专利名称：根据拉曼和背景荧光谱多峰检测组织异常的制作方法
技术领域：
本发明涉及组织异常的检测。本方面例如可以应用于筛选肿瘤或其他癌变对象。本发明可以用于筛选皮肤组织或其他组织。
背景技术：
皮肤癌是北美洲最常见的癌症。每年诊断出550,000以上的皮肤癌新个案。七个加拿大人中有一个将在其生命期间发生皮肤癌。如果检测得早，皮肤癌可以通过较小的手术移除而治愈。但是，如果检测晚，就需要更大面积和毁容性的手术。特别重要的是早期诊断恶性黑素瘤。如果恶性黑素瘤的治疗开始得太晚，则会发生全身性转移和死亡。
目前，皮肤癌主要由医生通过视觉检查来检测。但是，视觉诊断的临床准确率最多为75％。因此确诊依赖于皮肤活组织的组织学检查。切除的活组织目前仍是早期诊断皮肤癌的最可靠诊断方法，但是对于筛选可能具有多处疑似病变的高危患者来说这种方法是侵入性的，并且不切实际。对健康护理系统以相当高的成本进行了许多不必要的活组织检查。此外，一些需要的活组织检查由于不能识别癌症而不能进行。
在皮肤癌治疗期间，也依赖于视觉评价来确定肿瘤程度，从而确定待切除或照射的组织量。如果肿瘤具有不明确的边缘，可能需要在称作莫氏显微手术(mohsmicrographic surgery)的耗时、昂贵而繁杂的程序中进行多个部位的重复活组织检查程序。
在皮肤癌治疗后，需要通过视觉检查和周期性显微检查的进行性患者监测，以检测复发的肿瘤或其他部位新生的皮肤癌。提供准确诊断信息而不需要多次昂贵且可能毁容的皮肤活组织检查的技术将有助于皮肤癌治疗的所有阶段。
已经使用光学或非光学方法建立了非侵入性诊断皮肤的多种方法。非光学方法包括超声和MRI，而皮肤反射、自体荧光和热红外成像涉及测量疾病状态中改变的皮肤光学特征。世界上的许多研究小组都在致力于开发反射皮肤成像方法(与数码照像类似)，以使用数码处理来改进皮肤癌的早期诊断。该方法已经改进了皮肤病变的登记、记录和文档编制，但尚未显著改善非侵入性诊断的准确性。
已提出将拉曼光谱和荧光光谱用作诊断癌症的工具。拉曼光谱测量来自分子系统非弹性散射的光的波长和强度。拉曼散射光具有相对于入射光偏移的波长，偏移的量对应于分子系统中的激发能量。激发通常是振动。
拉曼散射光通常较弱。当单色光打到样品上时，几乎所有观察到的光被弹性散射(瑞利散射)，同时能量(或波长)不变。只有非常小部分的散射光，通常约为1/108，被非弹性散射(拉曼散射)。拉曼峰通常很窄，许多情况下可以归因于分子中特定化学键的振动(或由官能团的振动决定的正常模式)。因此，拉曼光谱提供多种分子种存在的“指纹”。拉曼光谱分析可以用于分子种的定性表征和定量测定。
已经从包括皮肤的多种生物组织观察了拉曼光谱。组织中表征到的拉曼散射物包括弹性蛋白、胶原、血液、脂质、色氨酸、酪氨酸、类胡罗卜素、肌球蛋白、核酸等。拉曼光谱分析也已经用于监测皮肤疾病治疗过程中的经皮药物递送和药物代谢动力学。它已经用于监测血液样品中的血液分析物，如葡萄糖、乳酸和尿素。
研究组织拉曼光谱的多数研究已经使用傅立叶变换(FT)拉曼光谱仪研究了体外组织样品。FT-Raman系统需要1/2小时来获得光谱，其体积大且不易携带，因此临床应用有限。最近开发的色散型拉曼系统基于光纤学光传输和收集、小型二极管激光器和高效的光谱图检测仪组合，将获得拉曼光谱所需的时间缩短至几分钟或亚分钟(sub-minute)。
除了散射和反射光外，组织还可以吸收光并以荧光的形式发射吸收的能量，所述荧光具有比入射光更长的波长。这种“自体荧光”信号微弱，但是可以被检测到。组织的荧光激发和发射研究通常在紫外和可见光波长范围内进行。
最近，在较长的红至近红外(NIR)波长处进行了一些组织自体荧光研究。一些例子是Zhang G，et al.，Far-red and NIR Spectral Wing Emission from Tissue under 532and 632 nm Photo-excitation Laser in Life Science 91-16，1999和Demos S G，et al.，Tissue imaging from cancer detection using NIR autofluorescence，Proceedings SPIE461331-34，2002。
通过反射或可见荧光技术评价包括黑素瘤及其前体的色素病变的问题在于整个紫外和可见光谱中黑色素是强的光吸收剂。该波长范围内的入射和反射或再发射(荧光)光子大部分都被黑色素吸收。这导致弱的光谱和“黑洞”图像，提供的临床有用信息很少。
Richards-Kortum等的美国专利6,095,982公开了荧光和拉曼谱的组合用于检测组织中癌前期(pre-cancer)和其他异常的用途。荧光测量在紫外范围内进行，而拉曼光谱的测量在红外范围内进行。Richards-Kortum等人的美国专利No.5,991,653、5,697,373、5,612,540和6,258,576公开了类似的方法。
Verma的美国专利4,832,483公开了使用拉曼光谱检测癌症的方法。Georgakoudi等的US 6,697,652公开了利用包括荧光、反射和光散射光谱的多种光谱技术评价组织的方法。Nordstrom等人的US 6,385,484公开了荧光光谱和反射光谱用于对组织样本进行分类的用途。Tumer等的US 6,135,965公开了神经网络用于表征与异常组织对应的光谱的用途。
Alfano等的US 5,293,872涉及一些方法，包括拉曼光谱用于区分钙化动脉粥样硬化组织和光纤性动脉粥样硬化组织的用途。Alfano等的US 5,131,398公开了使用自生荧光区分癌变组织和良性肿瘤组织的方法。Alfano等的US 5,261,410公开了使用拉曼光谱检测组织是恶性肿瘤组织、良性肿瘤组织还是正常组织的方法。Alfano等的US 5,369,496公开了背散射光用于评价组织样品的用途。
Puppels等的WO 2004/051242公开了高波数拉曼光谱用于检测组织异常的用途。Haaland等的US 5,596,992公开了多变量分类技术应用于细胞和组织样品的红外光谱的用途。Gellermann等的US 6,205,354公开了拉曼光谱用于检测类胡萝卜素的用途。Lin等的US 6,377,841公开了荧光和漫反射光谱用于检测脑瘤边界的用途。Garfield等的US 5,450,857公开了荧光光谱用于测量宫颈扩张的用途。Boppart等的US 6485413公开了可以用来收集包括荧光光谱和拉曼光谱在内的多种光谱的仪器。
已经在文献中描述了基于所测定的组织光谱的峰强度、宽度和/或峰比的经验性确定的诊断算法，以评价具有组织病理的组织光谱的变化。一些例子是Mahadevan-Jansen A，and Richards-Kortum R.Raman spectroscopy for the detectionof cancers and precancers，J Biomed Opt 1996；1，31-70；Mahadevan-Jansen A，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for in vitro detection of cervical precancersPhotochem Photobiol 1998；68123-132；和Huang Z，et al.，Near-infrared Ramanspectroscopy for optical diagnosis of lung cancer，Int J Cancer，2003；1071047-1052。
多变量统计技术已经应用于相似目的。例子包括Bakker Schut TC et al.In vivodetection of dysplastic tissue by Raman spectroscopy Anal Chem 2000；726010-6018；Mahadevan-Jansen A，et al.Near-infrared Raman spectroscopy for in vitro detection ofcervical precancers Photochem Photobiol 1998；68123-132；Stone N，et al.Near-infrared Raman spectroscopyfor the classification of epithelialpre-cancers andcancers，J Raman Spectrosc 2002；33564-573；Deinum G，et al.，Histologicalclassification of Raman spectra of human coronary artery atherosclerosis usingprincipalcomponent analysis，Appl Spectrosc 1999；53938-942；和Silveira L Jr et al.，Correlation between near-infrared Raman spectroscopy and histopathological analysis ofatherosclerosis in human coronary arteries，Lasers Surg Med 2002；30290-7。
至今为止，上述公开出版物中描述的诊断方法中尚没有广泛适用于组织筛选。
虽然本领域中已经进行了大量研究，但仍然需要能够筛选肿瘤或其他癌性病变的快速、准确、有成本效益的方法和装置。
发明内容
本发明的一个方面提供表征组织的方法。该方法可以提供组织区域是否可能异常的指标。该方法包括在第一波长范围内获得组织拉曼光谱的特征；在与第一波长范围重叠的第二波长范围内获得背景荧光光谱的特征；和至少根据拉曼谱特征和背景荧光光谱特征来表征组织。例如表征可以通过对神经网络应用分类函数或提供拉曼和背景自体荧光的特征来进行。合适的分类函数例如可以来源于对参照数据进行PCA(主成分分析)和LDA(线性判别分析)。
本发明的另一个方面提供测定组织黑色素含量的方法。该方法包括获得组织的NIR光谱，所述光谱包括约1368cm-1和1572cm-1波数的第一峰和第二峰；减去光谱的背景以产生拉曼光谱；和根据拉曼光谱中第一和第二峰中至少之一的强度计算组织的黑色素含量。
下面描述本发明的其他方面和本发明具体实施方案的特征。
在说明本发明非限制性实施方案的附图中，图1是可以用于获得拉曼和背景荧光光谱的装置的框图。
图1A是图1的装置的探头的示意性框图。
图2A显示光谱仪输出端的光谱曲线；图2B显示光谱仪输出端的线，已对其修饰以矫正线曲率；图3显示用于几种组合(binning)模式的人皮肤的拉曼光谱；图4是说明本发明方法的流程图；图5是用作受试者的小鼠中肿瘤的显微照片；图6A、6B和6C分别是来自小鼠肿瘤组织的原光谱；图6A原谱中的背景自体荧光成分和图6A原谱中的拉曼成分；图6D、6E和6F分别是个体小鼠中肿瘤和正常组织之间的平均差异，分别对应于图6A、6B和6C中的原光谱和光谱成分；图7A、7B和7C分别是拉曼、背景荧光和原光谱的主成分的图。
图8A、8B和8C分别是拉曼、背景荧光和原光谱的两种最具诊断显著性的主成分的散布图；图9A、9B、9C和9D是分别对拉曼、背景自体荧光、原光谱和组合的拉曼PC分值和NIR背景荧光PC分值计算得到的属于正常和肿瘤组的事后机率的图。
图10是在不同阈水平处对拉曼、背景自体荧光、原光谱和组合的拉曼PC分值和NIR背景荧光PC分值产生的一组接受器操作的特征性曲线；图11显示癌变和非癌变的各皮肤区域的拉曼光谱；图12是涉及两个比率的脂质-蛋白质拉曼谱带的散布图，显示在受试者身体的不同部位获得的拉曼光谱的簇集行为(clustering behavior)；图13显示在许多不同受试者的相同身体部位所取皮肤的拉曼光谱之间的差异；图14显示黑色素的拉曼数据；图15比较正常和痣组织的NIR背景荧光光谱；图16比较正常和痣组织的可见荧光光谱；图17显示几种黑色素样品的NIR光谱；
图18比较黑发和白发的NIR光谱。
具体实施例方式
在下面的所有描述中，给出具体的细节以提供对本发明的更充分理解。但是，本发明可以不通过这些具体细节而实施。在其他情况下，没有详细给出或描述公知的要素，以避免不必要地使本发明不清楚。因此，说明书和附图都是说明性的，而非限制性的。
本发明提供检测组织异常的方法。根据本发明的方法照射待研究的组织区域，获得一定波长范围内的光谱，其包括拉曼特征和背景荧光。拉曼特征和背景荧光都可用作评价待研究的组织区域是否可能异常的基础。本发明的具体实施方案可以用于筛选皮肤或其他组织的癌症，所述组织如肺组织、上皮组织如消化道的衬层、内部器官组织或其他组织。本发明的方法可以用于体内组织。该方法还可以体外应用。
组织区域例如可以是·受试者皮肤区域；·从活组织检查或手术获得的组织块的区域；·肺组织或可以使用内窥镜设备从中获得光谱的其他组织的区域；或·手术过程中暴露的组织的区域。
在本发明的一些实施方案中，波长范围覆盖近红外(NIR)的部分光谱。在本发明的一些实施方案中，波长范围跨度至少为约800nm-约1000nm。
来自待研究组织区域的光谱是否指示组织可能异常的确定涉及将测定的光谱与参照数据进行统计学分析比较。参照数据可以包括或基于取自已知正常和/或异常的组织的参照光谱。参照数据可以取自基于可靠的诊断技术如组织病理学诊断而已知正常或异常的组织。测定光谱与参照数据的比较可以涉及将主成分分析(PCA)和线性判别分析(LDA)应用于参照数据，如下面给出的实施例中所述。作为替代方案或附加方案，拉曼和背景荧光谱的特征可以提供至已经进行训练的神经网络，以至少部分基于拉曼和背景荧光光谱特征表征识别和/或表征异常组织样品。
本发明人已经观察到由785nm激光激发的体内组织NIR自体荧光表现出在正常和病变组织之间表现出与较短波长可见的组织自体荧光不同的趋势。例如，受白癜风影响的皮肤与周围正常皮肤相比具有较低的NIR荧光和较高的可见荧光，而受复合痔影响的皮肤与周围正常皮肤相比具有较高的NIR荧光和较低的可见荧光(见图15和16)。白癜风和正常皮肤之间以及复合痔与正常皮肤之间的主要差异是黑色素的量。受黑素瘤影响的皮肤与周围正常皮肤相比也表现出NIR自体荧光增加。本发明人还发现人皮肤鳞状细胞癌中NIR自体荧光发射增加。相反，皮肤基底细胞癌与其周围正常皮肤相比表现出更低的NIR自体荧光发射。正常和异常组织之间NIR光谱的这些差异可以与组织的拉曼光谱特征组合，用于表征皮肤和其他组织。
其他峰特征可以任选地与拉曼和背景荧光谱的特征组合，以提高单独使用拉曼和背景荧光谱所获得结果的准确性(如特异性和/或灵敏性)。例如，组织区域的黑色素含量可以用作附加特征。拉曼光谱可以用于测定组织的黑色素含量，如下所述。更多的峰特征可以包括一个或多个峰特征，如·UV或可见光荧光光谱；·漫反射光谱；·光散射光谱，其测定组织的散射特性，作为波长的函数；和·同一患者的待研究组织的光谱中一个或多个拉曼和/或NIR背景自体荧光特征和正常组织的相应特征之间的差异。
本发明人已经发现对于NIR的拉曼和荧光谱来说，当组织区域是皮肤时，正常组织的光谱取决于组织区域在受试者身体的部位。例如，手的正常组织倾向于在不同受试者中表现出类似的光谱特征。相比之下，手、头、臂、躯干和股的正常组织的NIR/拉曼谱特征倾向于彼此不同，即使对于相同的患者也不同。在本发明的一些实施方案中，分类函数来源于与待研究组织区域所处身体区域相同的身体区域的参照光谱。本发明的一些实施方案提供多个分类函数，各自来源于不同的参照数据集合，各自与不同的身体区域相关。例如，对于手、头、臂和躯干以及股中两种或多种的每一种提供一个参照数据集合。
装置任意合适的装置可以用于获得所期望波长范围内的组织的拉曼和背景荧光谱。当本发明的方法用于体内筛选时，通常期望所述装置能够相当快地获得拉曼和背景自体荧光谱，并且装置不要太大。
图1是可以用于获得拉曼和背景荧光谱的装置10的框图。装置10可以如以下文献所述进行构建US patent No.6,486,948和Huang Z.et al.Rapid near-infraredRaman spectroscopy system for real-time in vivo skin measurements，Opt Lett 2001；vol.26pp.1782-1784，上述文献通过引用并入本文。装置10包括光源12，其典型的是单色光源，最典型的是激光。在本发明目前优选的实施方案中，光源12发射NIR(600nm-1200nm)内的光。在一个示例性的实施方案中，光源12是发射波长为785nm的光的激光二极管。在本发明的原型实施方案中，光源12是在785nm处发光的300mW激光二极管，此类光源得自SDL Inc of San Jose，California。
光源12的光通过光纤16传输到探头14。在原型方案中，光纤16是具有0.22的数字孔径(“NA”)的200μm芯直径光纤。如图1A所示，探头14包括瞄准仪18和带通滤波器19，确保作用在组织S上的光是基本单色的。在原型方案中，带通滤波器19的通频带为785nm±2.5nm。透镜20将单色光聚焦到组织S上。在原型方案中，透镜20提供3.5mm的光点尺寸。可以在激光12的激光输出端安装遮光器(未示出)。遮光器可保持关闭，只有在获得光谱数据期间打开，以确保受试者皮肤只根据获取数据的需要暴露于激光。
已由组织S背散射的光通过透镜22A和22B聚焦至光纤束24中。陷波滤波器28阻挡感兴趣的波长范围之外的光。在原型实施方案中，滤波器28是在785nm处光学密度(“OD”)＞6.0的全息滤波器。
光纤束24将背散射光传输至分光计26。为了增加检测灵敏度，用于原型方案的光纤束24包括多至可以成像到分光计26的光传感器上的光纤。在原型方案中，束24具有58个100μm的光纤，其输入端以直径为1.6mm的环形排列于探头14处，其输出端以通常为线性阵列排列在分光计26入口处。原型方案具有位于输出线性阵列中央的50μm校准光纤27。已知波长的光可以通过校准光纤27传输至分光计26，用于分光计26的波长校准。
在原型方案中，分光计26是HoloSpecTMf/2.2 NIR分光计，配有HSG-785-LF型体积相技术(VPT)全息光栅，得自Kaiser Optical Systems，Inc.of Ann Arbor，Michigan USA。分光计26包括光检测器，如CCD相机30。在原型方案中，相机30是1024×256像素的液氮冷却、NIR-优化、背照射、深层空乏(deep-depletion)的CCD检测器，其型号为No.LN/CCD-1024EHRB QE 75％at 900nm，得自PrincetonInstruments，of Trenton，NJ，USA。相机30向计算机系统32提供输出。
拉曼光谱和相关的自体荧光背景可以实时显示在计算机系统32的显示器33上，可以保存以进行进一步分析。原型系统获得800-1800cm-1波数范围(838-914nm波长范围)的光谱。
拉曼频率可以使用在感兴趣的光谱区具有已知拉曼峰的材料进行校准。例如原型系统使用环己烷、丙酮和硫酸钡的光谱校准至2cm-1的精确度。原型系统的光谱分辨率是8cm-1。也使用标准灯对原型系统中所有波长校准过的光谱进行矫正，用于系统的波长依赖性响应(型号RS-10，得自EG & G Gamma Scientific，San Diego，California，USA)。
通过使用平面光栅的光谱仪的直缝图像具有弯曲的抛物线形状。该图像失真是因为来自沿缝隙长度的不同位置的光线以不同的倾斜程度入射到光栅上。对于具有短聚焦长度的分光计来说，该倾斜度可以导致能够影响检测器测量性能的显著失真。例如，图2A示出当用Hg-Ar灯照射时，通过类似原型系统中所用的一个光谱仪的直100μm缝图像像差。光谱线的曲率在图2A中是明显的。在原型系统中，该曲率可以通过下式描述x＝1.1904E-5y2+1.9455E-4y-0.98613(1)其中x是垂直位置y处线的水平位移。公式(1)中的系数对于原型系统是特定的。
该图像像差表现出对CCD柱的硬件组合(hardware binning)的两种妨碍(1)它降低光谱分辨率；(2)它降低可获得的信噪比(“S/N”)。它还导致波长校准问题。“硬件组合”是在利用前置放大器读出信号之前进行的对利用CCD像素所检测强度的组合。对于限制读出噪音的信号水平，如对于弱的拉曼信号测量值，硬件组合可以与组合在一起的像素数成线性地提高S/N。也可以在信号读出之后使用软件进行组合。但是“软件组合”仅与加在一起的像素值的平方根成比例地提高S/N。因此，对于最大化S/N来说，整条线的完全硬件组合相对于软件组合是优选的。也可以使用硬件和软件组合的组合。
在原型方案中，上面讨论的图像像差通过沿光谱仪26出口处的弯曲线排列光纤束24的58个100μm光纤来矫正。所述弯曲线通过不锈钢柱形件中的激光钻孔形成。所述弯曲线的形状对应于公式(1)中所示的水平位移，但是方向相反。图2B示出了具有用Hg-Ar灯照射的光纤束的光谱仪26输出的所得CCD图像。图2B的每条光谱线中的中央黑点对应于没有受照射的校准光纤27。光谱线基本是直的，指示有效的图像像差矫正。这允许每条完整的CCD垂直线(原型方案中为256像素)被硬件组合，而不损失分辨率或降低S/N。
使用原型系统，可以在少于1秒的时间内获得体内皮肤拉曼光谱。照射功率密度为1.56W/cm2，其小于对于785nm激光的ANSI最大允许的皮肤暴露限1.63W/cm2。
图3中的线100、101和102中的每一个示出了受试者掌的皮肤的拉曼光谱。线100是使用完全软件组合所得的光谱。线101是用组合的硬件和软件组合获得的光谱。线102是使用硬件组合获得的光谱，对于所有的线100、101和102，使用0.5秒的CCD积分时间。线102光谱的S/N可以观察到明显比线101好，比线100更好。1745cm-1处的拉曼峰(来自脂质酯羰基的C＝O伸缩带)在线100中几乎不可见，在线101中显示为有干扰小峰，在线102中显示为平滑明确的峰。
方法概述图4示出根据本发明一个实施方案的方法50。方法50从在框52中获得参照数据开始。参照数据可以是组织样品的光谱。参照样品可以包括已知正常的组织和/或已知癌变或其他异常的组织。使用合适的装置例如上文所述的装置来获得参照光谱。在框54中，产生分类函数。分类函数表现为测试谱的输入特征，产生指示对应于测试谱的组织可能正常还是异常的输出信号。在所示的实施方案中，框54包括进行主成分分析(PCA)(框54A)和进行线性判别分析(LDA)(框54B)。
主成分分析PCA和LDA是已知的数据分析技术。PCA和LDA描述于多种参考资料中，这些参考资料包括Dillion RW，Goldstein M，Multivariate analysismethods and applications，John Wiley and Sons，New York，1984；和Devore JL，Probability and statistics for engineering and the science，Brooks/Cole，Pacific Grove.1992。
在框56中，获得测试光谱。测试光谱可使用合适的装置如上述装置获得。测试光谱是组织区域的谱。组织区域例如可以是已经表征为具有可能指示癌症的外观的皮肤区域。在框58中，将测试光谱与参照数据进行比较。在所示的实施方案中，该比较涉及将框54中产生的分类函数应用于框58A中测试光谱的特征。所述特征包括测试光谱中拉曼成分的特征和测试光谱中背景荧光成分的特征。术语背景荧光用在本文中指包括拉曼光谱峰的波长范围内的荧光。
在框60中提供输出值。输出值指示组织区域正常或异常的可能性。输出值可以包括任意合适的指示信号，包括下列一种或多种·指示组织区域正常或异常可能性的图形或文字值；·警告指示信号，如警告灯；·指示组织区域所分入类别的图形或文字信息；·其他合适的指示信号。
本发明的某些实施方案包括计算机处理器，其执行使处理器执行本发明方法的软件指令。例如，计算机系统中的一个或多个处理器可以通过执行可进入处理器的程序存储器中的软件指令来执行图4的方法。本发明还可提供为程序产品的形式。程序产品可以包括携带计算机可读的信号集的任意介质，所述信号集包含数据处理器执行时使数据处理器执行本发明方法的指令。根据本发明的程序产品可以是广泛的各种形式。程序产品例如可以包括物理介质，如磁性数据存储介质，包括软盘、硬盘驱动器；光学数据存储介质，包括CD ROM、DVD；电子数据存储介质，包括ROM、闪存(flash RAM)等，或传输型介质，如数字或模拟通讯接口。指令可以任选地为编码的、加密的和/或压缩的格式。
应用实施例#1使用涉及同基因的BALB/c小鼠的小鼠Meth-A光纤肉瘤模型作为模型，研究了NIR自体荧光、拉曼和复合拉曼与NIR自体荧光(原谱)谱用于体内组织分类的诊断性能。每个体重为18-28g的7-9周龄雌性BLAB/c小鼠在背下部皮下植入1×106Meth-A光纤肉瘤细胞。肿瘤诱导生长至接种后7天时直径约为5-6mm，位于皮肤表面以下约200μm(图5)。对于光谱研究，刮去小鼠背下部的毛，将小鼠固定在架子上，所述架子收集来暴露小鼠背部皮肤进行光谱测量。通过测量承瘤部位以配对方式从每只小鼠获得光谱，看起来正常的皮肤距离肿瘤的侧缘约为5cm。
从组织获得的800-1800cm-1拉曼位移范围内的原谱包括明显的组织自体荧光成分和较弱的组织拉曼散射成分，如图6A所示。通过相邻的5-点平滑对原谱进行预处理，以减小噪音。将噪音平滑谱中的宽自体荧光背景(图6B)拟合成五次多项式。将基本表现NIR自体荧光的该多项式从原谱中减去，以产生单独的组织拉曼谱(图6C)。产生下列三个数据集·拉曼(即减去背景的光谱)；·单独的背景自体荧光(即5次多项式)；和·原光谱(复合拉曼和NIR背景自体荧光光谱)。
使用这些数据集中的每一个进行统计学分析。
使用全光谱范围(800-1800cm-1拉曼位移)进行主成分分析(PCA)。每个光谱表示为497个强度的集合(PCA变量)。为了消除受试者间和/或内的光谱变化对PCA的影响，将全光谱标准化，从而使光谱的平均值为零，所有光谱强度的标准偏差为1。这种标准化确保主成分(PC)形成正交基础。
标准化的数据集(即拉曼、自体荧光和原光谱)组合成具有波数(或波长)列和每个动物的行的矩阵。在三个标准化的谱数据矩阵上进行PCA，以产生包含更少数目正交变量的PC，所述正交变量占原始光谱总变量中的大部分。每个PC通过称作PC分值的变量与原始光谱相关，所述PC分值表示特定成分相对于基础谱的重量。
使用例如Devore JL，Probability and statistics for engineering and the sciences，Brooks/Cole，Pacific Grove，1992中所述的配对两端(two-sided)学生t检验，利用α为5％表征每种情况的诊断学上显著的PC分值。保留所有统计学显著的PC分值，然后输入到LDA模型中进行组织分类。
LDA确定判别函数线，该判别函数线使组间数据的差异最大化，同时使同一组中成员之间的差异最小化。LDA模型所得的分类函数的性能使用留一交叉确认法(Leave-one-out，Cross Validation)方法以无偏方式估计，该方法例如描述在DillionRW and Goldstein M，Multivariate analysismethods and applications，John Wiley andSons，New York，1984和Lachenbruch P and Mickey RM，Estimation of error rates indiscriminant analysis，Technometrics 1968；101-11中。在该方法中，从数据集中去除一个光谱，使用其余的组织光谱进行包括PCA和LDA的全部算法，以产生新的分类函数。然后使用新的分类函数对保留的光谱进行分类。重复该过程，直至所有保留的光谱都得以分类。该分析的结果指示基于每个模型光谱正确预测状态(即肿瘤和正常)的相对能力。
为了比较PCA-LDA使用三种光谱数据集(拉曼、自体荧光和原光谱)进行组织分类的性能，通过连续改变阈值来生成接受器操作特征性(ROC)曲线，以确定对所有受试者的正确和不正确分类。
所有的多变量统计学分析都使用BMDP统计软件包(Version 7.0，BMDPStatistical Software，Inc.，Los Angeles，CA)中的Factor Analysis and StepwiseDiscriminant Analysis模块进行。
平均起来，原光谱和背景自体荧光光谱对于肿瘤比对于正常皮肤表现出更高的信号强度，而拉曼散射则相反(见图6A、6B和6C)。与正常的周围组织相比，肿瘤组织与自体荧光背景光谱的总体强度增加明显相关(p＜0.0001；对正常和肿瘤组织之间800-1800cm-1范围内逐点光谱强度的平均差进行配对学生t检验)(图6A、6B)，而正常皮肤比肿瘤组织表现出更高的拉曼强度(p＜0.0001；配对学生t检验)(图6C)。然而，不同动物之间的光谱差异则有明显可变性，如反映在平均差光谱SD上(图6D、6E和6F)。这些差异使得不能单独使用总信号强度来区分正常和肿瘤组织。
可以看出图6A的原光谱由叠加在相对强的自体荧光背景上的小贡献的组织拉曼散射组成。肿瘤和正常皮肤的平均体内拉曼光谱(图6C)显示几个显著的拉曼峰为主的类似振动带。例如，在1655cm-1、1445cm-1、1300cm-1、1265cm-1和1004cm-1的拉曼位移处观察到的肿瘤和正常皮肤的拉曼带可假设分别归因于蛋白质酰胺I、CH2弯曲模式、CH2扭曲模式、蛋白质酰胺III和苯环呼吸模式。肿瘤和正常皮肤中观察到的一些拉曼带的试探性归属总结于表1。
表1-拉曼谱带归属
v，伸缩模式；vs，对称伸缩；vas，不对称伸缩；δ，弯曲模式；r，摇摆模式；v，非常强；s，强；m，中等；w，弱；sh，肩峰可以看出800-1800cm-1(即838-914nm)范围内背景自体荧光光谱的形状在肿瘤和正常皮肤之间不同(图6B)。正常和肿瘤组织的曲线比不是平坦的水平线，而是从800cm-1下降至1350cm-1，然后增加至接近1800cm-1(数据未示出)。虽然在正常和肿瘤组织之间的拉曼峰位置没有观察到明显差异，注意到了谱线形状的微小差异，尤其是在1200-1400cm-1和1500-1650cm-1处。PCA/LDA是采用这种谱线形状进行组织分类的一种方式。
图7A-7C分别示出了对于下列光谱从主成分分析(PCA)计算的前5个主成分(PC)载入·拉曼光谱；·背景自体荧光光谱；和·原光谱。
总之，三个光谱数据集的每一个的PC特征不同于其他光谱数据集的PC特征。一些PC特征(图7A、7C)大致对应于拉曼光谱，在与皮肤组织中出现拉曼峰的位置类似的位置上有峰。第一PC说明了光谱数据集内的最大方差(如拉曼光谱为74.6％，自体荧光光谱为79.5％，原光谱为69.9％)，而连续的PC描述说明贡献逐渐小的方差的特征。
对前五个PC分值进行的比较正常和承瘤皮肤的配对两端学生t检验显示只有三个PC(图7A中的PC1、PC2、PC3)、两个PC(图7B中的PC1、PC4)和三个PC(图7C中的PC1、PC3和PC4)对于区分正常和癌变组织来说具有诊断学上的显著性(p＜0.0001)。图8A、8B和8C示出了分别来自下述的正常和肿瘤组织最有诊断学显著性的PC分值的散布图例子·拉曼(PC1和PC2)；·背景荧光(PC1和PC4)；和·原谱(PC1和PC3)。
这些图显示可以使用代表潜在诊断性算法的虚线将所述谱加入正常和肿瘤组。在该情况下，虚线表示可以用作分类函数的两个PC分值的线性组合集。
对于3组不同光谱数据集中的每一个，利用所有显著的PC用LDA来生成分类函数。基于每个数据集中统计学上显著的光谱特征，建立了使用以留一交叉确认法进行PCA-LDA基光谱分类的分类函数。通过利用LDA计算数据集中每组的百分比来确定事后概率。将正常皮肤错分为肿瘤的代价选择为0.50，以获得最大数目的正确分类组织组。
图9A、9B、9C和9D示出了对下述光谱所分别计算的属于正常组和肿瘤组的事后可能性·拉曼；·背景自体荧光；
·原光谱；和·拉曼光谱PC分值和背景自体荧光光谱PC分值的组合。
分类结果显示使用四种类型数据(即拉曼；NIR自体荧光；原光谱；和拉曼光谱PC分值和NIR自体荧光光谱PC分值组合)分别有81.3％(13/16)、93.8％(15/16)、93.8％(15/16)和93.8％(15/16)的肿瘤组织得以正确分类(诊断灵敏性)，同时事后概率小于0.50。诊断特异性为100％、87.5％、100％和100％。对于拉曼光谱、NIR背景自体荧光光谱、原光谱和拉曼光谱PC分值与NIR自体荧光谱光谱PC分值组合来说，总诊断准确率分别是90.6％、90.6％、96.9％和96.9％。值得注意的是包括拉曼和背景荧光成分的原光谱比单独采用拉曼光谱或背景自体荧光光谱具有更好的总诊断准确率。
为了进一步评价和比较用于体内组织分类的来自四种类型数据的PCA/LDA基分类函数的性能，在不同阈值水平上，从图9A-9D中的散布图生成接收器操作特征(ROC)曲线(图10)。图10示出了使用拉曼光谱、NIR背景自体荧光光谱、原光谱和拉曼光谱PC分值与NIR自体荧光谱光谱PC分值组合的判别结果。ROC曲线的对比评价表明单独的NIR自体荧光或拉曼都可以高诊断灵敏性和特异性地用于体内组织诊断。但是，来自四种类型数据的分类函数中，似乎来自原光谱(其为拉曼和NIR荧光光谱成分的复合物)的分类函数或来自组合的拉曼光谱PC分值与NIR自体荧光谱光谱PC分值的分类函数可以给出用于体内组织分类的最有效诊断能力。这通过特异性和灵敏性的提高来说明。ROC曲线下的积分面积对于NIR背景自体荧光光谱、拉曼光谱、原光谱和拉曼光谱PC分值与NIR自体荧光光谱PC分值组合的分类函数分别是0.951、0.963、0.994和1.0。结果表明含有拉曼特征和自体荧光特征的原光谱可以比单独采用拉曼或NIR背景自体荧光特征峰产生更好的诊断准确率。
多变量统计分析允许通过仅保留描述组间差异的那些主成分来进行目标诊断。对于组织学诊断最有用的信息仅分布在几个PC上。对于LDA模型，判别信息可以包含在前3-4个PC中。显著PC分值的PCA图(见图8A-8C)表明组织NIR自体荧光和拉曼光谱的组合与病理分类良好相关。
描述光谱数据中大部分变化的PC没必要提供最大的诊断有用性。例如，对于背景自体荧光数据集，最显著PC之一(PC4)仅描述了总变化的0.33％。但是本发明人不希望受任何具体操作理论的约束，这表明组织化学中微小改变先于或伴随组织的明显病理学改变。在拉曼和原光谱数据集中也发现了仅解释非常小量总变化但具有诊断学显著性的其他PC。
PCA和LDA的组合对于提供基于背景自体荧光和拉曼光谱特征的、具有高诊断灵敏性和特异性的诊断性组织分类算法是有力的统计学工具。
虽然本发明人不希望拘泥于任何特定的操作理论，但是通过采用包含自体荧光和拉曼特征的原光谱获得的有利判别结果可以解释如下以前NIR自体荧光被认为是测量的原光谱中没有用的背景信号，但是本发明人了解到，NIR自体荧光提高区分肿瘤和正常组织的能力，可以用于确认组织中NIR荧光团的化学身份。使用PCA/LDA将对组织内物质振动模式作出响应的拉曼光谱与自体荧光信号的组合可以是阐明组织的生化结构和组成的有力工具，因此可以提供用于组织诊断的有用诊断能力。
使用NIR拉曼和NIR背景荧光光谱作为诊断工具相对于需要用UV光线照射受试者的诊断工具来说具有优点。和UV激发光不同，NIR光是不致癌的，用于组织诊断是安全的。另外，所用入射光和测量的组织自体荧光和拉曼光都位于NIR波长处时，光可以比其他波长处的光更深地穿透组织(如最多约1mm)。因此，NIR自体荧光和拉曼光谱有潜力用于非侵入性体内检测位于组织表面下的病变。例如，可以通过NIR自体荧光成像检测病变，然后通过拉曼光谱表征。
应用实施例#2如图11所示，一些拉曼光谱特征在正常至良性(复合痔)和恶性(黑素瘤)皮肤病之间不同。曲线104是非洲血统受试者掌侧前臂正常皮肤的拉曼光谱。曲线105是良性复合色素痔的拉曼光谱。曲线106是恶性黑素瘤的拉曼光谱。曲线107是临近曲线106黑素瘤的正常皮肤的拉曼光谱。可以看出这些曲线之间的明显差异。1445cm-1峰在恶性黑素瘤光谱106中不可见，但是可以在正常黑色皮肤光谱104和良性复合痔光谱105中看到。1269cm-1峰存在于恶性黑素瘤光谱106和正常黑色皮肤光谱104中，但是不存在于良性复合痔光谱105中。这些曲线特征可以和形成原光谱中这些曲线背景的NIR自体荧光特征一起使用，这些曲线可以在根据本发明的分类方法中从所述原光谱提取。
应用实施例#3本发明的一些方法提供多个分类函数。这些方法涉及选择最适合于分类所涉及的组织区域的一个分类函数。例如，分类函数可以包括适用于以下一种或多种情况的分类函数·多个不同的病状(例如基底细胞癌(BCC)、鳞状细胞癌(SCC)、黑色素瘤、光化性角化病、脂溢性角化病、皮脂腺增生、角化棘皮瘤、斑痣、黑色素痣、结构不良痣和蓝痣中的两种或多种)；·多种不同的组织类型(例如皮肤、肺组织、其他上皮组织如支气管树、耳、鼻和喉、胃肠道、子宫颈等中的两种或多种)；·多种不同的皮肤类型(可以提供一个分类函数用于具有轻微色素沉积皮肤的受试者，提供另一个分类函数用于具有更深的黑色素沉积的受试者)；和·相同常见组织类型的身体上的多个不同部位(例如，如下所述，可以提供不同的分类函数为受试者身体的不同区域进行皮肤分类)。
在提供多个分类函数时，每一个分类函数可以来自分类函数所要应用的组织类型/病状/组织部位的参照数据集。根据本发明的装置可以包括允许用户选择多个分类函数中合适的一个的用户界面。
本发明人已经了解到，在相同的受试者中，皮肤的拉曼光谱对于不同身体部位通常明显不同。在本发明的一些实施方案中，分类函数根据待研究组织所处的身体部位来选择。拉曼光谱测量在50个正常志愿者各自的25个身体部位的每一处进行。图12示出拉曼光谱测量的脂质-蛋白质拉曼谱带的比例。可以看出这些比例根据身体部位而簇集。如图13所示，给定身体部位的皮肤拉曼信号的受试者间差异相当小，至少对于具有轻微色素沉积皮肤的患者相当小。
通过提供每个对应于不同身体部位的多个分类函数，该观察结果可以应用于本发明的实践。可以使用在相应身体部位获得的参照拉曼和背景荧光光谱来产生各个不同的分类函数。合适的分类函数可以基于从中获得测试光谱的身体部位进行选择。举例来说，可以对多个不同身体区域提供不同的分类函数，所述不同的身体区域例如包括手；头；臂和躯干；和股。也可以提供从其他皮肤区域如足、腿和指甲的参照数据产生的分类函数。
应用实施例#4患者具有诸如结构不良痣的症状。该症状导致患者身体的各个部位有许多痔。患者看医生时，医生需要确定是否需要对痔进行活组织检查，如果需要，对哪些进行。在所有的痔中，痔足够多，使得对所有痣进行活组织检查是不希望的或不实际的。
医生获得待研究的每个痔的NIR光谱。NIR光谱包括拉曼特征和NIR荧光特征。例如可以用上述装置和图1所示装置获得谱。例如可以将装置的探头依次放置到每个痔上，然后通过激活控制器来引发光谱的获得。例如，医生可以在探头位于痔上时按按扭，然后使探头保持在痔上，直至获得光谱。当获得光谱时，装置可以产生信号，如可听到的蜂鸣声。如果装置的设计考虑到待研究痔的光谱中一个或多个拉曼和/或NIR背景自体荧光特征和患者正常组织的相应特征之间的差异，那么医生还从患者表现正常的一部分皮肤获得光谱。
装置包括或连接至能够将分类函数应用于从患者各部位获得的光谱的计算机系统。在将分类函数应用于获得的光谱之前，医生可以使用计算机系统提供的界面来选择适合对患者的结构不良痔进行分类的分类函数。界面可促使医生回答问题，以按照决策树实现选择合适的分类函数。作为替代方案，界面可以允许医生直接选择分类函数，或输入数据，计算机可以基于该数据选择最合适的分类函数。
计算机系统将分类函数应用于每个获得的光谱。这可以在获得一个光谱之后立即进行和获得下一个光谱之前进行，或以间歇方式在获得多个光谱后进行。对于每个光谱，计算机系统提供表明分类函数是否指示相应痔可能正常或可能异常的输出信号。输出信号可以包括可见的或可听见的信号。输出信号可以是简单的输出信号，其简单地指示光谱是否指示正常组织或提示组织异常。作为替代方案，输出信号可以包括数字和/或图形信息，这些信息指示从中获得光谱的组织是正常还是异常的可能性。
医生可以使用输出信号确定患者的痔，如果异常，则应该通过活组织检查或其他程序进行更深入研究。
应用实施例#5怀疑患有肺癌的患者进行气管镜检查。气管镜配有能够获得具有拉曼和背景荧光特征的光谱的内窥探头。合适的探头例如描述于Zeng的US10/761,703和PCTCA/04/00062中。医生将气管镜的尖端靠近感兴趣的组织部位附近，并且触发装置以获得光谱。装置将分类函数应用于光谱。分类函数适合于肺组织。分类函数可以产生自包括正常肺组织和已知癌变的肺组织的参照光谱集。装置提供输出信号。医生可以将输出信号和通过气管镜获得的图像一起用来选择取活组织检查样品的位置。
应用实施例#6在有些情况下，测定组织的黑色素含量是有用的。发明人已经确定黑色素在大致1380-1400cm-1和1580-90cm-1的拉曼位移处具有宽的拉曼峰。这些峰可以在包含黑色素的人头发的拉曼光谱中检测到(见图18)。这些峰可以用于测定组织的黑色素含量。
图11的曲线104、105和106是体内所取组织的拉曼光谱。这些曲线表现出了这些峰。图14示出了黑色素的拉曼数据。
富含皮肤黑色素的正常皮肤的光谱(曲线104)和色素性病变的光谱(曲线105和106)包括1368cm-1和1572cm-1处附近的两个强而宽的谱带，与图14黑色素样品中观察到的拉曼模式非常相似。此外，体内皮肤拉曼光谱表现出蛋白质和脂质的振动带，其在由于黑色素而显得黑的各种皮肤中不同。例如，可能对应于脂头基团的C＝O伸缩的1742cm-1处较弱振动模式存在于高度色素沉积的皮肤病变中，而其他谱带明显减弱如1654cm-1处的v(C＝O)酰胺I谱带，1445cm-1处的剪式δ(CH3)和δ(CH2)，1301cm-1处的CH2形变，和1269cm-1处的v(CN)和δ(NH)酰胺II谱带。1445cm-1峰在恶性黑素瘤谱中消失，但是在良性复合痔光谱中观察到，而1269cm-1峰则相反。两个黑色素拉曼谱带的这些差异以及峰位和带宽可以包括为特征，用于本发明实施方案中的非侵入性黑素瘤检测。
在本发明的一些实施方案中，将1368cm-1和/或1572cm-1处黑色素峰直接或间接用做感兴趣组织样本中黑色素浓度的指示信号。除了拉曼和背景荧光光谱的其他特征之外，黑色素浓度可以用作组织分类的特征。这些峰的大小可以通过减去背景而确定。这可以通过拟合背景函数而实现。拟合函数应该是低次函数，如二次多项式，因为这些峰太宽，较高次的拟合函数将拟合峰本身。
黑色素浓度和NIR背景荧光有关系。虽然黑色素在可见谱带范围内仅非常弱地发荧光，但黑色素在NIR波长范围内非常强地发荧光。对来自Sigma的合成和提取的黑色素产品的测量证实了强的NIR荧光发射(见图17)。
1368cm-1和1572cm-1拉曼谱带也可以独立地用于测定组织的黑色素含量的方法。在这种方法中，这些峰之一或二者的强度得以测定。例如这可以通过如上所述从峰中减去背景来进行。
除非另外指明，当成分(如软件模块、处理器、组件、装置、电路)如上称呼时，所指成分(包括提到“装置”)应理解为包括成分的等同物，执行所述成分功能的任意成分(即功能等同物)，包括执行本发明所示示例性实施方案功能但结构与所公开结构不等同的成分。
在前述公开内容的基础上，可以在本发明的实践中进行许多改变和改进，而不偏离其实质或范围，这对于本领域技术人员是显而易见的。例如·根据本发明的方法可以任选地考虑拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征以外的特征。例如，漫反射特征、紫外或可见荧光特征也可以包括在分析中。
·任意合适的数学技术可以用于从参照数据衍生合适的分类函数。这些技术可以包括判别函数分析、逻辑回归、多次回归或其他合适的统计学分析技术。
·虽然上面给出的一些实施例涉及对皮肤进行分类，但是本发明不限于皮肤组织，而可以等同地用于其他组织，包括内表面器官的上皮组织，如支气管树，耳、鼻和喉，胃肠道，子宫颈等。光纤探头可以和内窥镜一起使用，以最方便地获得内部组织的拉曼和NIR背景荧光光谱。适于通过内窥镜获得拉曼和NIR背景荧光光谱的小型光纤探头例如描述于名称为“In vivo Raman endoscopic prob and methods of use”的国际专利申请No.PCT/CA04/00062和相应的美国专利申请No.10/761,703中。
·不获得含拉曼和背景荧光特征的基本连续光谱，本发明可以通过获得多个离散的波长或多个波长范围的光谱信息来实施。
因此，本发明的范围应认为和权利要求中限定的内容一致。
权利要求
1.一种表征组织的方法，该方法包括在第一波长范围内获得组织的拉曼光谱的特征；在与第一波长范围重叠的第二波长范围内获得组织的背景荧光光谱的特征，其中在第一波长范围内，背景荧光光谱是拉曼光谱的背景；和至少基于拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征来表征组织。
2.根据权利要求1的方法，其中第一和第二波长范围包括近红外波长。
3.根据权利要求1或2的方法，其中第一和第二波长范围相同。
4.根据权利要求1-3中任意一项的方法，其中第一和第二波长范围各自包括约800nm-约1000nm的波长。
5.根据权利要求1-4中任意一项的方法，其中获得背景荧光光谱和拉曼光谱的特征包括用基本单色的入射光照射组织区域以及通过在多个红外波长处检测从组织背散射的光而获得原光谱。
6.根据权利要求5的方法，其中所述拉曼特征包括相对于入射光波长的拉曼位移为1445cm-1处的峰。
7.根据权利要求5或6的方法，其中所述拉曼特征包括相对于入射光波长的拉曼位移为1269cm-1处的峰。
8.根据权利要求5-7中任意一项的方法，其中所述拉曼特征包括相对于入射光波长的拉曼位移为约1200cm-1-约1400cm-1的谱带内的特征。
9.根据权利要求5-8中任意一项的方法，其中所述拉曼特征包括相对于入射光波长的拉曼位移为约1500cm-1-约1650cm-1的谱带内的特征。
10.根据权利要求1的方法，其中获得背景荧光光谱的特征包括用红外光照射组织以及通过在多个红外波长处检测从组织背散射的光而获得原光谱。
11.根据权利要求10的方法，其中获得拉曼光谱特征包括从原光谱提取拉曼光谱特征。
12.根据权利要求11的方法，其中从原光谱提取拉曼光谱特征包括将背景拟合函数与原光谱拟合以产生拟合的背景函数，并从原光谱减去拟合的背景函数。
13.根据权利要求12的方法，其中所述拟合的背景函数包含多项式。
14.根据权利要求13的方法，其中所述拟合的背景函数包含五次多项式。
15.根据权利要求12的方法，其中获得背景荧光光谱的特征包括获得拟合的背景函数的特征。
16.根据权利要求10的方法，其中至少基于拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征表征组织包括对原光谱应用来自主成分分析的分类函数。
17.根据权利要求1的方法，其中至少基于拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征表征组织包括对一个或多个数据集应用来自主成分分析的分类函数，所述一个或多个数据集共同包括拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征。
18.根据权利要求17的方法，其中所述一个或多个数据集包括一个或多个拉曼光谱PC分值和一个或多个背景荧光光谱PC分值。
19.根据权利要求17的方法，其中应用分类函数包括对一个或多个数据集的数据应用预定的主成分。
20.根据权利要求17的方法，其中所述组织是受试者部分身体的皮肤，该方法包括从各自对应不同身体区域的多个分类函数选择对应于受试者身体部位的分类函数。
21.根据权利要求20的方法，其中所述多个分类函数包括对应于两个或多个下列身体部位的分类函数头、躯干、手和臂或股。
22.根据权利要求20的方法，其中所述多个分类函数包括对应于两个或多个下列身体部位的分类函数头、躯干、手、臂或股、足、腿或指甲。
23.根据权利要求1的方法，其中表征组织包括将拉曼光谱特征和背景荧光特征作为输入信号应用于神经网络。
24.根据权利要求1-23中任意一项的方法，其中组织区域是皮肤区域。
25.根据权利要求1-23中任意一项的方法，其中组织区域包括肺组织。
26.根据权利要求1-23中任意一项的方法，其中组织区域包括上皮组织。
27.根据权利要求26的方法，其中上皮组织包括受试者胃肠道的衬层组织。
28.根据权利要求26的方法，其中上皮组织包括受试者耳、鼻或喉的衬层。
29.根据权利要求1-23中任意一项的方法，其应用于筛选皮肤癌。
30.根据权利要求1-23中任意一项的方法，其应用于筛选选自下列疾病的一种或多种疾病基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑素瘤和光化性角化病。
31.根据权利要求1-23中任意一项的方法，其应用于筛选脂溢性角化病、皮脂腺增生、角化棘皮瘤、斑痣、黑色素痣、结构不良痣和蓝痣中的一种或多种。
32.根据权利要求6和7之一的方法，其中表征组织包括指示组织是否可能受黑素瘤影响。
33.根据权利要求6、7和33中任意一项的方法，其中表征组织包括指示组织是否可能是复合痔组织。
34.根据权利要求1-33中任意一项的方法，其中拉曼和自体荧光光谱的特征是利用体内组织获得的。
35.根据权利要求34的方法，其中所述组织位于组织表面的下方，并且获得拉曼和自体荧光光谱的特征包括在光通过上面的组织后检测来自组织的光。
36.根据权利要求1-35中任意一项的方法，除了基于拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征之外，还包括基于紫外荧光光谱来表征组织。
37.根据权利要求1-36中任意一项的方法，除了基于拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征之外，还包括基于可见荧光光谱来表征组织。
38.根据权利要求1-37中任意一项的方法，除了基于拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征之外，还包括基于漫反射光谱表征组织。
39.根据权利要求1-38中任意一项的方法，除了基于拉曼光谱特征和背景荧光光谱特征之外，还包括基于光散射光谱来表征组织。
40.根据权利要求1-39中任意一项的方法，包括获得受试者正常组织对照区的拉曼光谱和背景荧光光谱中至少其一的特征；其中表征组织部分地基于组织的拉曼与背景荧光光谱的一个或多个特征和对照区域的对应的拉曼与背景荧光光谱的一个或多个特征之间的差异。
41.测定组织黑色素含量的方法，该方法包括获得组织的光谱，所述光谱包括拉曼位移为约1368cm-1和1572cm-1的第一峰和第二峰；减去光谱的背景以产生拉曼光谱；根据拉曼光谱中第一和第二宽峰的强度计算组织的黑色素含量。
42.根据权利要求41的方法，其中从拉曼光谱减去背景包括将函数与光谱拟合和从光谱减去拟合的函数。
43.根据权利要求41的方法，其中拟合的函数是二次多项式函数。
44.一种用于表征组织的装置，该装置包括光源，用于照射组织区域；光学系统，其设计用于收集来自组织区域的背散射光，并将之引导至分光计；数据处理器，其连接以接收来自分光计的背散射光的光谱信息；可进入数据处理器的至少一个分类函数，所述分类函数响应输入信号而产生分类结果，所述输入信号包括有关组织光谱中至少一个拉曼特征和至少一个背景自体荧光特征的信息；其中所述数据处理器设计用来将分类函数应用于光谱信息，以获得相应的分类结果，并基于相应的分类结果产生输出信号，所述输出信号指示组织区域是否可能包括异常组织。
45.根据权利要求44的装置，包括多个分类函数和允许用户选择合适的一个分类函数的机构。
46.包括本文所述任意新的、有用的和创造性步骤、操作、步骤和/或操作的组合，或步骤和/或操作组合的亚组合的方法。
47.包含本文所述任意新的、有用的和创造性特征、装置、特征和/或装置的组合，或特征和/或装置的亚组合的装置。
全文摘要
利用拉曼光谱和背景荧光光谱的特征对组织进行分类的方法和装置。所述光谱可以在近红外波长处获得。参照光谱的主成分分析和线性判别分析可以用于获得接受受试组织的拉曼和背景荧光光谱特征的分类函数，并产生与受试组织异常可能性相关的指示。所述方法和装置可以用于筛选皮肤癌或其他疾病。
文档编号G01N33/483GK1890557SQ200480035316
公开日2007年1月3日 申请日期2004年11月26日 优先权日2003年11月28日
发明者曾海山, 雷德慰, 黄志伟, 大卫·I·迈克林 申请人:Bc肿瘤研究所