖氧化酶等酶的酶活检测，而利用硫化镉量子点和纳米金基于荧光内滤效应实现对脂肪酶活的检测还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种简单快速、高灵敏度的脂肪酶活检测方法。

为实现发明目的，本发明采用如下技术方案：

(1)巯基乙酸甲酯修饰的纳米金和硫化镉量子点的制备；

(2)脂肪酶活检测标准曲线：用pbs缓冲溶液调节巯基乙酸甲酯修饰的纳米金和硫化镉量子点混合溶液，再将不同浓度的脂肪酶加入到混合溶液中，定容至1000ul，在一定温度条件下反应一段时间；以硫化镉量子点的荧光恢复强度作为纵坐标，脂肪酶浓度作为横坐标，绘制脂肪酶活的标准曲线。

本发明所述的检测脂肪酶活的荧光分析方法，所述的步骤(1)中巯基乙酸甲酯的浓度为4μm。

本发明所述的检测脂肪酶活的荧光分析方法，所述的步骤(2)中最优ph为6.0。

本发明所述的检测脂肪酶活的荧光分析方法，所述的步骤(2)中最优反应温度为45℃。

本发明所述的检测脂肪酶活的荧光分析方法，所述步骤(2)中最优反应时间为14min。

本发明利用了脂肪酶能够切割纳米金表面修饰的巯基乙酸甲酯，生成巯基乙酸，在弱酸性条件下，会和纳米金表面的柠檬酸形成氢键，诱使纳米金聚集，导致硫化镉量子点和纳米金之间的荧光内滤效应减弱，硫化镉量子点荧光恢复，脂肪酶浓度和硫化镉量子点的荧光恢复强度存在着一定的关系，从而可以用于检测脂肪酶活。与现有技术相比，本发明具有的优势在于：发展的这种检测脂肪酶活的荧光分析方法操作简单快速，成本低廉，不需要特殊的仪器设备，最低检出限相较于以往脂肪酶活检测手段均有显著提高。

附图说明

图1巯基乙酸甲酯修饰的纳米金加入脂肪酶前后的投射电镜图(tem)。

图2巯基乙酸甲酯修饰纳米金吸收峰和硫化镉量子点发射峰的谱代重叠图。

图3为机理验证的荧光光谱图：(a)硫化镉量子点；(b)硫化镉量子点+脂肪酶；(c)硫化镉量子点+巯基乙酸甲酯修饰的纳米金+脂肪酶；(d)硫化镉量子点+巯基乙酸甲酯修饰的纳米金。

图4(a)为在硫化镉量子点-巯基乙酸甲酯修饰纳米金的pbs缓冲溶液中，加入不同浓度的脂肪酶(0-45μg/l)的荧光光谱图；(b)为脂肪酶浓度与荧光恢复强度呈线性关系。

具体实施方案

实施例1机理验证

分别向2mla，b，c，d4个离心管中加入3μm的硫化镉量子点，2mm的pbs缓冲溶液(ph6.0)，然后再向b管中加入20μg的脂肪酶，向c管中加入1.61nm的巯基乙酸修饰的纳米金和20μg的脂肪酶，向d管中加入1.61nm的巯基乙酸修饰的纳米金，其他的用超纯水定容至1000μl，45℃温度下水浴14min后，激发波长为360nm，发射波长范围在400-650nm检测其荧光强度(如图3所示)。

图3是机理验证图，从曲线a和曲线b可以看出，无论存不存在脂肪酶，硫化镉量子点在505nm处最大的荧光发射峰都没有发生变化，说明硫化镉量子点和脂肪酶之间没有分子间的相互作用。当硫化镉量子点和巯基乙酸修饰的纳米金混合，曲线d可以看出，基于荧光内滤效应，硫化镉量子点的荧光被猝灭，曲线c可以看出，再加入脂肪酶，荧光内滤效应减弱，硫化镉量子点荧光明显恢复，这可以证明硫化镉量子点荧光恢复是由于脂肪酶和巯基乙酸修饰的纳米金相互作用，调控荧光内滤效应然后进一步影响硫化镉量子点的荧光。

实施例2脂肪酶活检测的标准曲线的绘制

向2ml的离心管中分别加入3μm的硫化镉量子点、1.61nm的巯基乙酸修饰的纳米金以及2mm的pbs缓冲溶液(ph6.0)，加入不同浓度的脂肪酶，锌离子浓度依次为：0μg/l，0.1μg/l，5μg/l，10μg/l，15μg/l，20μg/l，25μg/l，30μg/l，35μg/l，40μg/l，45μg/l，用超纯水定容至1000μl，45℃温度下水浴14min后测定其荧光强度；以脂肪酶的浓度为横坐标，荧光恢复强度为纵坐标作图，即可绘制脂肪酶活的标准曲线图(如图4所示)。

图4表明随着脂肪酶浓度的增加，溶液的荧光恢复强度也逐渐增强且脂肪酶浓度在0.1-45μg/l之间有着很好的线性关系，检出限为0.012μg/ml。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种基于荧光内滤效应检测脂肪酶活的荧光分析方法，其检测原理为我们使用硫化镉量子点作为荧光基团，巯基乙酸甲酯修饰的纳米金作为吸收基团，当硫化镉量子点和巯基乙酸甲酯修饰的纳米金混合以后，由于荧光内滤效应，硫化镉量子点的荧光发射强度明显降低，加入脂肪酶后，荧光内滤效应减弱，硫化镉量子点的荧光强度会明显的变化，脂肪酶活性与荧光放射强度变化存在着一定的关系，因此可以利用荧光信号传感器检测脂肪酶的活性。本发明中公开的脂肪酶活检测方法操作简单，成本低廉，不需要特殊的仪器设备。

技术研发人员：田丹碧;朱杰;张凌华
受保护的技术使用者：南京工业大学
技术研发日：2018.05.21
技术公布日：2018.11.06