本发明涉及食品安全检测技术领域，特别涉及一种鱼类肌肉中硝基呋喃类代谢物残留质控样品的制备方法。
背景技术
质控样品是具有足够均一或多种化学的、物理的、生物学的、工程技术的或感官的等性能特征，经过技术鉴定，并附有相关证书的一批样品。在食品安全检测领域，质控样品在保障检测结果的可靠性及准确性方面起到至关重要的作用。国外残留分析实验室已普遍定期使用质控样品进行实验室质量控制，进行相关检测结果的评判，质控样品主要由欧洲供体标准物质和测量研究所(irmm)、英国弗帕斯检测技术研究所(fapas)等机构提供，样品基质包括尿液、动物组织等，相关样品已经产业化。国内残留分析实验室往往以添加兽药标准溶液至分析样品中代替实际污染样品(质控样品)，这种方法无法反应实验室实际的运行状况，得到的结果也不能令人信服。究其原因，一方面是我国在自然基体质控样品制备方面研究还比较少、另一方面是国外售卖的质控样品价格比较昂贵(例如fapas销售的硝基呋喃类代谢物质控样品售价达4000多元)、货期较长。
硝基呋喃类药物是我国、欧盟、日本、美国等规定的禁用药物，但是从近年来农业部、国家认监委等部门对水产品药物残留监控情况来看，硝基呋喃类代谢物残留问题仍然很突出，由此引起的国际间贸易摩檫和食品安全事件仍然不断发生。目前，有关硝基呋喃类代谢物质控样品研究制备方面研究还比较少。国际上只有fapas提供水产品领域硝基呋喃类代谢质控样品，但该机构提供的质控样品价格贵、周期长。据了解，国内有检验检疫科学研究院测试评价中心研制出售硝基呋喃类代谢物质控样品，但是其研究对象是畜禽类(主要是鸡)。
技术实现要素：
本发明提供一种鱼类肌肉中硝基呋喃类代谢物残留质控样品的制备方法，用以实现获得均匀稳定，方便运输且接近实际检测样品的鱼类肌肉中呋喃西林代谢物sem、呋喃唑酮代谢物aoz、呋喃它酮代谢物amoz和呋喃妥因代谢物ahd4种硝基呋喃类代谢物残留冻干粉质控样品，可用于质量检测方法的评价、质量控制、仪器校准等领域，对完善我国水产品药物残留检测领域具有很大的实用价值，对其他兽药残留质控样品的制备具有重要参考意义。
本发明提供一种鱼类肌肉中硝基呋喃类代谢物残留质控样品的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)，选择预设规格大小且未被饲喂过硝基呋喃类药物的阴性活鱼；
步骤2)，在所述阴性活鱼适应环境后，将其在设定条件下进行药浴，其中，所述药浴池水体中包括呋喃唑酮原药、呋喃它酮原药、呋喃西林原药和呋喃妥因原药4种硝基呋喃类药物，每种硝基呋喃类药物对应一个初始药浴浓度；
步骤3)，将药浴后的阳性样品捞出，立即处死取其背部肌肉，得到鱼类肌肉样品；
步骤4)，向所述鱼类肌肉样品中加入维生素c溶液搅拌均匀，得到肉糜；
步骤5)，将所述肉糜预冷后在预设冷冻干燥条件下进行冷冻干燥，得到冻干样品；
步骤6)，将所述冻干样品依次进行粉碎、混匀和过筛处理，得到包含目标含量水平的硝基呋喃类代谢物残留的质控样品。
步骤7)，将所述硝基呋喃类代谢物残留的质控样品按照预设质量分装至多个聚乙烯瓶，并在厌氧工作站中充氮气包装，封口后再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装，常温避光条件下保存。
在该实施例中，通过含4种硝基呋喃类药物的药液进行药浴，从而使得质控样品含有4种硝基呋喃类代谢物，与单一代谢物相比，更能满足实际检验的需要。同时本发明建立养殖因素与鱼类肌肉中硝基呋喃类代谢物残留浓度关系，确定鱼类基质中硝基呋喃类代谢物残留检测样品的养殖试验条件，建立了硝基呋喃类代谢物质控样品制备的工艺流程。通过本发明方法制备得到的样品更接近真实样品，同时稳定性时间较长，便于运输保存。
可选的，所述制备方法还包括：
步骤8)，随机抽取10个质控样品，每个质控样品做3个平行样，按照“农业部783号公告-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留测的测定液相色谱-串联质谱法”对质控样品进行均匀性检测；
步骤9)，根据均匀性检测结果确定质控样品的均匀性。
可选的，在步骤9)之后，上述制备方法还包括：
步骤10)，使用稳定性研究基本模型对所述质控样品进行稳定性检测；
步骤11)，根据稳定性检测结果确定质控样品的稳定性。
可选的，上述步骤11)之后，所述制备方法还包括：
在上述实施例中，对质控样品进行均匀性和稳定性检测，并通过多家具有资质认定的实验室进行协同定值，保证了样品的合格性和稳定性。
可选的，所述药浴池的所述设定条件包括：
药浴水温条件为(25±1)℃，药浴池中阴性样品密度为48～54条/m3。
可选的，所述预设规格大小为900g-1100g。
可选的，所述药浴时间为10小时。
可选的，所述呋喃唑酮和呋喃它酮的原药浓度分别为1500μg/l，所述呋喃西林和呋喃妥因的原药浓度分别为2000μg/l，
在步骤2)之前，所述制备方法还包括：
称取呋喃唑酮和呋喃它酮原药各0.1500g，分别置于100ml容量瓶中；
向上述容量瓶中分别加入80ml乙腈充分溶解，待其完全溶解后用水定容至100ml刻度线；超声15min后取出，放置室温下冷却至100ml刻度线，放置4℃的冰箱中冷藏保存；
称取呋喃西林和呋喃妥因原药各0.2000g，分别置于100ml容量瓶中；
向上述容量瓶中加入60ml甲醇充分溶解；超声15min，待其完全溶解恢复到室温后用甲醇定容至100ml刻度线，放置4℃的冰箱中冷藏保存。
可选的，在步骤2)之前，所述制备方法还包括：
根据每种硝基呋喃类原药对应的线性方程和实施控制目标含量水平，计算每种硝基呋喃类原药的初始药浴浓度；
可选的，所述鱼类肌肉样品中加入维生素c溶液(每5kg鱼肉加入1kg维生素c溶液)，维生素浓度为500mg/kg。
可选的，所述将所述肉糜预冷后在预设冷冻干燥条件下进行冷冻干燥，包括：
将所述肉糜预先放于-20℃冰箱中预冻6～7h，之后放入真空冷冻干燥机内冷冻干燥，冷冻干燥时间为约72h。
可选的，所述过筛处理的过程中采用120目孔筛进行过滤，并弃去粗粉。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为本发明鱼类肌肉中硝基呋喃类代谢物残留质控样品的制备方法流程图；
图2至图5是本发明质控样品中目标物特征离子质量色谱图。
具体实施方式
以下结合附表和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本实施例的鱼类肌肉中硝基呋喃类代谢物残留质控样品的制备方法，可以包括以下步骤：
步骤s1，实验动物选择：选择符合预设规格大小且未被饲喂过硝基呋喃类药物的阴性活鱼；可选的，所述预设规格大小的活鱼阴性样品重量为900g-1100g/条。
步骤s2，计算每种硝基呋喃类药物的初始药浴浓度，控制药浴条件：在所述阴性样品适应环境后，将其在设定条件下进行药浴10h，其中，所述药浴池水体中含有呋喃唑酮原药、呋喃它酮原药、呋喃西林原药和呋喃妥因原药4种硝基呋喃类药物，每种硝基呋喃类药物对应一个初始药浴浓度。
可选的，根据每种硝基呋喃类原药对应的线性方程和实施控制目标含量水平，计算每种硝基呋喃类原药的初始药浴浓度；根据所述每种硝基呋喃类原药的初始药浴浓度进行药浴。
其中，对于呋喃唑酮(fzd)原药，其对应的线性方程为：y1＝1.10x1，其中，y1表示质控样品中呋喃唑酮代谢物(aoz)目标含量水平，x1表示呋喃唑酮原药的初始药浴浓度。
对于呋喃西林(nfz)原药，其对应的线性方程为：y2＝0.125x2，其中，y2表示质控样品中呋喃西林代谢物(sem)目标含量水平，x2表示呋喃西林原药的初始药浴浓度。
对于呋喃它酮(ftd)原药，其对应的线性方程为：y3＝0.18x3；，其中，y3表示质控样品中呋喃它酮代谢物(amoz)目标含量水平，x3；表示呋喃它酮原药的初始药浴浓度。
对于呋喃妥因(nft)原药，其对应的线性方程为：y4＝0.0049x4；，其中，y4表示质控样品中呋喃妥因代谢物(ahd)目标含量水平，x4表示呋喃妥因原药的初始药浴浓度。
通过上述各个线性方程，以及质控样品中各硝基呋喃类药物的代谢物目标含量水平，即可反推出各硝基呋喃类原药的初始药浴浓度。
可选的，所述药浴池的所述设定条件包括：
药浴水温条件为(25±1)℃，药浴池中阴性样品密度为48～54条/m3。
步骤s3，取鱼类肌肉样品：将药浴后的阳性样品捞出，立即处死取其背部肌肉，得到鱼类肌肉样品；
步骤s4，匀浆、均匀性检测：将所述鱼类肌肉样品中加入维生素c溶液搅拌均匀，得到肉糜；可选的，在得到鱼类肌肉样品后，可以先对鱼类肌肉样品进行一次均匀性检测，具体均匀性检测方法参照“农业部783号公告-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留测的测定液相色谱-串联质谱法”。在均匀性检测合格后再执行步骤s5。
可选的，所述鱼类肌肉样品中加入维生素c溶液，其中每5kg鱼类肌肉样品加入1kg维生素c溶液)，维生素c溶液的浓度为500mg/kg。
步骤s5，真空冷冻干燥：将所述肉糜预冷后放入预设冷冻干燥条件下进行冷冻干燥，得到冻干样品。可选的，将所述肉糜预冷后放入预设冷冻干燥条件下进行冷冻干燥包括：将肉糜预先放于-20℃冰箱中预冻6～7h，之后放入真空冷冻干燥机内冷冻干燥，冷冻干燥时间约72h。
步骤s6，粉碎、混匀和过筛：将所述冻块样品分别进行粉碎、混匀和过筛处理，得到包含目标含量水平的硝基呋喃类代谢物残留的质控样品。可选的，所述过筛处理的过程中采用120目孔筛进行过滤，并弃去粗粉。
步骤s7，进行均匀性检测：随机抽取10个质控样品，每个质控样品做3个平行样，按照“农业部783号公告-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留测的测定液相色谱-串联质谱法”对质控样品进行均匀性检测；根据均匀性检测结果确定所述质控样品是否均匀。当所述质控样品均匀时，进入步骤s8，否则返回步骤s6。
步骤s8，进行稳定性检测，使用预设稳定性研究基本模型对所述质控样品进行稳定性检测；根据稳定性检测结果确定所述质控样品是否稳定。当所述质控样品稳定时，进入步骤s9，否则返回步骤s6。
步骤s9，协作定值及不确定度分析：通过多家认可实验室对所述质控样品均采用液相色谱-串联质谱法协同定值及不确定度分析。
在上述实施例种，对质控样品进行均匀性和稳定性检测，并通过多家实验室进行协同定值，保证了样品的合格性和稳定性。
步骤s10，真空包装：将所述硝基呋喃类代谢物残留的质控样品按照预设质量分装至多个聚乙烯瓶，并在厌氧工作站中充氮气包装，封口后再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装，常温避光条件下保存。
在该实施例中，通过包含4种硝基呋喃类药物的药液进行药浴，从而使得质控样品含有4种硝基呋喃类代谢物，与单一代谢物相比，更能满足实际检验的需要。同时本发明建立养殖因素与鱼类肌肉中硝基呋喃类代谢物残留浓度关系，确定鱼类基质中硝基呋喃类代谢物残留检测样品的养殖试验条件，建立了硝基呋喃类代谢物质控样品制备的工艺流程。通过本发明方法制备得到的样品更接近真实样品，同时稳定性时间较长，便于运输保存。
可选的，所述呋喃唑酮和呋喃它酮的原药浓度分别为1500μg/l，所述呋喃西林和呋喃妥因的分别为：2000μg/l，
在步骤s2)之前，所述制备方法还包括：
称取呋喃唑酮和呋喃它酮原药各0.1500g，分别置于100ml容量瓶中；
向所述容量瓶中加入80ml乙腈充分溶解，待其完全溶解后用水定容至100ml刻度线；超声15min后取出，放置室温下冷却至100ml刻度线，放置4℃的冰箱中冷藏保存，备用；
称取呋喃西林和呋喃妥因原药各0.2000g，分别置于100ml容量瓶中；
向所述容量瓶中加入60ml甲醇充分溶解；超声15min，待其完全溶解恢复到室温后用甲醇定容至100ml刻度线，放置4℃的冰箱中冷藏保存，备用。
下面以一个具体实施例详细说明上述技术方案。
(1)选择实验动物：市购体重900～1100g个体大小均一的活鱼类，确认活鱼未被饲喂过呋喃唑酮，随机取样，检测确认为阴性样品，暂养1-～2天后，剔除受伤不健康的鱼类；
(2)确定药浴浓度：呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因的原药纯度>98％，为黄色粉末；
呋喃唑酮、呋喃它酮原药浓度：1500μg/l，用分析天平准确称取呋喃唑酮、呋喃它酮原药各0.1500g，分别置于100ml容量瓶中，加入80ml乙腈充分溶解，待其完全溶解后用水定容至刻度线。然后超声15min取出，放置室温下冷却至刻度线，放置4℃的冰箱中冷藏保存，备用；
呋喃西林、呋喃妥因原药浓度：2000μg/l，用分析天平准确称取呋喃西林、呋喃妥因原药各0.2000g，分别置于100ml容量瓶中，加入60ml甲醇充分溶解，然后超声15min，待其完全溶解恢复到室温后用甲醇定容至刻度线，放置4℃的冰箱中冷藏保存，备用；
根据经过多次验证的线性方程：
aozy1＝1.10x1；semy2＝0.125x2；amozy3＝0.18x3；ahdy4＝0.0049x4；
同时根据实施控制目标含量水平(aoz50μg/kg，sem15μg/kg，amoz5μg/kg，ahd10μg/kg)，计算初始药浴浓度，得到实施例中呋喃唑酮初始药浴浓度为45.45μg/l；呋喃西林初始药浴浓度116.53μg/l；呋喃它酮初始药浴浓度27.78μg/l，呋喃妥因初始药浴浓度2031.84μg/l；
(3)控制鱼类药浴条件：实验选择方形的玻璃缸，实验前都将缸清洗2-3遍，待缸清洗干净后放入自来水，水深控制约42cm，药浴池长×宽×高约为68.5×57×54cm；
控制药浴水温条件25℃，药浴池中8～9条鱼，药浴10h；
(4)取样：药浴10h后，将鱼捞出，并立即处死，取其背部肌肉，取肌肉时尽量避免沾到血液，得到鱼类肌肉样品；
(5)搅拌均匀：将鱼类肌肉样品放入搅拌机中，加入维生素c溶液，使鱼类肌肉样品中维生素c的浓度为500mg/kg，得到肉糜，维生素c溶液具有抗氧化作用，有利于样品的长期保存；
(6)冷冻干燥：样品预先放于-20℃冰箱中预冻6～7h，之后放入真空冷冻干燥机内冷冻干燥，冷冻干燥时间约72h，直至冻块干燥；
(7)粉碎、均质：将冻块用粉碎机粉碎、混匀；
(8)过筛：混匀后的冻干粉过120目孔筛，弃去粗粉，得到鱼粉；
(9)包装、保存：鱼粉按每个瓶内鱼粉重量(5.0士0.1)g装瓶，装瓶过程中注意控制空气的温度、湿度，避免在装瓶过程中吸收水分，在厌氧工作站中充氮气包装，封口后再用铝箔袋将聚乙烯瓶进行真空封装，得到含有硝基呋喃类代谢物的鱼肉基质冻干粉样品，常温避光条件下保存。
均匀性检验
本实施例采用单因素方差分析进行均匀性检验，随机抽取10个样品，每个样品做3个平行样，按照“农业部783号公告-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留测的测定液相色谱-串联质谱法”对样品进行均匀性检测。在均匀性检测过程中，一般需同时考察样品组间与组内均匀性，用方差分析法通过比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，如果两者的比值f小于统计检验的临界值f，则认为样品是均匀的。
样品的均匀性数据见表1。
表1冻干粉样品均匀性检测数据(n＝3)
表2样品中sem均匀性检验方差分析结果
表3样品中aoz均匀性检验方差分析结果
表4样品中amoz均匀性检验方差分析结果
表5样品中ahd均匀性检验方差分析结果
采用spss20.0对均匀性数据进行单因素方差分析，结果见上表2～表5，，由表可知f值均小于fcritp值均大于0.05，表明样品间无显著性差异，样品间是具有均匀性的。
稳定性检验
评估稳定性研究的数据的第一步是检查数据中是否有任何观察到的趋势。对于微小的不稳定性问题，由于内在动力学机理未知，因此线性拟合是一个合适的模型，稳定性研究的基本模型可表示为：
y＝β0+β1x+ε
式中：β0和β1——回归系数；ε——随机误差分量；x——时间；y——样品中aoz含量。
斜率的估计值b1可按下式计算：
截距的估计值b0可按下式计算：
直线的标准偏差s：
斜率的标准偏差s(b1)：
在置信水平为95％时，如果│b1│<t0.95，n-2·s(b1)，则认为直线斜率不显著，表明样品的特性测量值是稳定的。
实验对样品进行了短期稳定性和长期稳定性进行检测。
样品长期存放在-20℃冰箱中保存，稳定性为期4个月，每个月测定一次。稳定性每次测定随机抽取3个样品，每个做2个平行样，进行样品的长期稳定性分析。
稳定检测结果如表6～表13所示。
表6冻干粉样品中sem稳定性检验结果(n＝4)
表7冻干粉样品中sem稳定性检验结果(n＝4)
根据线性回归数据可计算出直线标准偏差s＝及s(b1)；查表t0.95,3＝3.182，│b1│＝0.112，t0.95,3·s(b1)＝0.168，故│b1│<t0.95,3·s(b1)，斜率不显著，表明样品中sem在4个月内是稳定的。
表8冻干粉样品中aoz稳定性检验结果(n＝4)
表9冻干粉样品中aoz稳定数据稳定性分析结果(n＝4)
根据线性回归数据可计算出直线标准偏差s0.8250＝及s(b1)＝0.0914；查表t0.95,3＝3.182，│b1│＝0.089，t0.95,3·s(b1)＝0.1979，故│b1│<t0.95,3·s(b1)，斜率不显著，表明样品中aoz在4个月内是稳定的。
表10冻干粉样品中amoz稳定性检验结果(n＝4)
表11冻干粉样品中amoz稳定性检验结果(n＝4)
根据线性回归数据可计算出直线标准偏差s＝0.3401及s(b1)＝0.1297；查表t0.95,3＝3.182，│b1│＝0.246，t0.95,3·s(b1)＝0.3067，故│b1│<t0.95,3·s(b1)，斜率不显著，表明样品中amoz在4个月内是稳定的。
表12冻干粉样品中ahd稳定性检验结果(n＝4)
表13冻干粉样品中ahd稳定性检验结果(n＝4)
根据线性回归数据可计算出直线标准偏差s＝0.1370及s(b1)＝0.06076；查表t0.95,3＝3.182，│b1│＝0.124，t0.95,3·s(b1)＝0.193，故│b1│<t0.95,3·s(b1)，斜率不显著，表明样品中ahd在4个月内是稳定的。
实施例4
定值及不确定度评估
由9家认可实验室对低浓度冻干粉均采用液相色谱-串联质谱法检测，进行协同定值，定值结果及数据处理见表14～17。
表14各实验室冻干粉sem测定结果
表15各实验室冻干粉aoz测定结果
表16各实验室冻干粉amoz测定结果
表17各实验室冻干粉ahd测定结果
首先考察全部测量数据分布的正态性，经夏皮罗-威尔克法检验结果如下：
(1)冻干粉样品sem夏皮罗-威尔克法正态分布检验结果：
表18sem数据正态性检验
a.lilliefors显著水平修正
(2)冻干粉样品aoz夏皮罗-威尔克法正态分布检验结果：
表19aoz数据正态性检验
a.lilliefors显著水平修正
(3)冻干粉样品amoz夏皮罗-威尔克法正态分布检验结果：
表20amoz数据正态性检验
a.lilliefors显著水平修正
(4)冻干粉样品ahd夏皮罗-威尔克法正态分布检验结果：
表21ahd数据正态性检验
a.lilliefors显著水平修正
由上表18～表21可知p值大于0.05，说明数据符合正态分布。通过dps软件，采用格拉布斯(grubbs)法，在显著水平0.05的情况下，对sem、aoz、amoz、ahd定值数据进行检测，未发现异常值，所以数据全部用于标准值的计算。计算样品中sem、aoz、amoz、ahd的总平均值
本质控样品的不确定度主要由以下几个方面引起：(1)定值引起的不确定度uchar；(2)均匀性引起的不确定度ubb；(3)稳定性引起的不确定度ults
其中(1)定值引起的不确定度uchar分析如下：
通常由n个实验室进行测量，每个实验室测量p次，每个实验室的测量平均值为
协作测量的不确定度
按照上述公式计算得到ucharsem＝0.3880μg/kg，ucharaoz＝1.4985μg/kg，ucharamoz＝0.2305μg/kg，ucharahd＝0.3918μg/kg。
(2)不均匀引起的不确定度ubb
按照方差分析法对不均匀性引起的不确定度进行计算，当组间均方msamong＜组内均方mswithin，不均匀性引起的不确定度ubb＝sbb，计算公式如下：
——式中：n0为测量次数。
当组间均方msamong＞组内均方mswithin，不均匀性引起的不确定度ubb＝sbb，计算公式如下：
——式中：n0为测量次数。
均匀性单因素方差分析结果如上表2～表5所述，由表2可知sem单因素分析结果组间均方msamong＜组内均方mswithin，按公式(1-1)计算，aoz、amoz、ahd组间均方msamong＞组内均方mswithin，按公式(1-2)计算，计算结果如下：
(3)稳定性产生的不确定度ults
物质的稳定性产生的不确定度可通过质控样品稳定性随时间变化的趋势线(线性拟合)来得到，即以时间为x轴，以测量值为y轴，通过作图的方式，可估算出在有效期t内不确定度贡献值。
以测量值为y轴，以考察时间为x轴，得到拟合曲线斜率b1，斜率的估计值b1可按下式计算：
截距的估计值b0可按下式计算：
直线的标准偏差s：
斜率的标准偏差s(b1)：
在有效期t内的不确定度：ults＝s(b1)·t
由稳定性分析结果可知样品中sem、aoz、amoz、ahd长期稳定性产生的不确定度为：ults(sem)＝0.2106μg/kg；ults(aoz)＝0.3656μg/kg；ults(amoz)＝0.5188μg/kg；ults(ahd)＝0.2430μg/kg。
总不确定度u由下式给出：
设置信水平p＝95％,取包含因子k＝2，将上述各值依次带入公式，可求得质控样品中各目标总的不确定度为：
本发明质控样品最终定值结果为sem(13.79±1.31)μg/kg，aoz(45.80±3.13)μg/kg，amoz(5.68±1.16)μg/kg，ahd(9.26±0.94)μg/kg。