本发明涉及食品检测技术领域，具体是用于检测食品中二氧化硫脲含量的方法。
背景技术
二氧化硫脲（thioureadioxide）为白色粉末状晶体，具有还原性强，热稳定性好，储存运输方便等特点。二氧化硫脲在酸性条件下稳定，在碱性条件下具有强还原性，极性强。在工业中，二氧化硫脲作为还原剂、脱色剂与稳定剂，广泛用于印染、造纸、有机合成、胶卷工业等行业。二氧化硫脲有毒且有刺激性，高浓度持续吸入会引起咳嗽、气短和胸部紧束感，液体可引起眼部炎症和角膜混浊，口服会出现头痛、恶心、口腔和胃刺激，长期接触二氧化硫脲，可以引起肺水肿、窒息、昏迷甚至死亡。部分违法者将二氧化硫脲掺入米面及制品中，能起到增白的效果。为打击在食品中违法添加非食用物质和滥用食品添加剂的行为，截至2011年，原国家卫生部共发布了6批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，并于2014年底对其进行了修订，提出了《食品中可能违法添加的非食用物质名单》（征求意见稿）。两份名单都明确提出二氧化硫脲，加强对违法添加二氧化硫脲的打击力度。
在原国家卫生部发布的第四批食品中可能违法添加的非食用物质名单中，特别注明二氧化硫脲在食品中没有检测方法，需要研制相关检测方法。目前在食品中仍然没有二氧化硫脲的标准检测方法，文献中有提出分光光度法、荧光光谱法、离子对液相色谱法、阴离子交换离子色谱法、超高效液相色谱法、固相萃取－液相色谱－串联质谱法。对于这些方法中的高效液相色谱，按照文献中的色谱柱与提取液等条件进行试验，有些方法检测不到二氧化硫脲，有些方法中二氧化硫脲的提取效率较低，重复性差。因此，发明建立一种稳定可靠的测定食品中二氧化硫脲的方法尤为重要，具有现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种测定食品中二氧化硫脲含量的方法，其具有操作简单、准确度高、稳定性强和重复性好，还具有检测方法灵敏度高及检测效率高的特点。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种测定食品中二氧化硫脲含量的方法，其包括以下步骤：
步骤1、将待测食品制成样品，其中液状待测食品直接作为样品，膏状待测食品搅碎至颗粒直径不大于0.3mm作为样品，固体状待测食品粉碎至颗粒直径不大于0.3mm作为样品。
步骤2、称取步骤1的样品2.5g至离心管中，向离心管中分别加入5ml体积浓度0.5%～1.0%甲酸溶液，混匀后冰浴超声提取8～12min，用离心机于8000～12000r/min下离心2～5min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加入5ml体积浓度0.5%～1.0%甲酸溶液，混匀甲酸溶液与离心管中的剩余物后，冰浴超声提取8至12min，用离心机于8000～12000r/min下离心2～5min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用0.5%～1.0%甲酸溶液将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液。
步骤4、用0.22um水相微孔滤膜过滤步骤3制得的样品清液后，得到样品待测液。
步骤5、用高效液相色谱仪进行测定；高效液相色谱仪的测定条件为：色谱柱为hilic柱、3.5um、4.6×150mm；进样量为10ul；柱温为28至32℃；流速为0.8至1.2ml/min；测定波长190～450nm；流动相为纯水与乙腈的混合物；检测时间为6分钟。
将二氧化硫脲标准工作液及步骤4制得的样品待测液分别注入高效液相色谱仪中，测定样品待测液和二氧化硫脲标准工作液的峰面积，以二氧化硫脲标准工作液的色谱峰的峰面积为纵坐标y，以二氧化硫脲标准工作液的二氧化硫脲浓度为横坐标x，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。
步骤6、根据步骤5得到的标准曲线方程及样品待测液的色谱峰的峰面积，计算得到样品待测液的二氧化硫脲浓度a、单位为mg/l，再计算得出待测食品中二氧化硫脲含量检测值b，b=（a×v）/m、单位为mg/kg；其中v为步骤3定容的样品清液体积、单位为l，m为步骤2称取的样品质量、单位为kg。
优化方案，本发明的步骤5中用高效液相色谱仪测定时，测定波长为272nm。
进一步优化方案，本发明的步骤5中用高效液相色谱仪测定时，采用的流动相为纯水和乙腈的混合流动相，且纯水:乙腈的体积比为20:80。
进一步优化方案，本发明中步骤2和步骤3中二氧化硫脲的提取液是0.5%甲酸溶液。
本发明中，确定高效液相色谱仪的二氧化硫脲较佳的测定波长为272nm的原理是：采用高效液相色谱仪对标准空白与10.00mg/l的二氧化硫脲标准溶液分别进行测定，得到二氧化硫脲标准溶液色谱图，对色谱图进行光谱扫描。二氧化硫脲标准溶液的光谱图如图1所示，显示二氧化硫脲的最大吸收波长是272nm，因此本发明选择波长为272nm作为测定二氧化硫脲的较佳测定波长。
本发明中，确定高效液相色谱仪的流动相为纯水:乙腈=20:80的原理是：高效液相色谱仪的流动相从纯水:乙腈＝90:10开始，让纯水依次减少10%，乙腈相应依次增加10%，直到纯水:乙腈＝10:90。用25mg/l的二氧化硫脲标准溶液作为待测样品，采用本发明步骤5中相同的高效液相色谱测定条件，一共进行9组测试。实验结果显示：当纯水:乙腈≥50:50，溶剂出峰时间在2.00min左右，二氧化硫脲出峰时间都在溶剂峰之前或重叠，即二氧化硫脲此时在hilic色谱柱中无保留。当纯水:乙腈＝40:60时，如图2所示，二氧化硫脲出峰时间在2.116分钟，此时在hilic色谱柱中有保留；当纯水：乙腈＝30:70时，如图3所示，出峰时间在2.303min，此时在hilic色谱柱中保留进一步增强；当纯水：乙腈＝20:80时，如图4所示，出峰时间在2.640min，此时在hilic色谱柱中保留时间进一步延长；当纯水：乙腈＝10:90时，如图5所示出峰时间在3.885min，此时在hilic色谱柱中保留进一步延长，但峰面积减小，峰形变宽。因此，综合考虑峰面积与保留时间，选择纯水与乙腈为流动相，且纯水：乙腈＝20:80。
本发明中，确定食品中二氧化硫脲的提取液为0.5%～1.0%甲酸溶液的原理是：本发明人分别用以下6种提取液——纯水；0.05%甲酸溶液；0.10%甲酸溶液；0.25%甲酸溶液；0.50%甲酸溶液；1.00%甲酸溶液，采用本发明的方法及各步骤，其中步骤2和步骤3中“0.5%甲酸溶液”分别替换为上述7种提取液，对制品中二氧化硫脲的含量进行检测，已知该制品中二氧化硫脲的含量为25mg/kg，并对二氧化硫脲的回收率进行分析。结果显示，6种提取液——纯水；0.05%甲酸溶液；0.10%甲酸溶液；0.25%甲酸溶液；0.50%甲酸溶液；1.00%甲酸溶液，对样品中的二氧化硫脲的回收率分别为60.7%、68.5%、87.3%、93.1%、98.6%、98.5%。说明用纯水提取二氧化硫脲效果不好。用甲酸溶液提取二氧化硫脲时，随着甲酸溶液体积浓度增大，回收率不断提高，提取效率不断提高。当甲酸溶液为0.50%时，进一步提高乙酸铵浓度，不会增大乌洛托品的提取效率。不同浓度的甲酸溶液与二氧化硫脲提取回收率的关系图见图6。因此确定0.50%～1.0%甲酸溶液对食品中的二氧化硫脲进行提取。
本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步。
1、本发明根据待测物的理化性质，将二氧化硫脲在酸性条件下提取，采用分步提取、混合定容的步骤，实现小体积定容，极大降低方法检出限，提高了检测方法的灵敏度。方法具有操作简单、准确度高、稳定性强和可重复性好的特点。
2、本发明在液相色谱检测中采用纯水和乙腈作为流动相，流动相与提取液中均不加入缓冲盐与离子对试剂，就能实现强极性化合物二氧化硫脲的保留与定量，进一步确定流动相比例为纯水:乙腈＝20:80，具有出峰快、检测效率高的特点。
3、二氧化硫脲在酸性条件下是稳定的，在碱性条件下易分解，生成还原性很强的亚磺酸。本发明采用甲酸对食品中的二氧化硫脲进行提取。甲酸是最简单的羧酸，也是一元羧酸中酸性最强的酸。同样体积浓度的羧酸，甲酸的酸性更强，更有利于保持提取过程中二氧化硫脲的稳定，最大限度提高食品中二氧化硫脲的提取程度与效率。进一步确定食品中二氧化硫脲的提取液为0.5%甲酸溶液，具有提取效率高，回收率高的特点。
附图说明
图1为浓度为10.00mg/l的二氧化硫脲标准溶液的光谱图。
图2为流动相采用纯水:乙腈＝40:60时二氧化硫脲的色谱图。
图3为流动相采用纯水:乙腈＝30:70时二氧化硫脲的色谱图。
图4为流动相采用纯水:乙腈＝20:80时二氧化硫脲的色谱图。
图5为流动相采用纯水:乙腈＝10:90时二氧化硫脲的色谱图。
图6不同浓度的甲酸溶液与二氧化硫脲提取回收率的关系图。
图7为采用本发明的方法绘制的二氧化硫脲标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
一种测定食品中二氧化硫脲含量的方法，其包括以下步骤：
步骤1、将待测食品制成样品，本实施例的待测食品为由米面制成的固体食品，将该固体状待测食品粉碎至颗粒直径不大于0.3mm作为样品；本实施例的样品中未检出含有二氧化硫脲，因此先称取样品1kg，加入2mg二氧化硫脲，混匀得到样品p1，其二氧化硫脲含量加标水平为2mg/kg。
从步骤2开始进行六组平行试验，即称取2.5g步骤1的样品p1各6份，分别置于6个不同的离心管中，为六组平行试验，依次进行步骤2至4。
步骤2、称取2.5g步骤1的样品p1至离心管中，向离心管中分别加入5ml体积浓度0.5%甲酸溶液，混匀后冰浴超声提取8min，用离心机于8000r/min下离心5min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加5ml体积浓度0.5%甲酸溶液，混匀甲酸溶液与离心管中的剩余物后，冰浴超声提取8min，用离心机于8000r/min下离心5min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用0.5%甲酸将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液。
步骤4、用0.22um水相微孔滤膜过滤步骤3制得的样品清液后，得到样品待测液。
步骤5、用高效液相色谱仪进行测定。
高效液相色谱仪的测定条件为：色谱柱为hilic柱、3.5um、4.6×150mm；进样量为10ul；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；测定波长272nm；检测时间为6分钟；流动相为纯水和乙腈的混合流动相，且纯水:乙腈的体积比为20:80。
在上述测定条件下，将样品待测液和二氧化硫脲标准工作液分别注入高效液相色谱仪中，测定样品待测液和二氧化硫脲标准工作液的峰面积，以二氧化硫脲标准工作液的色谱峰的峰面积为纵坐标y，以二氧化硫脲标准工作液的二氧化硫脲浓度为横坐标x，绘制标准曲线，如图7所示，得到标准曲线方程为y=2.24186x+0.0737026。
其中，本实施例中二氧化硫脲标准工作液采用7个浓度的二氧化硫脲标准液，分别为：0、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00mg/l，其配制方法为：称取0.2500g二氧化硫脲标准物质，用0.5%甲酸溶液定容至100ml容量瓶中，再从100ml容量瓶中分别吸取0、40、80、200、400、1000、2000ul溶液用0.5%甲酸溶液定容至10ml容量瓶中，再从各10ml容量瓶中分别吸取100ul溶液用乙腈定容至1.00ml，得到浓度为0、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00、50.00mg/l的二氧化硫脲标准溶液。
步骤6、将样品待测液的色谱峰的峰面积，峰面积如表1所示，根据标准曲线方程，计算得到六组平行试验的样品待测液的二氧化硫脲浓度a、单位为mg/l，再计算得出六组平行试验的样品p1中二氧化硫脲的质量含量，作为二氧化硫脲含量检测值b，样品p1中二氧化硫脲含量检测值b的计算公式为：b=（a×v）/m、单位为mg/kg；其中v为步骤3定容的样品清液体积、单位l，m为步骤2称取的样品质量、单位kg；具体检测结果见表2。
实施例2
本实施例的测定食品中二氧化硫脲含量的方法，其包括以下步骤：
步骤1、将待测食品粉碎成颗粒直径不大于0.3mm的样品，本实施例中待测食品未检出含有二氧化硫脲，因此先称取样品1kg，加入4mg二氧化硫脲，混匀得到样品p2，其二氧化硫脲加标水平为4mg/kg。
从步骤2开始进行六组平行试验，即称取2.5g步骤1的样品p2各6份，分别置于6个不同的离心管中，为六组平行试验，依次进行步骤2至4。
步骤2、称取2.5g步骤1的样品p2至离心管中，向离心管中分别加入5ml体积浓度0.5%甲酸溶液，混匀后冰浴超声提取10min，用离心机于10000r/min下离心3min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加5ml体积浓度0.5%甲酸溶液，混匀甲酸溶液与离心管中的剩余物后，冰浴超声提取10min，用离心机于10000r/min下离心3min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用0.5%甲酸将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液。
步骤4至步骤6与实施例1的相同，其中本实施例中样品待测液的色谱峰的峰面积如表1所示，具体检测结果见表2。
实施例3
本实施例的测定食品中二氧化硫脲含量的方法，其包括以下步骤。
步骤1、将待测食品粉碎成颗粒直径不大于0.3mm的样品，本实施例中待测食品未检出含有二氧化硫脲，因此先称取样品1kg，加入20mg二氧化硫脲，得到样品p3，其二氧化硫脲加标水平为20mg/kg。
从步骤2开始进行六组平行试验，即称取2.5g步骤1的样品p3各6份，分别置于6个不同的离心管中，为六组平行试验，依次进行步骤2至4。
步骤2、称取2.5g步骤1的样品p3至离心管中，向离心管中分别加入5ml体积浓度0.5%甲酸溶液，混匀后冰浴超声提取12min，用离心机于12000r/min下离心2min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加5ml体积浓度0.5%甲酸溶液，混匀甲酸溶液与离心管中的剩余物后，冰浴超声提取12min，用离心机于12000r/min下离心2min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用0.5%甲酸将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液。
步骤4至步骤6与实施例1的相同，其中本实施例中样品待测液的色谱峰的峰面积如表1所示，具体检测结果见表2。
对本发明的测定食品中二氧化硫脲含量的方法的准确度与精密度进行衡量，具体见表3，各实施例的相对标准偏差rsd及回收率均符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求，因此本发明可准确、高效、稳定的用于测定食品中二氧化硫脲含量。