本发明涉及淌度电泳技术领域，具体地说，涉及一种基于淌度电泳测定物质尺寸的方法。
背景技术：
生物大分子与生命活动息息相关，对大分子物质结构的解析有助于了解其功能及作用机制。常见的结构解析技术包括x-射线晶体衍射、核磁共振谱和低温电子显微镜等。使用上述种技术分析结构时需要首先得到高纯度较大量的样品，前期处理步骤较为繁琐，并且数据收集后的重构也面临数据量大等问题。因此需要一种灵敏度较高且具有复杂组分结构分析能力的方案，此外利用辅助手段首先测定物质的基本尺寸和构象可有助于后续高分辨结构的预测与表征。
技术实现要素：
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种基于淌度电泳测定物质尺寸的方法，操作简便，分析速度快，可以与混合物的分离同时进行。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于淌度电泳测定物质尺寸的方法，，包括：
注射泵向毛细管的进样端注入缓冲液并持续第一时间段，之后进样泵向所述毛细管的进样端注入样品溶液，进样完成后所述注射泵再次向所述毛细管的进样端注入缓冲液，同时在所述毛细管的两端之间施加分离电压；
检测器在所述毛细管上的检测窗口进行检测，获得中性标记物的出峰时间tm与样品的出峰时间t；
根据
将所述样品的出峰时间t匹配到所述样品等效球体半径特征曲线，得到对应的所述样品离子等效球体半径r；
根据所述离子等效球体半径r，获得样品椭圆重构限制曲线；
采用分子模拟获得所述样品的可能构象库并进而得到可能构象的长宽比和等效迎风半径；
将所述可能构象的长宽比和所述等效迎风半径匹配到所述样品椭圆重构限制曲线，获得实验条件下样品的构象分布。
在一种可选的实施方式中，所述采用分子模拟获得所述样品的可能构象库并进而得到可能构象的长宽比和等效迎风半径，具体包括：
将仿真条件设定为与所述实验条件一致，采用分子动力学模拟仿真得到所述样品的可能构象库；
根据所述样品的可能构象库的x、y、z三个方向的回转半径得到可能构象的椭圆特征参数；
基于所述椭圆特征参数得到所述可能构象的长宽比和所述等效迎风半径。
在一种可选的实施方式中，所述方法还包括：
确定任意可能构象在y方向上与所述样品椭圆重构限制曲线间的距离
确定di或δdi最小的可能构象为实验条件下样品的构象分布。
在一种可选的实施方式中，采用分子动力学模拟仿真的仿真时间为100ns。
在一种可选的实施方式中，所述检测器为光学检测器或质谱检测器。
本发明所述的基于淌度电泳测定物质尺寸的方法，注射泵向毛细管的进样端注入缓冲液并持续第一时间段，之后进样泵向毛细管的进样端注入样品溶液，进样完成后注射泵再次向所述毛细管的进样端注入缓冲液，同时在毛细管的两端之间施加分离电压；检测器在毛细管的检测窗口进行检测，获得中性标记物的出峰时间tm与样品的出峰时间t；获得样品等效球体半径特征曲线并进而得到样品离子等效球体半径r；根据样品离子等效球体半径r获得样品椭圆重构限制曲线，进而获得实验条件下样品的构象分布。本发明的技术方案通过液相淌度电泳分离溶液中的混合物，同时在检测窗口进行检测从而获取到溶液中物质的精细尺寸、结构信息，实现了在复杂样品分离的过程中同步进行溶液中物质尺寸结构的检测。本发明的技术方案检测精度高，操作简便，分析速度快，实现了混合样品分离和多组分结构一次性重构分析。
附图说明
图1为本发明所述基于淌度电泳测定物质尺寸的方法的流程图；
图2为本发明提供的一种装置示意图；
图3为三种分离条件下理论等效半径与迁移时间的关系曲线；
图4为通过本发明所述方法测定生长抑素尺寸的分析图；
图5示出了通过仿真得到的生长抑素10种构象的打分顺序图；
图6为通过本发明所述方法测定血管紧张素i尺寸的分析图；
图7为通过本发明所述方法测定缓激肽尺寸的分析图；
图8为通过本发明所述方法测定混合多肽尺寸的分析图；
图9为通过本发明所述方法测定混合多肽的分子动力学模拟图。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
离子迁移质谱是气相下离子淌度分离技术与质谱联用的一种新型二维质谱分析技术。离子迁移速率的测量利用电场梯度和横向流动的缓冲气体，迁移速率依赖于离子的碰撞截面和带电状态。可实现气相中复杂样品快速分离检测，也可获得在该气相条件下物质的结构信息。毛细管电泳技术是在液相环境中以毛细管为分离通道，离子在电场驱动下，依据其各自淌度(单位电场强度下带电粒子的平均电泳速度)不同进行高效、快速分离技术。
液相淌度理论是在气相离子迁移谱的基础之上结合电泳分离技术而提出的。本发明实施例中，基于淌度电泳分离溶液中的带电物质并进行物质尺寸测定，缓冲液体由流动注射泵提供，分离通道为毛细管，通过电场与流体阻力相互作用而实现分离，得到淌度电泳谱图。本发明实施例提供了一种基于淌度电泳测定物质尺寸的方法，如图1所示，该方法包括：
101、注射泵向毛细管的进样端注入缓冲液并持续第一时间段，此后进样泵向毛细管的进样端注入样品溶液，进样完成后注射泵再次向毛细管的进样端注入缓冲液，同时在毛细管的两端之间施加分离电压。
首先明确淌度电泳实验条件。淌度电泳方案可在商业化微流分析仪器(如毛细管电泳仪)上实现，也可以在自行搭建的简易分离通道上实现。通常使用分离毛细管作为分离通道。可以使用蠕动泵作为注射泵向毛细管的入口段注入恒定速度的缓冲液流，进样泵向毛细管的入口段注入样品溶液。高压电源接电极提供分离电压，并且在毛细管上设置一检测窗口，放置检测器测定样品出峰时间等。第一时间段具体为0.1分钟至10分钟。
毛细管可采用各种内、外径毛细管。分离蛋白质时，需使用涂层毛细管。直流高压电源的输出范围0～+/-30000v，高压电源可通过导线与电极装置相连。注射泵，提供0-1000mbar恒定压力或等效流量。检测器可为光学检测器或质谱检测器等。
本发明的一种操作方式为：注射泵以恒定压力(1000mbar)将缓冲液注入毛细管中，冲洗5min，待信号基线稳定后，暂停冲洗。进样泵再用恒定压力(50mbar)进样一定量样品，暂停进样。注射泵以使用恒定压力注入分离缓冲液，同时施加分离电压。采用光学检测器检测信号，分别记录中性标记物出峰时间tm与样品出峰时间t，结束淌度电泳分析。此处所采用的缓冲液可以为一定体积比的甲醇水溶液(含0.1％甲酸)。光学检测器具体可以为紫外分光光度计。
102、检测器在毛细管的检测窗口进行检测，获得中性标记物的出峰时间tm与样品的出峰时间t。
103、根据
其中在实验条件下，
微流流道中(如毛细管)的混合样品，在平流不可压缩流体牵引下随载流做匀速运动，各组分平衡时速度与载流速度vcarrier一致。如果混合样品可解离成为离子，通过施加电场使之受到电场力(fe)作用产生相对与流体的运动，此过程导致解离组分受到阻力(ff)，则两种作用可分别表示为：
fe＝qe，ff＝6πηrpv(公式1)
其中e为电场强度，q为样品离子带电量，η为溶液粘滞阻力系数，rp为样品等效球体半径，v为样品相对流体运动速度。
当电场力与阻力达到平衡时(即fe＝ff)，离子与载流相对速度v恒定，此时离子表观速度(ve)为：
ve＝vcarrier+v(公式2)
表观速度与离子带电性质与等效球体半径相关，不同离子的表观速度有所差异，在通过一段长度为l分离通道后，所用时间t不同，即实现分离。
根据牛顿力学原理和电泳原理，样品离子迁移距离y与样品离子迁移时间t、样品离子等效球体半径r之间有对应关系。
具体的，离子运动满足微分方程：
y″[t]+hy′[t]＝k(公式3)
其中：
求解公式3的微分方程，可获得离子运动解析表达式：
其中y为离子运动位移，在实验条件下u、l、lreal、m、q、η均为已知量，tm、t可以从实验淌度电泳图获得，将以上量代入公式4中，可以得到样品等效球体半径特征曲线，如图3所示。
104、将样品的出峰时间t匹配到样品等效球体半径特征曲线，得到对应的样品离子等效球体半径r。
不同样品的样品等效球体半径特征曲线不同。当实验条件的参数发生变化时，需重新获取样品等效球体半径特征曲线。
特定实验条件下，样品等效球体半径特征曲线的有效范围不同，目标样品离子位于曲线拐弯处的动态范围越宽，分辨率越高。
105、根据样品离子等效球体半径r，获得样品椭圆重构限制曲线。
椭球在低雷诺数流体中运动形式与球体相似。设均匀椭球在x、y、z三个方向的半轴长分别为a、b、c。当椭球退化为回转椭圆(如长球或扁球)，即a、b、c中任意两者相等情况，可以在简单计算的条件下获得更多的生物样品结构信息。
如假设流体平行于回转轴，且b＝c，定义长宽比
根据公式5和公式6，将每次液相淌度测定的等效球体半径r带入，由此获得样品椭圆重构限制曲线(如图4c)，将样品结构解析度拓展到二维。
106、采用分子模拟获得样品的构象库并进而得到构象的长宽比和等效迎风半径。
为了明确实验条件下样品的构象在椭圆重构限制曲线上的分布，可采用分子模拟获得进一步数据。
具体的，将仿真条件设定为与实验条件一致，采用分子动力学模拟仿真得到样品的可能构象库。比如可以采用gromacs程序包进行分子动力学模拟。采用分子动力学模拟仿真的仿真时间可以为100ns。
此后，根据样品的可能构象库的x、y、z三个方向的回转半径得到可能构象的椭圆特征参数。
基于椭圆特征参数得到可能构象的长宽比和所述等效迎风半径。
根据公式：
其中mi是原子i的质量，ri是原子i所处的位置，rix是原子i的在x方向上的位置，riy是原子i的在y方向上的位置，riz是原子i的在z方向上的位置，可获得这些构象的回转半径(radiusofgyration，rg)和各个方向上的回转半径(rgx，rgy，rgz)。
又有各个方向上回转半径满足：
通过求解三元方程组(公式11、公式12、公式13)可以计算出这些可能构象的椭圆特征参数a、b、c，进一步求算出可能构象的长宽比
107、将构象的长宽比和等效迎风半径匹配到样品椭圆重构限制曲线，获得实验条件下样品的构象分布。
将φ与rp带入到椭圆重构限制曲线中，获得实验条件下样品的构象分布。(如图4g)
进一步的，为了得到更符合实际情况的三维构象，本发明实施例提供的基于淌度电泳测定物质尺寸的方法还进一步包括：
确定任意可能构象在y方向上与样品椭圆重构限制曲线间的距离d
设定打分标准为当d或δd越小，对应的构象越符合实际情况。
确定d或δd最小的可能构象为实验条件下样品的构象分布。
本发明技术方案提出的基于淌度电泳测定物质尺寸的方法，通过实验与仿真模拟相结合的方式，实现了在溶液条件下分子构象的预测。可广泛应用到生物大分子结构的测定中，拓展了生物大分子结构的测定方法。本方法可在商业化毛细管电泳仪上进行，也可自行搭建设备上实现。本发明实施例实现了混合样品分离和多组分结构一次性重构分析，分析成本较低，分析速度快，易于操作。本方法可以实现生物分子混合样品的基本结构信息获得，为后续高分辨结构预测与分析提供指导，可节约精细结构解析中的时间和资金成本。
下面结合具体实施例对本发明实施例的基于淌度电泳测定物质尺寸的方法进行说明。
实施例1
淌度电泳测定生长抑素(somatostatin)的结构。
淌度电泳实验条件：样品为1mg/ml的生长抑素，缓冲液为50％甲醇水溶液(w:w含0.1％甲酸，缓冲液ph3.0)，加入0.5％(w:w)苯酚作为中性标记物，混合均匀。毛细管管长50cm，进样端到检测窗口的距离为40cm，管内径75μm，214nm波长紫外分光光度检测。操作方式为：采用1000mbar气压通入缓冲溶液180s冲洗毛细管内管道；采用50mbar气压进样5s；在毛细管两端施加气压60mbar，分离电压为-20kv。实验结果如图4(a)所示。根据实验条件下样品等效球体半径特征曲线(公式4)可得生长抑素的等效球体半径r，结果如图4(b)所示。将等效球体半径r代入公式5，公式6，可以获得实验条件下生长抑素椭圆重构限制曲线，即得到φ与c的关系式，结果如图4(c)所示。
分子模拟条件：通过数据库获得生长抑素在溶液条件下可能构象，如图4(d)所示。计算这些构象在三个方向上的回转半径，计算结果如图4(e)，进一步得出这些可能构象的椭圆特征参数a、b、c，计算结果如图4(f)。将分子模拟仿真得到的可能构象参数代入实验计算得到的生长抑素椭圆重构限制曲线，如图4(g)。进一步的，如图5所示，以d为依据对生长抑素的10种构象进行打分。d越小，构象越符合实际情况。
实施例2
淌度电泳测定血管紧张素ⅰ(angiotensini)的结构。
淌度电泳实验条件：样品为1mg/ml的血管紧张素ⅰ，缓冲液为50％甲醇水溶液(w:w含0.1％甲酸，缓冲液ph3.0)，加入0.5％(w:w)苯酚作为中性标记物，混合均匀。毛细管管长50cm(进样端到检测窗口的距离为40cm)，管内径75μm，214nm波长紫外分光光度检测。操作方式为：采用1000mbar气压通入缓冲溶液180s冲洗分离通道；采用50mbar气压进样5s；在分离通道两端施加气压60mbar，分离电压为-20kv。重复此操作5次，实验结果如图6(c)所示，5组平行试验的重复性良好。根据实验条件下等效球体半径特征曲线(公式4)计算血管紧张素i的等效球体半径r，计算结果为
分子模拟条件：通过分子模拟方法获得血管紧张素ⅰ在该溶液条件下可能的构象，采用gromacs2016.1程序包进行仿真实验，蛋白质力场采用amber99sb-ildn，ambertools16用于构建多肽初始结构，设定多肽为ph＝3时解离状态，抗衡离子为甲酸负离子。甲醇水(1:1)作为溶剂盒子，溶剂盒子尺寸约为
实施例3
淌度电泳测定缓激肽(bradykinin)的结构。
淌度电泳实验条件：样品为1mg/ml的缓激肽，缓冲液为50％甲醇水溶液(w:w含0.1％甲酸，缓冲液ph3.0)，加入0.5％(w:w)苯酚作为中性标记物，混合均匀。毛细管管长50cm(进样端到检测窗口的距离为40cm)，管内径75μm，214nm波长紫外分光光度检测。操作方式为：采用1000mbar气压通入缓冲溶液180s冲洗分离通道；采用50mbar气压进样5s；在分离通道两端施加气压60mbar，分离电压为-20kv。重复此操作5次，实验结果如图7(c)所示，5组平行试验的重复性良好。根据实验条件下等效球体半径特征曲线(式4)计算缓激肽的等效球体半径r，计算结果为
分子模拟条件：通过分子模拟方法获得缓激肽在该溶液条件下可能的构象，采用gromacs2016.1程序包进行仿真实验，蛋白质力场采用amber99sb-ildn，ambertools16用于构建多肽初始结构，设定缓激肽为ph＝3时解离状态，抗衡离子为甲酸负离子。甲醇水(1:1)作为溶剂盒子，溶剂盒子尺寸约为
实施例4
淌度电泳测定混合多肽样品的结构。
淌度电泳实验条件：样品为1mg/ml的缓激肽，1mg/ml的生长抑素，缓冲液为2mmnacl水溶液(ph7.0)，加入0.5％(w:w)苯酚作为中性标记物，混合均匀。毛细管管长50cm(进样端到检测窗口的距离为40cm)，管内径75μm，214nm波长紫外分光光度检测。操作方式为：采用1000mbar气压通入缓冲溶液180s冲洗分离通道；采用50mbar气压进样5s；在分离通道两端施加气压60mbar，分离电压为-25kv。重复此操作5次，实验结果如图8(a)所示，5组平行试验的重复性良好。根据实验条件下等效球体半径特征曲线(式4)计算缓激肽的等效球体半径r，计算结果为
分子模拟条件：通过分子模拟方法获得缓激肽在该溶液条件下可能的构象，采用gromacs2016.1程序包进行仿真实验，蛋白质力场采用amber99sb-ildn，ambertools16用于构建多肽初始结构，设定缓激肽为ph＝7时解离状态，抗衡离子为cl-离子。水作为溶剂盒子，溶剂盒子尺寸约为
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。