专利名称：消除荧光测定中内滤效应的新装置及测试新方法
技术领域：
本发明属于分析科学技术领域，涉及一种基于特殊设计的样品池和相应测试的新方法， 来消除荧光测定过程中内滤效应，尤其涉及一种消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装 置及其测试新方法。
背景技术：
某些物质吸收了与它自身特征频率相同的光子后，其原子中的电子被激发到较高的能级， 从而产生吸收光谱。有些物质当用光照射时，它吸收了某种特定波长的光后还会发出各种不 同颜色和强度的光；当停止照射后，这种光也随之消失，这种光被称之为荧光(fluorescence)。 发出荧光的波长要比所吸收特定光的波长要长。由于物质分子的结构不同，吸光和发射光的 波长也不同。被这些物质吸收的光称为激发光，产生的发射光即为荧光。荧光物质的激发光 谱和发射光谱与其分子结构密切相关，据此可用荧光光谱进行物质的定性鉴定和定量测定。 荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身 结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。据此，可根据 上述相关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位微环境的特征及其变化。
由于荧光的这些特性，通常用荧光技术来研究两种物质之间的相互作用，来判断它们之 间的作用类型、动力学参数以及作用机理。例如，通过测定蛋白与不同浓度有毒污染物相互 作用时荧光的变化，来研究污染物与生物分子的毒性作用机理。但是这种方法也存在一些问 题，其中比较突出的就是内滤效应。内滤效应(inner filter effect, INF)，指激发光和发 射光被非荧光物质吸收而引起的荧光强度降低的现象。这种现象在非荧光物质浓度较低的情 况下可以忽略，但是浓度高时会产生严重的影响。为了消除这种影响，通常采用经验公式计 算的办法来消除，但是结果常常偏离真实情况并且可以应用的浓度范围有限。
发明内容
本发明就是为了克服这些弊端，提供一种消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置 及其测试新方法，它通过实验来测定内滤效应实际的影响程度，从而消除其影响，该方法操 作简单便捷、经济适用、结果可靠、可以解决以前方法中所存在的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案-
一种消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置，它包括由样品池和吸收池构成的荧 光分光光度计用光路装置，所述该光路装置中吸收池为L型，样品池为正方型，L型吸收池 半包围样品池，且样品池的宽度为吸收池宽度的两倍。一种消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置，它包括样品池支架和吸收池支架， 所述样品池支架为正方形，在其相邻两边上设有吸收池支架，三者组成L型；其中样品池支 架的宽度为吸收池支架宽度的两倍。
所述吸收池和样品池均为石英材质。
一种采用消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置的测试新方法，其步骤为-
1) 配制样品溶液a为与荧光物质发生作用的物质，对激发光、发射光有吸收；b为荧 光物质；C为溶剂；其中a、 b均为以C为溶剂的溶液、悬浊液或乳浊液；
2) 在样品池内加入b，吸收池内加入溶剂C，进行扫描得到曲线a;
3) 然后在样品池内加入b，吸收池内加入a，扫描得到曲线e;
4) 最后在样品池内加入a和b的混合溶液，吸收池内加入溶剂c， a、 b的浓度与前两步 骤的浓度相同，扫描得到曲线Y;
5) 设F。、 FB、 FY为所得曲线特定波长处的荧光强度，FeX(l+X)=F。，那么X就为内滤 效应对吸光度影响的程度，F,' :F,X(1+X)为消除内滤效应影响后a与b作用的荧光强度的 真实值。
在测试过程中保持被测荧光物质的浓度稳定，并且测定时温度恒定。 本发明提供的技术方案是用特殊设计的"L"形吸收池或者改进的样品池支架对原来的 荧光分光光度计进行改造，使仪器满足测试的要求。采用特定的样品测试顺序和适宜的扫描 参数对样品进行测定，来得到荧光光谱，通过相应的数据处理来消除内滤效应对荧光光谱的 影响。
上述"L"形吸收池和改进的样品池支架内的吸收池都为石英材质，满足紫外区测定的需 要。B是横截面为正方形的样品池。
样品溶液配制方法，a为与荧光物质发生作用的物质，对激发光、发射光有吸收；b为荧 光物质；c为纯溶剂。a、 b均为以c为溶剂的溶液、悬浊液、乳浊液等。保持被测荧光物质 的浓度稳定，并且测定时温度恒定。
本发明所提出方法的突出特点是-
1. 该方法是以常规的荧光分光光度计为基础，硬件上是在光路中加入了吸收池，技术方 便可行，装置投资小，经济有效，适用于绝大多数的荧光仪器，应用范围广，能够满足多领 域的需要。
2. 该方法较传统方法的使用的范围更加广泛，研究的结果更接近真实情况，而非纯理论 计算的结果。
3. 能够切实解决生产和科研中存在的内滤效应对荧光测定的干扰问题，拓宽仪器的使用 范围，提高科研能力。
44.能够得出具体、真实的实验数据，对理论计算的结果进行校正，促进相关理论的进一 步完善与发展。
图1为本发明的光路系统新装置的结构示意图2为本发明的光路系统新装置的另一种结构示意图3为测试顺序和样品加入方法图。
图4为酸性嫩黄G自身吸收对牛血清白蛋白(BSA)荧光影响的研究图； 图5为碳纳米管自身吸收对BSA荧光影响的研究图； 图6为碳纳米管自身吸收对人血清白蛋白(has)荧光影响的研究图。 其中，l.样品池，2.吸收池，3.样品池支架，4,吸收池支架。
具体实施例方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。 实施例1:
图1中，本发明的光路系统新装置由样品池1和吸收池2构成，其中样品池1为正方型， 吸收池2为L型并且半包围样品池1,且样品池1的宽度为吸收池2宽度的两倍。吸收池和 样品池采用石英材质。
实施例2:
图2中，本发明的光路系统新装置由样品池支架3和吸收池支架4组成，样品池支架3 为正方形，在其相邻两边上设有吸收池支架4,三者组成L型；其中样品池支架3的宽度为 吸收池支架4宽度的两倍。吸收池和样品池为石英材质，支架材质为吸光能力强且不发射荧 光的坚硬材质。
本发明利用改进的测试装置与方法来消除荧光测定过程中的内滤效应。针对常规的荧光 分光光度计，设计了新型的样品池装置和方法进行改进，在合适的荧光测量条件下，通过一 定的样品测试的组合顺序来得到相应的数据，最终通过数据处理来消除内滤效应的影响。
按上述方法，每个样品的测试需要三个步骤。首先如图4各步骤所示，在样品池内加入 b,吸收池内加入溶剂c,进行扫描得到曲线ci。然后，在样品池内加入b，吸收池内加入a， 扫描得到曲线e。最后，样品池内加入a和b的混合溶液，吸收池内加入溶剂c， a、 b的浓 度与前两步骤的浓度相同，扫描得到曲线Y。
对数据进行处理的依据，在荧光测定中，b发射的荧光要经过样品池内的溶液才能到达 检测器，由于荧光在样品池的横截面内是均匀产生的，各个点发光的几率是相同的(因为激 发光强度样品池截面内沿发射光(em)方向是均匀的，或者说是关于样品池中线是对称的)，但 是在各个点发出的荧光(在L范围内均匀产生)所通过溶液的距离是不一样的，根据朗格-
5比尔定律，我们可以将整个平面内各个点发出的荧光的光程平均为1=172(通过二重积分对整 个横截面内物质的吸光强度进行计算也得到相同结论)。这个理论同样适用于激发光(ex)方 向，将激发光通过的光程归一为L/2。这样我们就可以把样品池内的各个吸光点和发光点归 一到样品池中心的0点。通过图3可以看出，步骤(2)和(3)中，激发光和发射光所通过的光 程相同，a物质对激发和发射光吸收的影响相同，只是在(2)中a与b没有混和而在(3)中这 两种物质混合发生作用。设F。、 F8、 F,为所得曲线特定波长处的荧光强度，FBX(1+X)=F。。 那么X就为内滤效应对吸光度影响的程度。F,' :FrX(l+X)为消除内滤效应影响后a与b作 用的荧光强度的真实值。也可以将整条曲线Y放大(1+X)倍，得到消除内滤效应后相互作用 的荧光曲线。
下面通过实例，进一步阐明本发明的突出特点和显著进步，仅在于说明本发明而决不限
制本发明的应用范围及发展潜力。
应用实例l: BSA与染料溶液(酸性嫩黄G)作用
取分析纯的牛血清白蛋白(BSA, lX10^mol/L)和酸性嫩黄G溶液(AY, 4X1(T mol/L)， 按图3所示的方法进行三次扫描，得到的曲线于图4。在波长为347nra处，纯BSA的荧光强 度，F^7464;酸性嫩黄未与BSA混合情况下，AY吸光度对荧光强度的影响，FP=7257; BSA 与AY混合后荧光强度，F,=3636。
FpX(l+X):F。， 7257 X(l+X)=7464， X=0.029
F/ =F,X (1+X)=3636X (1+0. 029) =3741 消除内滤效应影响后的BSA与AY作用后在347nm处的荧光强度F/ =3741。可以看出F/ < F。，说明两者作用后发生猝灭作用。
应用实例2: BSA与碳纳米管悬浊液作用
取分析纯牛血清白蛋白(BSA， 0.5g/L)和修饰碳纳米管(0.1g/L),按图3所示的方法进 行三次扫描，得到的曲线于图5。在波长为347nm处，纯BSA的荧光强度，F。=3710;碳纳米 管未与BSA混合情况下，荧光强度的Fe =956; BSA与碳纳米管混合后荧光强度，FY=406。
FeX(l+X)=F。， 956 X(l+X)=3710， X=2.881
FY, =FYX (1+X) =406X (1+2. 881) =1576 消除内滤效应影响后的HAS与碳纳米管作用后在330nm处的荧光强度F,' =1576。可以看出 F/ < Fa，说明两者作用之后发生了猝灭作用。
应用实例3: HSA与碳纳米管悬浊液作用
取分析纯人血清白蛋白(HAS, 2g/L)和修饰碳纳米管(0.1g/L),按图3所示的方法进行 三次扫描，得到的曲线于图6。在波长为330nm处，纯HSA的荧光强度，F。=6367;碳纳米管 未与BSA混合情况下，荧光强度的Fe =1705; BSA与碳纳米管混合后荧光强度，F一2120。
6FeX(l+X)=F。， 1705 X(l+X)=6367， X=2. 734 Fy， =F,X (1+X)=2120X (1+2. 734)=7917
消除内滤效应影响后的HAS与碳纳米管作用后在330nm处的荧光强度F/ =7917。可以 看出F/ 〉F。，说明两者作用之后发生了荧光增强作用。也可以将整条曲线Y放大(1+2 734) 倍，得到消除内滤效应后相互作用的荧光曲线Y'。这与我们直接看到的曲线Y强度远小 于曲线a结果完全相反，进一步的说明了消除内滤效应的重要性。
权利要求
1.一种消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置，它包括由样品池和吸收池构成的荧光分光光度计用光路装置，其特征是，所述该光路装置中吸收池为L型，样品池为正方型，L型吸收池半包围样品池，且样品池的宽度为吸收池宽度的两倍。
2. —种消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置，它包括由样品池支架和吸收池支 架构成的荧光分光光度计用光路装置，其特征是，所述样品池支架为正方形，在其相邻两边 上设有吸收池支架，三者组成L型；其中样品池支架的宽度为吸收池支架宽度的两倍。
3. 如权利要求1或2所述的消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置，其特征是， 所述吸收池和样品池均为石英材质，支架材质为吸光能力强且不发射荧光的坚硬材质。
4. 一种采用权利要求1或2所述消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置的测试新 方法，其特征是，它的步骤为1) 配制样品溶液a为与荧光物质发生作用的物质，对激发光、发射光有吸收；b为荧 光物质；c为溶剂；其中a、 b均为以c为溶剂的溶液或悬浊液或乳浊液；2) 在样品池内加入b,吸收池内加入溶剂c，进行扫描得到曲线a;3) 然后在样品池内加入b，吸收池内加入a，扫描得到曲线e;4) 最后在样品池内加入a和b的混合溶液，吸收池内加入溶剂c, a、 b的浓度与前两步 骤的浓度相同，扫描得到曲线Y;5) 设F。、 Fe、 Fy为所得曲线特定波长处的荧光强度，FeX(l+X)=Fa，那么X就为内滤 效应对吸光度影响的程度，F/ :F,X(1+X)为消除内滤效应影响后a与b作用的荧光强度的 真实值。
5. 如权利要求4所述的采用消除荧光测定中的内滤效应的光路系统新装置的测试新方 法，其特征是，在测试过程中保持被测荧光物质的浓度稳定，并且测定时温度恒定。
全文摘要
本发明公开了一种消除荧光测定中的内滤效应的新装置及测试的新方法。它通过实验来测定内滤效应实际的影响程度，从而消除其影响，该方法操作简单便捷、经济适用、结果可靠、可以解决以前方法中所存在的问题。其结构为它包括由样品池和吸收池构成的荧光分光光度计用光路装置，所述该光路装置中吸收池为L型，样品池为正方型，L型吸收池半包围样品池，且样品池的宽度为吸收池宽度的两倍。
文档编号G01N21/64GK101581668SQ20091001575
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者刘汝涛, 宗万松, 池振兴, 跃 滕, 潘星任, 秦鹏飞 申请人:山东大学