本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法。
背景技术：
乳清蛋白(wheyprotein)是从牛奶中提取的一种蛋白质，被称为蛋白之王，具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一，在食品行业中应用广泛。
乳清蛋白在食品工业的应用中，常常会经历热处理和碱处理这两种常见的加工手段。然而，热处理乳清蛋白，尤其是在碱性条件下，能够促使交联氨基酸的产生，其中包括赖丙氨酸(lysinoalanine，lal)。赖丙氨酸，即n(6)-(dl-2-氨基-2-羧乙基)-dl-赖氨酸，其化学结构式如式1所示。lal有2个光学活性中心，因此它有ll-、ld-型和dl-、dd-型两对旋光异构体，由于形成dd-与dl-型的条件苛刻、时间较长，所以ll-和ld-型比较常见。lal的形成会导致食物中的营养素(如赖氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和其他磷酸蛋白)被破坏。与此同时，lal还会损坏并降低消化酶的活性，影响人体对蛋白质的消化和利用，此外，lal也被证实能够引发大鼠肾脏细胞损伤。因此，lal的安全性应该被给予重视，尤其是在婴幼儿食品中，应该最大程度减少lal的含量。
式1lal化学结构式
目前国家没有统一的针对乳清蛋白中赖丙氨酸(以下简称lal)的测定方法。因此，获得乳清蛋白中赖丙氨酸含量的可靠测定方法及相应测定标准的制订是目前急需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法，用以解决目前没有统一的针对乳清蛋白中赖丙氨酸含量测定方法的问题。本发明测定方法操作流程标准规范，检测精度高，其检出限可以达到0.5mg/kg，同时对于相应国家统一测定标准的制订具有借鉴意义。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种乳清蛋白中赖丙氨酸含量的测定方法，所述方法包括下列步骤：
(1)乳清蛋白水解；
(2)衍生化处理；
(3)固相萃取(spe)；以及
(4)反相高效液相色谱分析(hplc)。
进一步的，各步骤具体包括下列操作：
(1)乳清蛋白水解
取蛋白含量约10mg的乳清蛋白样品放置于氨基酸水解管底部，然后缓慢注入30～50ml浓度为6mol/l的hcl溶液，使样品完全浸入hcl溶液中；向水解管中注入氮气以密封水解管，于110℃下水解氨基酸23～30小时，获得氨基酸水解液。
(2)衍生化处理
氨基酸水解液冷却至室温后，40～60℃温度下蒸发干燥，将蒸发所得残渣溶解于1ml浓度为0.4mol/l的硼酸盐缓冲液中，然后吸取250μl于5ml离心管中，依次加入500μl超纯水，250μl浓度为0.4mol/l的硼酸盐缓冲液，1ml的fmoc-cl衍生剂；待所有上述部分混合均匀后，在室温下静置60～120min，获得样品衍生液。
(3)固相萃取(spe)
吸取100μl样品衍生液，以0.5ml/min的上样速度上样，并立即注入空气使样品液体排出，而目标物被吸附在spe小柱上；使10ml第一淋洗液与10ml第二淋洗液依次按照3ml/min的流速注入spe小柱；每次洗脱液注入后施加20ml空气以干燥小柱；最后，向小柱内注入1.5ml的洗脱液以1ml/min的速度洗脱目标，并向小柱内注入20ml的空气，收集样品spe洗脱液待测；其中，
第一淋洗液为：乙腈与水按照体积比1:4的比例混合获得；
第二淋洗液为：乙腈与水按照体积比1:1的比例混合获得；
洗脱液为：乙腈与0.2mol/l硼酸盐缓冲液(ph＝9)按照体积比1:1混合获得。
(4)反相高效液相色谱分析(hplc)
在测试前，将样品spe洗脱液用乙腈稀释10倍；液相色谱进样量为10μl；柱温设置为27℃，流速为0.5ml/min，荧光检测器的激发波长为266nm，衍射波长为310nm。
进一步的，步骤(1)中，采用氮吹仪向氨基酸水解管中注入氮气以达到消除氧气的目的，密封氨基酸水解管。
进一步的，步骤(2)中，氨基酸水解液冷却至室温后，转移至真空旋转蒸发仪，40～60℃温度下旋转蒸发干燥，然后加入15ml超纯水，继续旋转蒸发，该操作重复2次，获得蒸发所得残渣。
进一步的，fmoc-cl衍生剂为：取fmoc-cl溶解于乙腈中，使其浓度达到5mg/ml。现用现配。
进一步的，步骤(3)中，在上样之前还包括，在spe小柱的预处理阶段，注入10ml的乙腈，以10ml/min的流速预湿小柱，然后取10ml活化液以10ml/min的流速注入小柱以活化小柱。
进一步的，所述活化液为：乙腈与0.1mol/l硼酸盐缓冲液(ph＝7.2)按照体积比1:4混合获得。
进一步的，步骤(3)中，在上样之后，立即在5s内向小柱注入约20ml的空气，以方便样品液体的排出。
具体的反向高效液相色谱仪的洗脱液梯度设置如表1所示。
表1反相高效液相色谱仪测定lal衍生物的洗脱液梯度设置
其中，溶剂a为：0.5％的四氢呋喃和0.1％的乙酸乙酯溶解于30mmol/l的乙酸钾溶液中(v/v/v)。
溶剂b为：向100mmol/l的乙酸钠溶液中添加80％的乙腈(v/v)。
本发明方法具有如下优点：
1、通过将固相萃取与高效液相方法相结合，减少了杂质带来的干扰，提高了检验的精确度，降低了检出限。
2、本发明测定方法操作流程标准规范，对于相应国家统一测定标准的制订具有借鉴意义。
附图说明
图1为实施例2中按照本发明所示的方法，通过反相高效液相色谱测定不同浓度标准品衍生物的响应值，以标准品衍生物浓度为横坐标，响应值为纵坐标绘制的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
所有的试剂(除了特别指出的)均来自于中国上海aladdin试剂公司，hplc级溶剂均由英国fisher科技化工提供。
ll-lal及ld-lal混合标准品瑞士bachem公司
氯甲酸-9-芴基甲酯(fmoc-cl)瑞士bachem公司
氨基酸固相萃取小柱(3cc/500mg)美国waters公司
0.4mol/l、0.2mol/l和0.1mol/l的硼酸盐缓冲液分别采用6mol/l的naoh调节其ph至12、9.0和7.2。
fmoc-cl衍生剂：取适量fmoc-cl溶解于乙腈中，使其浓度达到5mg/ml，现用现配。
spe活化液：乙腈与0.1mol/l硼酸盐缓冲液(ph＝7.2)按照体积比1:4混合。
spe淋洗液1：乙腈与水按照体积比1:4的比例混合。
spe淋洗液2：乙腈与水按照体积比1:1的比例混合。
spe洗脱液：乙腈与0.2mol/l硼酸盐缓冲液(ph＝9)按照体积比1:1混合。
溶剂a：0.5％的四氢呋喃和0.1％的乙酸乙酯溶解于30mmol/l的乙酸钾溶液中(v/v/v)。
溶剂b：向100mmol/l的乙酸钠溶液中添加80％的乙腈(v/v)。
实验用水均为超纯水。
测定方法包括下列步骤：
1.乳清蛋白水解
取乳清蛋白浓缩物(wpc)样品0.01-0.33g(样品中的蛋白质含量约为10mg)，放置于氨基酸水解管底部，然后向氨基酸水解管中缓慢注入30ml浓度为6mol/l的hcl溶液，使样品完全浸入盐酸中。接着采用氮吹仪向管中注入氮气以达到消除氧气的目的，密封酸水解管，于110℃条件下水解氨基酸23小时，获得氨基酸水解液。
2.衍生化处理
氨基酸水解液冷却至室温后，转移至真空旋转蒸发仪，45℃温度下蒸发干燥，然后加入15ml超纯水，继续旋转蒸发，该操作重复2次。将蒸发所得残渣溶解于1ml的衍生缓冲液中(0.4mol/l的硼酸盐缓冲液，ph＝12)，用移液枪吸取250μl于5ml离心管中，依次加入500μl超纯水，250μl衍生缓冲液，1ml的fmoc-cl衍生剂。待所有溶液混合均匀后，在室温下静置60min，获得样品衍生液，以备固相萃取使用。
3.固相萃取(spe)
在spe小柱的预处理阶段，注入10ml的乙腈，以10ml/min的流速预湿小柱，然后取10ml活化液以10ml/min的流速注入小柱以活化小柱；在上样步骤，吸取100μl样品衍生液以0.5ml/min的上样速度上样，并立即在5s内向小柱注入约为20ml的空气，以方便样品液体的排出，而目标物被吸附在小柱上；将10ml的淋洗液1与10ml的淋洗液2分别依次按照3ml/min的流速注入spe小柱，每次洗脱液注入后都要施加20ml空气，以干燥小柱；最后，向小柱内注入1.5ml的洗脱液以1ml/min的速度洗脱目标，并向小柱内注入20ml的空气，收集样品spe洗脱液待测。
4.反相高效液相色谱分析(hplc)
所有的样品spe洗脱液在测试前，都被乙腈稀释10倍，液相色谱进样量为10μl，柱温设置为27℃，流速为0.5ml/min，荧光检测器的激发波长为266nm，衍射波长为310nm。具体的反向高效液相色谱仪的洗脱液梯度设置如表1所示。
实施例2
1、标准曲线的绘制
配置浓度为0.5、1、2、4、8mg/kg的标准品(ll-lal与ld-lal混标)，采用与待测样品完全一致的预处理方法，包括水解、衍生、固相萃取后，按照本发明所示的方法，通过反相高效液相色谱测定不同浓度标准品衍生物的响应值，以标准品衍生物浓度为横坐标，响应值为纵坐标绘制标准曲线。如图1所示。
结果显示，hplc的峰面积响应值在lal标准品浓度为0.5-8mg/kg时呈线性关系(r2＝0.999)，表明测量的仪器具有良好的重复性。
实施例3
2、精密度、准确度和重现性的测量
精密度指的是同一个待测样品，经过多次取样测定的结果之间的接近程度，一般采用相对标准偏差(rsd)来表示。向不含任何lal的去离子水(空白对照)里添加等体积的4mg/kg的lal标准品，经过酸水解、衍生化、固相萃取等一系列预处理手段后，重复9次测量其lal的含量，通过计算保留时间和峰面积的rsd值来表示精密度。
准确度指的是通过上述方法测量样品的测定值与真实值之间的接近程度，通常可以用回收率来表示。通过向待测样品中分别添加等体积的0，0.5，2，8mg/kg的lal标准品，计算回收率以及峰面积的rsd值来表示其准确性。
重现性的测定是为了确认预处理完毕的样品在-18℃条件下贮藏24h是否会影响测定结果，通过随机选取三个样品蛋白浓度在10mg左右，当天固相萃取后立即测定其lal含量4次，测定结束后同样的样品于-18℃条件下贮藏24小时后再次测量4次，计算两天多次测量值的rsd值。结果见下列表2所示。
表反相高效液相色谱法测定lal衍生物的校准参数
此外，通过不同浓度的lal标准品(从低浓度组到高浓度组)在等量的fmoc-cl衍生后，通过测定lal峰面积的rsd值或回收率，对其lal含量与响应值的线性关系进行了验证。
实验方法的精密度可以通过多次测试4mg/kg的lal标准品的含量来确定，峰面积和保留时间的rsd分别是2.94％和0.99％。
在空白对照中添加不同浓度的lal标准品，各重复测试6次lal含量以测定实验方法的准确度，当lal标准品的浓度从低到高时，回收率分别为96％、99.7％和102.8％，说明试验方法准确度高。
随机选取样品在-18℃贮藏24h前后多次测定其lal含量，其lal含量的rsd值小于10％，说明在-18℃储存24h不会对样品的lal含量测定造成显著的影响(p>0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。