本发明属于纳米复合材料和电化学传感分析技术领域，具体涉及一种用于检测三氯乙酸和亚硝酸钠的修饰电极的制备方法和应用。
背景技术：
生物传感器主要由生物分子识别元件（其敏感元件主要为固定化生物分子活性物质如酶、蛋白质、核酸、抗原和抗体等）和信号转换器构成（主要为仪器的硬件部分如电化学修饰电极、压电石英晶体、场效应晶体管、热敏电阻等）。前者为生物信号的接收或产生，起到初始响应作用，后者为待测物质与敏感元件特异型结合后能把响应信号转换成可以输出的电信号或者光信号，以便达到精准测定的目的。因此生物传感器是一种能用适当的换能器从待测物中特异性检测相关生物分子并产生一个可测量信号的分析仪器。与生物分子识别元件组合之后，被感受器接受的生物信号都可以通过物理、化学、光学、热学或电化学作用换能成为可以被观测分析的信息。生物传感器的特点包括测定范围广、特异性强、测试过程简单、准确度和灵敏度高、体积小、能多次检测且易于化学分析、活体生物检测和成本低。生物传感器的发展有力地促进了医学研究、临床诊断、食品安全和环境监测等领域的发展。
三维石墨烯（3dgr）通常是指具有3d结构的二维石墨烯纳米片组装体，是近年来石墨烯化学领域的新型功能性材料。将石墨烯纳米片整合成具有3d结构的组装体可以有效调控石墨烯的电学、光学、机械、化学和催化特性，，因此3d石墨烯材料不仅具有石墨烯固有的理化性质，其三维多孔的微/纳米结构还使其兼具比表面积大、机械强度高、电子传导能力优越及传质快速等优良特性。这些独特的性质使3d石墨烯及其复合材料在材料科学领域备受关注。3dgr可以进一步被修饰，例如，3d石墨烯与多种纳米金属组合合金的复合材料应用在纳米电子学、能量储存和转换、化学和生物传感等研究领域均表现出优越的性能。由于石墨烯缺乏带隙，在室温下的超高电子迁移率、低电阻率、高热导率等优点，结合合金体系的高导电性优点，在光电晶体管、生化传感器、电池电极材料和复合材料方面有着很高的应用价值。
三氯乙酸（tca）是有机卤素类环境污染物之一，它也被广泛应用于农业和公共安全领域，如经常存在于用次氯酸消毒过的饮用水中。对三氯乙酸的毒理学研究表明，它能够导致生物体内的肺肿瘤，也可以造成癌症和影响人类生殖功能。因此世界卫生组织明确规定水环境中三氯乙酸的安全存在量为100μgl-1。亚硝酸钠（nano2）是肉制品生产中最常使用的一种食品添加剂。它是一种强氧化剂，进入血液后与血红蛋白结合，导致组织缺氧。亚硝酸钠的外观与食盐极为相似，容易被误用，作为食品添加剂亚硝酸钠，有助于保持肉制品的结构和营养价值。但它也是食品添加剂中毒性较强的物质，人体极限摄入量一次最多不能超过0.3克，如果超过这一极限摄入量，就会造成人体亚硝酸钠中毒，甚至死亡。
综上，研发一种基于新型纳米复合材料的修饰电极，对三氯乙酸和亚硝酸钠这两种物质均能快速且准确检测显得尤为重要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种肌红蛋白和铂-金-三维石墨烯复合材料修饰电极的制备方法及其应用，所制得的修饰电极对三氯乙酸和亚硝酸钠电催化还原效果良好，表现出线性范围宽，检测限低，灵敏度高等优点。
本发明提供一种肌红蛋白和铂-金-三维石墨烯复合材料修饰电极（nafion/mb/pt-au-3dgr/cile），其特征在于该电极由内向外依次包括基底电极（cile）、铂-金-三维石墨烯（pt-au-3dgr）涂层、肌红蛋白（mb）涂层、nafion涂层。
本发明提供一种电化学生物传感器件，其特征在于以本发明上述肌红蛋白和铂-金-三维石墨烯复合材料修饰电极作为工作电极。
本发明提供上述肌红蛋白和铂-金-三维石墨烯复合材料修饰电极（优选nafion/mb/pt-au-3dgr/cile电极）的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
s1、取1.6g石墨粉、0.8g离子液体1-己基吡啶六氟磷酸盐（hppf6）置于研钵中均匀研磨2h，得到碳糊，然后将碳糊填入玻璃电极管中压实，内插打磨好的铜丝作为导线，得到碳离子液体电极cile；
s2、取8μl0.6mgml-1pt-au-3dgr分散液滴涂在cile表面，室温条件下避光自然晾干，得到pt-au-3dgr/cile电极；
s3、再取8μl15mgml-1mb溶液滴涂在pt-au-3dgr/cile电极表面，在室温下避光自然晾干，得到mb/pt-au-3dgr/cile电极；
s4、最后取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在mb/pt-au-3dgr/cile电极表面，室温下避光晾干后，即得到nafion/mb/pt-au-3dgr/cile电极。
本发明任一项所述的肌红蛋白和铂-金-三维石墨烯复合材料修饰电极用于电催化还原三氯乙酸和亚硝酸钠。
本发明任一项所述的肌红蛋白和铂-金-三维石墨烯复合材料修饰电极用于检测三氯乙酸和亚硝酸钠。
本发明所述的肌红蛋白和铂-金-三维石墨烯复合材料修饰电极的检测环境为在ph3.0的磷酸盐缓冲溶液中。
本发明中，hppf6为1-己基吡啶六氟磷酸盐，cile为碳离子液体电极，pt为铂，au为金，3dgr为三维石墨烯，mb为肌红蛋白，nafion为全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物，tca为三氯乙酸，nano2为亚硝酸钠，pbs缓冲液为磷酸盐缓冲溶液。
一、附图说明
图1为nafion/mb/pt-au-3dgr/cile详细制备流程图和mb螺旋构象及铁卟啉；
图2为pt-au-3dgr复合材料的sem图和tem图；
图3为不同修饰电极在ph3.0的pbs缓冲溶液，扫描速度为100mvs-1时的循环伏安图，其中曲线d为cile的循环伏安曲线，曲线c为nafion/cile的循环伏安曲线，曲线b为nafion/mb/cile的循环伏安曲线,曲线a为nafion/mb/pt-au-3dgr/cile的循环伏安曲线；
图4为不同ph缓冲溶液中nafion/mb/pt-au-3dgr/cile的循环伏安图(a到f分别为ph为3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0)；
图5为nafion/mb/pt-au-3dgr/cile在不同浓度tca存在下的循环伏安图（a到j分别为0.0,1.0,3.0,6.0,10.0,14.0,18.0,22.0,26.0,30.0mmoll-1），其中插图为还原峰电流ipc与tca的浓度之间的关系曲线图；
图6为nafion/mb/pt-au-3dgr/cile在不同浓度nano2存在下的循环伏安图（a到k分别为0.05,0.10,0.15,0.20,0.26,0.30,0.36,0.40,0.45,0.50,0.55mmol·l-1），插图为还原峰电流ipc与nano2浓度的线性关系图。
二、pt-au-3dgr材料的形貌特征
pt-au-3dgr的sem和tem结果如图2a和2b所示，可以看到薄片状gr中均匀分散着大小均一的球状纳米颗粒形成复合材料。
三、研究了mb在ph=3.0的pbs缓冲溶液中的直接电化学行为
研究了mb修饰电极在ph=3.0的pbs缓冲溶液中扫描速度100mvs-1时的直接电化学行为，结果如图3所示，从图中可以看出，nafion/cile(曲线d)和nafion/pt-au-3dgr/cile(曲线c)上没有氧化还原峰，由于pt-au-3dgr在电极上的存在使背景电流更大。nafion/mb/cile(曲线b)上出现了一对近似对称的氧化还原峰但电流较小，说明了mb中的铁卟啉和cile表面存在着电子交流但速度较慢。nafion/mb/pt-au-3dgr/cile(曲线a)上有一对对称且峰型尖锐的氧化还原峰峰电流明显增加，说明pt-au-3dgr复合材料具有多孔结构可以提高mb的负载量，且高导电性和大的比表面积以及优异的生物相容性有利于加速mb内部铁卟啉的电子交流。从曲线a上可以得出epc和epa分别为-0.275v和-0.153v(vs.sce)，△ep为124mv，e0'为-0.214v(vs.sce)，电流之比为1，为mb内铁卟啉fe(iii)/fe(ii)电对的特征电化学行为。
四、研究ph对mb电化学信号响应的影响
研究磷酸盐缓冲溶液的ph对nafion/mb/pt-au-3dgr/cile直接电化学行为的影响，循环伏安扫描结果如图4所示。缓冲溶液的酸碱度可影响氧化还原蛋白质的电化学行为，e0’与ph之间线性关系的斜率可以提供相关电化学信息。如图所示e0’随着ph的升高逐渐往越负的电位方向偏移，两者之间线性回归方程为e0’(v)=-0.0509ph+0.033(n=6,γ=0.994)，斜率为-50.9mv·s-1，略小于在291k可逆反应的-57.60mv·s-1（理论值），说明了mb在电化学反应过程中于电极表面经历了单电子单质子传递过程，电化学反应方程表示为：mbfe(iii)+h++e
五、对tca和nano2电催化行为研究
研究了本发明的nafion/mb/pt-au-3dgr/cile电极在ph3.0pbs缓冲溶液中电催化还原tca的催化效果，结果如图5所示。在ph3.0的缓冲溶液中逐渐加入tca后循环伏安扫描发现在-0.286v处有一个还原峰峰电流ipc随着ctca的加大而加大，氧化峰峰高随着ctca的增加逐渐降低到最后消失，同时在-0.518v产生了新的还原峰，为典型的电催化反应过程。当ctca范围为1.0~30.0mmol·l-1时与还原峰电流的线性回归方程为i(μa)=4.426c(mmol·l-1)+21.57(n=9,γ=0.996)，检出限为0.33mmol·l-1(3σ)，kmapp为15.97mmol·l-1；
本发明还研究了该修饰电极电催化还原nano2的催化效果，结果如图6所示。在ph3.0的缓冲溶液中逐渐加入nano2后循环伏安扫描发现在-0.665v处有一个还原峰峰电流ipc随着cnano2的增加而增大。当线性范围为0.05~0.55mmol·l-1，线性回归方程为i(μa)=115.56c(mmol·l-1)+1.03(n=12,γ=0.996)，检出限为0.01mmol·l-1(3σ)，kmapp为9.51mmol·l-1。