专利名称：一种利用校正公式消除荧光内滤效应的测试方法
技术领域：
本发明涉及一种消除荧光内滤效应的测试方法。
背景技术：
某些物质受一定波长的光激发后，在极短时间内(10_8秒)发射出波长大于激发波 长的光，这种光称为荧光。荧光技术在生物化学及分子生物学研究中有广泛的应用，主要包 括以下几个方面物质的定性及定量测定，研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结 构和构象，利用荧光寿命、量子产率等参数研究生物大分子中的能量转移现象等。在具体应用过程中，如果被测体系在荧光激发和发射波长处存在吸收，会减弱被 测体系的荧光强度，影响其荧光光谱，进而影响用此技术获得的各种数据和结论，特别是当 存在吸收的物质浓度高时会产生严重的影响。目前，已经有一些荧光校正的公式用来消除 内滤效应。其中，比较常用的公式为Αζ&ιοΜ+·2，^为被测体系校正后的荧光值， Fobs为被测体系校正前(实测)的荧光值，A1为被测体系各 组分在荧光激发波长处的吸收 值之和，A2为被测体系各组分在荧光发射波长处的吸收值之和。在具体操作过程中，一般都是先利用荧光计测定体系的荧光值(光谱)，然后利用 紫外可见分光光度计分别测定体系中各组分的吸收值(光谱)，最后利用上述公式进行校 正计算。这种方法需要分别配制待测体系及待测体系中各组分的溶液，较为繁琐。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足，而提供一种利用校正公式消除荧光内滤效应的测 试方法，该种方法操作简便、准确易行。本发明采取的技术方案为—种利用校正公式消除荧光内滤效应的测试方法，包括如下步骤(1)将作为参比的吸收池和用于测定荧光样品吸收值(光谱)的荧光池均放入 超纯水，放置入紫外可见分光光度计(在荧光池的一侧标记，使有标记的一侧朝向光源一 侧)，设置紫外可见分光光度计的扫描波长范围，使之包括待测样品荧光测试时的激发波长 和发射波长的范围(预先考察好)，进行基线校正以消除吸收池和荧光池的误差；(2)配制一份待测体系的待测样品，将配制好的待测样品放于荧光池中，有标记的 一侧朝向光源一侧，放置进入荧光分光光度计，按照预先考察好的待测样品的荧光测试条 件设置激发波长和发射波长等，然后进行荧光测试，得到样品的荧光值F。bs ；(3)荧光测试完毕后，将盛有待测样品的荧光池置于紫外可见分光光度计中，按照 步骤(1)设置的测试条件，以水为参比，测定待测样品的吸收光谱，将激发波长和发射波长 处对应的吸收值加和得A ；(4)将得到的荧光值F。bs数据和吸收值A数据代入公式Fcot = Fobs10A/2得到Fcot为校正好的荧光值。本发明利用同一荧光池及其内盛的样品先后测定其荧光和吸收光后利用校正公式实现荧光内滤效应扣除，仅需配制一待测体系溶液，无需配制和检测各组分溶液，具有节 省时间、节约药品、操作简捷、经济适用、准确可行的特点，特别是在样品较多的情况下，能 极大的提高工作效率，在生物化学及分子生物学研究领域有较大的推广应用价值。
图1是本发明进行吸收测试时吸收池和荧光池的布局图。图2是本发明进行荧光测试时荧光池的布局图。图3是实施例1的实验效果图。图4是实施例2的实验效果图。
具体实施例方式实施例1将作为参比的吸收池和用于测定荧光样品吸收值(光谱)的荧光池均放入超纯 水，在荧光池的一侧标记，使有标记的一侧朝向光源一侧，设置紫外可见分光光度计的扫描 波长范围，使之包括待测样品荧光测试时的激发波长和发射波长的范围(预先考察好)，进 行基线校正；配制牛血清白蛋白(BSA)溶液、四环素(TC)溶液及二者的混合体系(Cbsa = 1 X 10_6mol/L，Ctc = 5X 10_5mol/L，用磷酸盐缓冲液控制pH为7. 4)，将配制好的待测样品放 于荧光池中，有标记的一侧朝向光源一侧，测定BSA+TC混合溶液的荧光发射光谱(激发波 长=278nm，发射波长范围280-500nm，每0. 2nm取一个数据点F。bs，温度为301K)，得到样品 的荧光发射光谱；将盛有待测样品的荧光池置于紫外可见分光光度计中测定吸收光谱(吸 收光谱测定范围为275-500nm，每0. 2nm取一个数据点)。将激发波长对应的吸收值和发射 波长每个数据点F。bs对应波长处的吸收值加和得A ；将荧光值F。bs和吸收值A代入公式Fcot =F。bs10A/2，得到Fcor为校正好的荧光值，以Fcor为纵坐标，每个Fcor对应的波长为横坐标做 图得到校正后的荧光发射光谱(图3，曲线a)。校正前的荧光发射光谱为图3中的曲线C。对比试验作为比较，采用常规的校正步骤，分别配制BSA溶液和TC溶液，先利用 荧光计测定混合溶液的荧光发射光谱，然后利用紫外可见分光光度计分别测定BSA和TC溶 液的吸收光谱，利用校正公式^ =KbsIOwW2进行校正。其中，Fcot为BSA+TC混合溶液校正 后的荧光值，Fobs为BSA+TC混合溶液校正前的荧光值，A1为BSA溶液和TC溶液在荧光激发 波长处的吸收值之和，A2为BSA和TC在荧光发射波长处的吸收值之和。校正后的荧光发射 光谱为曲线b(图3)。由图3可见，曲线a和曲线b两者峰值偏差为2%，差别很小，说明本发明的技术方 案实际可行。实施例2与实施例1的步骤类似，首先进行基线校正。配制过氧化氢酶(CAT)溶液、土霉 素(OTC)溶液及二者的混合体系(Ccat = 1. 5X10-6mol/L,COTC = 5X 10_5mOl/L，用磷酸盐缓 冲液控制PH为7. 4)。采用实施例1所述技术方案测定CAT+0TC混合溶液的荧光光谱(激 发波长=274nm，发射波长=283-490nm，温度为293K)和吸收光谱(吸收光谱测定范围为 273-490nm)并对荧光发射光谱进行校正。校正前的荧光光谱为图4中的曲线c，利用本发 明的技术方案校正后的荧光光谱为图4中的曲线a。
对比试验采用与实例1相同的常规校正步骤校正后的荧光光谱为曲线b(图4)。曲线a和曲线b两者峰值偏差为2. 45 %，差别较小，说 明本发明的技术方案实际可 行，具有很大的应用价值。
权利要求
1. 一种利用校正公式消除荧光内滤效应的测试方法，其特征是，包括如下步骤(1)将作为参比的吸收池和用于测定荧光样品吸收值的荧光池均放入超纯水，放置入 紫外可见分光光度计，在荧光池的一侧标记，使有标记的一侧朝向光源一侧，设置紫外可见 分光光度计的扫描波长范围，使之包括待测样品荧光测试时的激发波长和发射波长的范 围，进行基线校正以消除吸收池和荧光池的误差；(2)配制一份待测体系的待测样品，将配制好的待测样品放于荧光池中，有标记的一侧 朝向光源一侧，放置进入荧光分光光度计，按照预先考察好的待测样品的荧光测试条件设 置激发波长和发射波长，然后进行荧光测试，得到待测样品的荧光值F。bs ；(3)荧光测试完毕后，将盛有待测样品的荧光池置于紫外可见分光光度计中，按照步骤 (1)设置的测试条件，以水为参比，测定待测样品的吸收光谱，将激发波长和发射波长处对 应的吸收值加和得A ；(4)将得到的荧光值F。bs数据和吸收值A数据代入公式Fcot= F。bs10A/2，得到Fcot为校 正好的荧光值。
全文摘要
本发明公开了一种利用校正公式消除荧光内滤效应的测试方法，先将作为参比的吸收池和用于测定荧光样品吸收值的荧光池均放入超纯水扫描基线，再对待测体系样品荧光测试得荧光值Fobs，将盛有待测样品的荧光池置于紫外可见分光光度计中扫描并将激发波长和发射波长处对应的吸收值加和得到吸收值A，代入公式Fcor＝Fobs10A/2，得到Fcor为校正好的荧光值。本发明仅需配制一待测体系溶液，无需配制和检测各组分溶液，具有节省时间、节约药品、操作简捷、经济适用、准确可行的特点，特别是在样品较多的情况下，能极大的提高工作效率，有较大的推广应用价值。
文档编号G01N21/31GK102053080SQ20101057607
公开日2011年5月11日 申请日期2010年12月6日 优先权日2010年12月6日
发明者刘汝涛, 池振兴, 赵星辰 申请人:山东大学