一种养殖废水中恩诺沙星样品前处理装置及含量测定方法与流程

本发明涉及水环境中微量有机物分析与检测技术领域，具体涉及一种用于养殖废水中恩诺沙星的样品前处理及含量测定方法。

背景技术

目前，兽药抗生素在全球范围内广泛应用于治疗动物疾病和促进动物健康生长。随着畜禽业集约化养殖的发展，兽药抗生素被大量滥用。动物对抗生素的吸收有限，大约75％的抗生素以原药或代谢物的形式通过粪便和尿液排出体外。很多研究结果表明，养殖场排放的污水中含有大量的兽药抗生素残留，养殖废水是环境水体中抗生素的重要来源。

恩诺沙星(enrofloxacin)为第三代喹诺酮类抗菌药，又名恩氟奎林羧酸，属于氟奎诺酮类(fluoroquinolones)之化学合成抑菌剂，为白色结晶性粉末，不溶于水，易溶于氢氧化钠溶液、甲醇及氰甲烷等有机溶剂。恩诺沙星可用于治疗包括皮肤感染、尿路感染、呼吸道感染和伤口感染。恩诺沙星是畜禽和水产专用的抗菌药物，用药一个小时之后可以迅速发挥作用，具有独特的和直接的杀菌方式，直接作用于细菌的细胞核，可以有效的抑制细菌dna旋转酶，导致细菌快速死亡，不容易产生耐药性，与其他抗菌素无交叉耐药性。恩诺沙星可多途径给药，吸收迅速，生物利用度较高，研究表明其在各种动物中主要以原形药物排泄进入环境水体中。

目前水体中微量有机物前处理和测定的重要方法之一为固相萃取(spe)串联液相色谱-质谱法(hplc-ms/ms)，其具有应用范围广、灵敏度高、分析速度快等特点。

中国专利公开号cn106370748a公开了有机肥中氟喹诺酮类药物的测定方法及其样品预处理方法；中国专利公开号cn105929047a公开了一种同时测定畜禽养殖废水中磺胺类、四环素类、大环内酯类抗生素的测定方法；中国专利公开号cn104730168a公开了一种环境水体残留四环素类、氟喹诺酮类和磺胺类抗生素同步检测的方法，但对于养殖废水中兽药抗生素恩诺沙星的测定方法没有相关报道。

相较其他环境水体，禽畜养殖废水中兽药抗生素浓度较高。并且养殖废水成分复杂主要有尿液、残余的粪便、饲料残渣和冲洗水等，有时还有生产过程中产生的生活污水，另外养殖废水中有机物浓度高，悬浮物多，色度深，氨氮含量高且含有大量细菌，基质干扰严重，对测定结果影响较大。直接用养殖废水作为样品进行恩诺沙星的测定目前还没有适用的方法，因此有必要建立养殖废水中兽药抗生素恩诺沙星样品的含量测定方法，可用于实际养殖废水的检测。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种养殖废水中恩诺沙星样品前处理及含量测定的方法。该前处理方法能够快速、高效地完成养殖废水样品的净化过滤，从而提高样品前处理的效率。本发明所述的养殖废水前处理装置的结构简单，投入成本少，所述的养殖废水前处理装置能够大幅度减少有机溶剂的使用量。

本发明的技术方案如下：

一种养殖废水中氟喹诺酮类兽药抗生素含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取养殖废水水样，通过0.45μm的玻璃纤维滤纸，0.8mol/l的硫酸溶液和0.8mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至2.5；

(2)向养殖废水水样中加入回收率指示剂和金属离子耦合剂na2-edta，振荡使其充分混匀；

(3)向养殖废水水样中加入内标物质恩诺沙星-d⁵，使其混合均匀；

(4)自制改性甲醛树脂填充的固相萃取柱，固相萃取柱依次用甲醇、乙腈和高纯水淋洗进行活化，将过滤净化柱串联固相萃取柱组装到位；

(5)匀速使养殖废水水样通过过滤净化柱和活化好的固相萃取小柱，富集完成后用高纯水和12％的甲醇淋洗，弃去全部流液后在真空条件下抽空；

(6)用甲醇对步骤(5)中的固相萃取小柱进行洗脱，收集洗脱液于试管中，40–45℃水浴条件下氮吹浓缩至近干；

(7)用12％甲醇溶液定容至1.0ml，通过0.22μm滤膜后装入样品瓶中；

(8)使用高效液相色谱-串联质谱法hplc-ms/ms进行测定；

所述hplc-ms/ms的色谱条件为：shimadzu色谱柱shim-packgist2μmc18柱，2.1×100mm，色谱柱温度35℃，流速0.40ml/min，进样量为2μl，流动相a为乙腈，b为0.1％甲酸溶液；梯度淋洗条件为：0～2min，10％a，2～2.5min，10％～40％a，2.5～5min，40％～90％a，5～6.5min，90％～100％a，6.5～10min，100％a，最后还原初始流动相状态并保持2min；质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，正离子模式下扫描，检测方式为多反映监测，雾化器压力40psi，干燥气流速8l/min，温度为350℃，毛细管电压4000ev。

进一步，所述的步骤(2)中金属离子耦合剂na2-edta的添加量为0.2g。

进一步，步骤(4)中有机溶剂和高纯水活化小柱时用量为：甲醇1管柱，乙腈2管柱，高纯水3管柱。

根据本发明所述一种养殖废水中恩诺沙星含量测定方法，若步骤(5)中富集完成的小柱不立即进行洗脱，须置于-20℃的冰箱中存放，下次准备洗脱时，须先解冻30min，可以用高纯水和12％的甲醇淋洗后再用甲醇进行洗脱。

根据本发明所述一种养殖废水中恩诺沙星含量测定方法，所述自制改性甲醛树脂固相萃取柱根据养殖废水的特点制备而成，方法如下：(1)溶液的配制：将希夫碱、邻苯二胺和甲醛按照摩尔比1：1～3：2～5混合在一起，形成混合物，按照混合物和去离子水固液比1：20～50添加去离子水，配制成混合溶液，在每升混合溶液中加入0.1～0.3mg的氢氧化钠，最终形成多组分甲醛混合溶液；(2)聚合反应：将多组分甲醛混合溶液在135～145℃油浴中回流125～155分钟；冷却过滤后得到希夫碱改性甲醛树脂，先用去离子水清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在60～65℃下真空干燥，干燥后研磨至50～80目；(3)金属负载：每升无水乙醇溶液中加入16.9～39.5毫升硝酸锰溶液，58～79mg研磨后的希夫碱改性甲醛树脂，将改混合溶液在55～58℃的水浴下以75～90转/分钟的速度搅拌搅拌90～160分钟，过滤和得到的聚合物，先用乙醇清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在66～68℃下真空干燥，冷却后得到锰-希夫碱改性甲醛聚合物。

本发明还提供一种养殖废水中恩诺沙星含量测定中样品前处理装置，上述的养殖废水中恩诺沙星含量测定方法应用所述样品前处理装置，

所述样品前处理装置包括第一部分过滤净化柱和第二部分固相萃取柱，过滤净化柱串联固相萃取柱；

第一部分过滤净化柱，上部设置入口和下部设置出口，上部入口处设有扩径结构(市售)，可以增加单次样品的上样量；下部出口可与第二部分固相萃取柱密封连接，管柱内可自行填充净化过滤填料；第二部分固相萃取柱，设置有入口和出口，该入口与第一部分过滤净化柱的出口密封连接。

本发明还提供一种养殖废水中恩诺沙星含量测定中样品前处理方法，所述方法应用上述一种养殖废水中恩诺沙星含量测定中样品前处理装置，包括如下步骤：

(1)取养殖废水水样，通过0.45μm的玻璃纤维滤纸，0.8mol/l的硫酸溶液和0.8mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至2.5；

(2)向养殖废水水样中加入回收率指示剂和金属离子耦合剂na2-edta，振荡使其充分混匀；

(3)向养殖废水水样中加入内标物质恩诺沙星-d⁵，使其混合均匀；

(4)自制改性甲醛树脂填充的固相萃取柱，固相萃取柱依次用甲醇、乙腈和高纯水淋洗进行活化，将过滤净化柱串联固相萃取柱组装到位；

(5)匀速使养殖废水水样通过过滤净化柱和活化好的固相萃取小柱，富集完成后用高纯水和10％的甲醇淋洗，弃去全部流液后在真空条件下抽空；

(6)用甲醇对步骤(5)中的固相萃取小柱进行洗脱，收集洗脱液于试管中，40℃水浴条件下氮吹浓缩至近干。

本发明所述养殖废水主要包括畜禽粪便、粪水和冲洗废水，含有高浓度有机污染物和高浓度固态悬浮物。

发明详述：

为了实现上述目的，本发明提出了一种过滤净化柱串联固相萃取柱的养殖废水前处理装置，其包括：

第一部分为过滤净化空管小柱，容积为150ml，其有入口和出口，上部入口设有扩径结构，可以增加单次样品的上样量。该小柱的出口可与下部的固相萃取小柱密封连接，管柱内可自行填充净化过滤填料(下述制备的填料)；

第二部分为固相萃取柱，其具有入口和出口，该入口与上部过滤净化柱的出口密封连接。

过滤净化柱串联固相萃取柱可直接用于固相萃取装置上使用，两柱可串联使用也可单独连接固相萃取装置使用。养殖废水尤其是原水中成分复杂且污染负荷较大，污水中常伴有消毒水、重金属、残留的兽药以及各种人畜共患病原体等污染物，而且各类禽畜养殖场因生产方式的不同，养殖废水具体特性也不尽相同。根据养殖废水的特性选择适用的选择性分离的净化填料，可以去除蛋白质大分子，重金属残留以及其余兽药残留，高效便捷的过滤净化方式可以减少上样体积，降低成本，提高前处理效率，缩短前处理时间，能够简化养殖废水的前处理过程，提高后续恩诺沙星的测定结果的准确性。

一种养殖废水中恩诺沙星样品前处理和含量测定方法，包括步骤：

(1)取养殖废水水样100ml，通过0.45μm的玻璃纤维滤纸，0.8mol/l的硫酸溶液和0.8mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至2.5；

(2)向水样中加入回收率指示剂(恩诺沙星标准样品溶液)和金属离子耦合剂na2-edta，振荡使其充分混匀；

(3)向水样中加入内标物质恩诺沙星-d⁵，使其混合均匀；

(4)自制改性甲醛树脂填充的固相萃取柱，固相萃取柱依次用甲醇、乙腈和高纯水淋洗进行活化，将过滤净化柱串联固相萃取柱组装到位；

(5)匀速使水样通过过滤净化柱和活化好的固相萃取小柱，富集完成后用高纯水和12％的甲醇淋洗，弃去全部流液后在真空条件下抽空30min；

(6)用甲醇对步骤(4)中的固相萃取小柱进行洗脱，收集洗脱液于10ml试管中，40℃水浴条件下氮吹浓缩至近干；

(7)用12％甲醇溶液定容至1.0ml，通过0.22μm滤膜后装入样品瓶中；

(8)使用高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)进行测定。

所述自制改性甲醛树脂固相萃取柱根据养殖废水的特点制备而成，方法如下：(1)溶液的配制：将希夫碱、邻苯二胺和甲醛(质量比为37％)按照摩尔比1：1～3：2～5混合在一起，形成混合物，按照混合物和去离子水固液比1：20～50添加去离子水，配制成混合溶液，在每升混合溶液中加入0.1～0.3mg的氢氧化钠，最终形成多组分甲醛混合溶液。(2)聚合反应：将多组分甲醛混合溶液在135～145℃油浴中回流125～155分钟；冷却过滤后得到希夫碱改性甲醛树脂，先用去离子水清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在60～65℃下真空干燥，干燥后研磨至50～80目。(3)金属负载：每升无水乙醇溶液中加入16.9～39.5毫升硝酸锰溶液(质量比50％)，58～79mg研磨后的希夫碱改性甲醛树脂，将改混合溶液在55～58℃的水浴下以75～90转/分钟的速度搅拌搅拌90～160分钟，过滤和得到的聚合物，先用乙醇清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在66～68℃下真空干燥，冷却后得到锰-希夫碱改性甲醛聚合物。按100mg填充在固相萃取柱中。所述锰-希夫碱改性甲醛聚合物固相萃取柱，表面键和反相材料和阳离子官能团，净化，提取和浓缩养殖废水中的恩诺沙星，具有极高的重现性和回收率。

本发明针对养殖废水的特性，采用的前处理方法能够有效的去除养殖废水中其他物质对恩诺沙星测定的干扰。使用0.45μm的玻璃纤维滤纸去除养殖废水中的悬浮颗粒物；调节ph值至3.0，能使养殖废水中恩诺沙星物质呈分子状态，能够有效地被有机溶液提取出来；加入金属离子耦合剂na2-edta使恩诺沙星物质带负电，与基质中的干扰物充分解离，利于从基质中提取出待测的恩诺沙星物质；使用过滤净化柱，能够进一步去除废水中的悬浮颗粒物以及改变ph后水样中析出的颗粒物，内部吸附填料可以去除养殖废水中的蛋白质大分子、重金属残留以及其他抗生素残留，为后续恩诺沙星的测定去除干扰。

进一步地，所述的步骤(2)中金属离子耦合剂na2-edta的添加量为0.2g；步骤(3)中有机溶剂和高纯水活化小柱时用量为：甲醇1管柱，乙腈2管柱，高纯水3管柱；若步骤(4)中富集完成的小柱不立即进行洗脱，须置于-20℃的冰箱中存放，下次准备洗脱时，须先解冻30min，可以用高纯水和12％的甲醇淋洗后再用甲醇进行洗脱。

进一步地，hplc-ms/ms的色谱条件为：shimadzu色谱柱shim-packgist2μmc18柱，2.1×100mm，色谱柱温度35℃，流速0.40ml/min，进样量为2μl，流动相a为乙腈，b为0.1％甲酸溶液。梯度淋洗条件为：0～2min，10％a，2～2.5min，10％～40％a，2.5～5min，40％～90％a，5～6.5min，90％～100％a，6.5～10min，100％a，最后还原初始流动相状态并保持2min。质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，正离子模式下扫描，检测方式为多反映监测，雾化器压力40psi，干燥气流速8l/min，温度为350℃，毛细管电压4000ev。

本发明有益的技术效果：

本发明针对养殖废水的特性，使用过滤净化柱串联固相萃取柱，去除基质中对恩诺沙星测定结果有干扰的物质，简化了前处理过程。使用自装填式过滤净化柱，自行填装过滤填料，柱体可反复使用，节约了经济成本。建立了对养殖废水中恩诺沙星样品含量测定的方法，在短时间内对恩诺沙星进行快速的分离检测，分离效果也好，具有可操作性强、高效的优点。

附图说明

图1为：养殖废水中恩诺沙星含量测定中样品前处理装置；

其中：1-过滤净化柱(自制)、2-spe小柱(市售)、3-spe装置、4-上隔板、5-上筛板、6-下筛板(5和6中间部分为过滤净化填料)。

图2恩诺沙星的一级质谱图(左图)和产物离子扫描质谱图(ce值-25v)(右图)。

图3养殖废水的恩诺沙星mrm色谱图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，本领域技术人员应当理解，所述实施例仅用于示例，而不对本发明构成任何限制。

实施例1：一种养殖废水中恩诺沙星含量测定方法(养牛场废水)，

步骤：

(1)取浙江金华某养牛场废水水样100ml于250ml锥形瓶中，通过0.45μm的玻璃纤维滤纸，0.8mol/l的硫酸溶液和0.8mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至2.5；

(2)向水样中加入回收率指示剂50μl和金属离子耦合剂na2-edta，振荡使其充分混匀；

(3)向水样中加入内标物质恩诺沙星-d⁵，使其混合均匀；

(4)自制改性甲醛树脂填充的固相萃取柱依次用甲醇1管柱，乙腈2管柱，高纯水3管柱淋洗进行活化，将过滤净化柱串联固相萃取柱组装到位；

(5)匀速使水样通过过滤净化柱和活化好的固相萃取小柱，流速控制在3-5ml/min，富集完成后用高纯水和12％的甲醇淋洗，弃去全部流液后在真空条件下抽空30min；

(6)用甲醇对步骤(4)中的固相萃取小柱进行洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱液于10ml试管中，40℃水浴条件下氮吹浓缩至近干；

(7)用12％甲醇溶液定容至1.0ml，置于涡旋振荡器上1-2min，混合均匀，通过0.22μm滤膜后装入样品瓶中；

(8)使用高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)进行测定。

hplc-ms/ms的色谱条件为：shimadzu色谱柱shim-packgist2μmc18柱，2.1×100mm，色谱柱温度35℃，流速0.40ml/min，进样量为2μl，流动相a为乙腈，b为0.1％甲酸溶液。梯度淋洗条件为：0～2min，10％a，2～2.5min，10％～40％a，2.5～5min，40％～90％a，5～6.5min，90％～100％a，6.5～10min，100％a，最后还原初始流动相状态并保持2min。质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，正离子模式下扫描，检测方式为多反映监测，雾化器压力40psi，干燥气流速8l/min，温度为350℃，毛细管电压4000ev。

所述自制改性甲醛树脂固相萃取柱根据养殖废水的特点制备而成，方法如下：(1)溶液的配制：将希夫碱、邻苯二胺和甲醛(质量比为37％)按照摩尔比1：3：2混合在一起，形成混合物，按照混合物和去离子水固液比1：20添加去离子水，配制成混合溶液，在每升混合溶液中加入0.3mg的氢氧化钠，最终形成多组分甲醛混合溶液。(2)聚合反应：将多组分甲醛混合溶液在145℃油浴中回流125分钟；冷却过滤后得到希夫碱改性甲醛树脂，先用去离子水清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在60～65℃下真空干燥，干燥后研磨至50～80目。(3)金属负载：每升无水乙醇溶液中加入18毫升硝酸锰溶液(质量比50％)，58～79mg研磨后的希夫碱改性甲醛树脂，将改混合溶液在55～58℃的水浴下以75～90转/分钟的速度搅拌搅拌120分钟，过滤和得到的聚合物，先用乙醇清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在66～68℃下真空干燥，冷却后得到锰-希夫碱改性甲醛聚合物。按100mg填充在固相萃取柱中。

表1浙江金华某养牛场废水中恩诺沙星的浓度水平、信噪比和检出限

实施例2：一种养殖废水中恩诺沙星含量测定方法(养猪场废水)，

步骤：

(1)取长三角地区某养猪场废水水样100ml于250ml锥形瓶中，通过0.45μm的玻璃纤维滤纸，0.8mol/l的硫酸溶液和0.8mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至2.5；

(2)向水样中加入回收率指示剂50μl和金属离子耦合剂na2-edta，振荡使其充分混匀；

(3)向水样中加入内标物质恩诺沙星-d⁵，使其混合均匀；

(4)自制改性甲醛树脂填充的固相萃取柱依次用甲醇1管柱，乙腈2管柱，高纯水3管柱淋洗进行活化，将过滤净化柱串联固相萃取柱组装到位；

(5)匀速使水样通过过滤净化柱和活化好的固相萃取小柱，流速控制在3-5ml/min，富集完成后用高纯水和12％的甲醇淋洗，弃去全部流液后在真空条件下抽空30min；

(6)用甲醇对步骤(4)中的固相萃取小柱进行洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱液于10ml试管中，40℃水浴条件下氮吹浓缩至近干；

(7)用12％甲醇溶液定容至1.0ml，置于涡旋振荡器上1-2min，混合均匀，通过0.22μm滤膜后装入样品瓶中；

(8)使用高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)进行测定。

hplc-ms/ms的色谱条件为：shimadzu色谱柱shim-packgist2μmc18柱，2.1×100mm，色谱柱温度35℃，流速0.40ml/min，进样量为2μl，流动相a为乙腈，b为0.1％甲酸溶液。梯度淋洗条件为：0～2min，10％a，2～2.5min，10％～40％a，2.5～5min，40％～90％a，5～6.5min，90％～100％a，6.5～10min，100％a，最后还原初始流动相状态并保持2min。质谱条件为：离子源为电喷雾离子源，正离子模式下扫描，检测方式为多反映监测，雾化器压力40psi，干燥气流速8l/min，温度为350℃，毛细管电压4000ev。

所述自制改性甲醛树脂固相萃取柱根据养殖废水的特点制备而成，方法如下：(1)溶液的配制：将希夫碱、邻苯二胺和甲醛(质量比为37％)按照摩尔比1：1：2混合在一起，形成混合物，按照混合物和去离子水固液比1：50添加去离子水，配制成混合溶液，在每升混合溶液中加入0.3mg的氢氧化钠，最终形成多组分甲醛混合溶液。(2)聚合反应：将多组分甲醛混合溶液在135℃油浴中回流155分钟；冷却过滤后得到希夫碱改性甲醛树脂，先用去离子水清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在60～65℃下真空干燥，干燥后研磨至50～80目。(3)金属负载：每升无水乙醇溶液中加入20毫升硝酸锰溶液(质量比50％)，58～79mg研磨后的希夫碱改性甲醛树脂，将改混合溶液在55～58℃的水浴下以75～90转/分钟的速度搅拌搅拌150分钟，过滤和得到的聚合物，先用乙醇清洗2～5次，再用石油醚清洗3～5次，在66～68℃下真空干燥，冷却后得到锰-希夫碱改性甲醛聚合物。按100mg填充在固相萃取柱中。

表2长三角地区某养猪场废水中恩诺沙星的浓度水平、信噪比和检出限

需要注意的是，以上列举的仅为本发明的具体实施例，显然本发明不限于以上实施例，随之有着许多的类似变化。本领域的技术人员如果从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应属于本发明的保护范围。