本发明涉及一种检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法及其在评价药物影响gfr中的应用，特别涉及一种检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法，属于药物评价领域。
背景技术
近年来慢性肾病(ckd)对人类的健康与生命已构成严重威胁。2013年，全世界3.47亿人罹患糖尿病，who认为到2030年，慢性肾病将是导致人类死亡的主要疾病之一，造成了严重的社会和经济负担。ckd的临床表现为肾小球率过滤(gfr)和尿微量白蛋白的升高。大量证据表明遗传因素、高血糖症、高血压以及高血脂都会导致或促进ckd的进程。尽管ckd正在逐渐被认识到是肾病中最主要的致病和致死的原因，现在依然没有针对ckd靶点的治疗方法，只能控制其他因素，如血压和血糖水平。
碘海醇(iohexol)又称碘苯六醇，是一种含碘造影剂。24h内几乎全部经肾小球滤过排泄，碘海醇血浆清除率可以作为衡量肾小球滤过率(gfr)的标准。一般血样中的碘海醇浓度较低，无法通过一般化学方法检测，需依赖特殊仪器进行检测，如荧光光谱分析、毛细血管电泳法、高效液相色谱法等。由于不同方法间灵敏度的差异，测量的碘海醇剂量各不相同。其中高效液相色谱仪可显著减少碘海醇使用的剂量，其用于评估肾功能时所用剂量约为5ml，为常规造影剂量的1/20，大大降低副反应发生率，评价准确，节约成本。
目前针对慢性肾病的研究实验对象主要是啮齿类动物，但啮齿类动物其发病机制及病理生理改变与人类肾病差别较大，研究结果的应用有很大局限性。非人灵长类动物与人类遗传物质有高度同源性，在组织结构，生理代谢及免疫系统等方面与人类高度相似，是最理想的非人慢性肾病模型实验动物。其中，恒河猴是文献报道使用最多的非人灵长类慢性肾病模型，其肾脏病变特点与人类慢性肾病相似，可持续观察肾脏相关血液，尿液，活检指标，是极具价值肾病研究模型。自发性慢性肾病恒河猴的发病机理和病程发展与人类高度相似，同时也避免了对各器官的毒性损伤，是进行临床前药效试验的最佳选择。
目前临床用于肾病检测的方法多种，用于药物评价的疾病检测方法需要更准确更稳定，不仅检测同一个患者的gfr，而是检测gfr在不同时间段的变化程度。因此，建立一种准确稳定评价自发性慢性肾病恒河猴血浆中碘海醇的方法，对慢性肾病的基础研究和临床早期诊断，药效评价有着重要意义。
目前应用hplc法测定碘海醇含量已有文献报道，如文献(滕南雁，王维等，高效液相色谱法测定碘海醇注射液的含量，药物分析杂志，1996，(06)：399-400)报道了一种测定注射液中碘海醇含量的方法，但该方法分析对象为碘海醇注射液，其样品前处理方法与本专利公开的针对恒河猴血浆样品的前处理方法有本质不同。此外，该文献报道的hplc检测方法，碘海醇保留时间在19-21分钟，分析时间长，检测效率低，不适合临床药物评价中生物大样本的分析。再如文献(chitnissd,akhlaghif等，developmentandvalidationofanhplc-uvmethodforiodixanolquantificationinhumanplasma[j].journalofchromatographyb,2008,869(1):133-137)，该文献报道了一种用于血浆中碘海醇含量的测定方法，但该方法对象为人血浆非恒河猴血浆。此外，检测样品的rsd均大于5％，检测数据波动较大，影响肾小球滤过率评价的准确性。鉴于此，建立简单，快速，准确，专属性强的恒河猴血浆碘海醇含量评价方法，是本发明亟待解决的问题。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法，为药效评价提供有效的实验数据。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明公开的一种检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法，包括以下步骤：
1)标准品工作液及标准曲线的制备：配制多个浓度的标准品工作液，所述标准品工作液为碘海醇的甲醇溶液；
2)内标标准品溶液的制备：配制碘海醇杂质i工作液；
3)样品前处理：取空白血浆10-50μl，加入相应浓度的标准品工作液或质控样品溶液10-50μl，加入内标溶液40-100μl，混匀，离心，取上层清液30-80μl，混入100-400μl纯水，混匀，备用；
4)碘海醇的测定，其中，色谱条件如下：
色谱柱：c18色谱柱；
流动相：流动相a：甲醇，流动相b：水；
等度洗脱：洗脱时间3-10min；
温度：20℃～40℃；
流速：0.2ml/min～1.5ml/min；
检测器：uv；
色谱图检测波长：190nm～320nm；
进样体积：1μl～20μl。
优选的，步骤1)中，多个标准品工作液的浓度分别为800-1000μg/ml、600-800μg/ml、400-600μg/ml、200-400μg/ml、100-200μg/ml、50-100μg/ml、25-50μg/ml和10-25μg/ml。
优选的，步骤1)中，称取碘海醇标准品5-20mg，精密称定，置于5-20ml容量瓶中，加入甲醇溶解完全后，用甲醇定容至刻度线，混匀即得0.5-2mg/ml的储备液；再取储备液按等比逐级稀释得到所述标准品工作液的浓度。
进一步的，步骤2)中，称取碘海醇杂质i标准品5-20mg，精密称定，置于5-20ml离心管中，先加入1-4ml超纯水超声溶解后，转移至5-20ml容量瓶中，用甲醇清洗离心管2-4次并将洗液转移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，混匀即得0.5-2mg/ml的储备液；取0.5-2mg/ml的储备液2-10ml加入20-60ml甲醇中，充分混匀即得50-200μg/ml的碘海醇杂质i工作液。
进一步的，步骤3)中，混匀采用涡旋混匀，离心转速为5000-14000rpm，离心时间5-20min。
优选的，步骤4)中，所述c18色谱柱以c18为基础，填料为硅胶的色谱柱；内径为1-6mm，粒径1.5-7μm；长度50-400mm的色谱柱。
优选的，步骤4)中，所述流动相b为磷酸水，所述磷酸水的ph＝2-5。
进一步的，步骤4)中，所述等度洗脱采用15％-30％的流动相a和85-70％的流动相b；温度：20-40℃；流速：0.5-1.5ml/min；色谱图检测波长：220-380nm；进样体积：5-15μl。
进一步的，步骤4)中，所有标准品、质控样品和恒河猴血浆样品均需要重复检测2-3次，所有样品的rsd不得大于4-7％；若rsd大于4-7％，则需要重新配制样品，再检测。保证血浆样品检测的稳定性和重复性，降低数据的波动性。
上述检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法不包括其在疾病的诊断和治疗中的应用。
优选的，上述检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法在评价药物影响gfr中的应用，包括以下步骤：
1.用10ml注射器吸取5ml的碘海醇注射液，注射前后分别使用电子天平称量注射器重量以准确计算注射量。静脉缓慢推注，记录注射结束的准确时间作为实验的开始时间。
2.分别在注射碘海醇的120、150、180、210和240分钟，时间误差在±15秒内，采集2ml前置静脉血到肝素钠抗凝真空采血管，血液采集完成时间误差小于15s。
3.血液样本3000rpm离心10min，吸取血浆，冻存于-80℃冰箱。
4.使用高效液相色谱仪进行检测，进样分析，得到检测结果。
5.根据检测获得的各时间点血药浓度，根据一室模型计算得到血浆清除率cl1。其中，cl1＝注射碘海醇剂量/auc(auc：碘海醇注射后120分钟到240分钟内的血浆浓度曲线下面积)。
6.根据brochner-mortensen公式对数值进行纠正。
7.经过体表面积矫正得到最终gfr[ml/min/1.73m2]。
本发明具有以下有益效果：
采用本发明公开的超高效液相色谱法检测碘海醇的含量，稳定准确，省时省力。碘海醇是一种理想的gfr外源性标志物。超高效液相色谱法用于碘海醇清除率测定评估gfr所需剂量较小，极大地提高了肾脏安全性。
本发明建立基于hplc-uv的恒河猴血浆样品中碘海醇含量的测定方法，经过系统优化后采用甲醇直接沉淀蛋白，样品预处理简单，回收率高，专属性强。分析时间仅用10分钟对碘海醇进行快速检测；所用标准品，内标和试剂廉价稳定；配制方法简单，有利于方法推广；样品检测rsd小于5％，反复检测数据波动小，有很好的重现性，可稳定准确测定恒河猴血浆中碘海醇的含量。适用于药物评价中生物大样本分析，对肾脏病新药研发具有指导意义。
附图说明
图1为不同色谱柱下的碘海醇的色谱图；
图2-1为梯度洗脱下的碘海醇的色谱图；
图2-2为等度洗脱下的碘海醇的色谱图；
图3为不同检测波长下的碘海醇的色谱图；
图4为不同内标物检测下碘海醇的色谱图；
图5为不同柱温下的碘海醇的色谱图；
图6-1为空白血浆1的色谱图；
图6-2为空白血浆2的色谱图；
图6-3为空白血浆3的色谱图；
图6-4为空白血浆4的色谱图；
图6-5为空白血浆5的色谱图；
图6-6为空白血浆6的色谱图；
图6-7为混合血浆的色谱图；
图6-8为只加入400μg/ml碘海醇标准溶液的色谱图；
图6-9为只加入内标物100μg/ml碘海醇杂质i的色谱图；
图6-10为动物120min时间点的实测结果色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图，对本发明进行进一步详细说明。
一种检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法，包括以下步骤：
(1)标准曲线标准品溶液的制备：称取碘海醇标准品10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解完全后，用甲醇定容至刻度线，混匀即得1mg/ml的储备液。取储备液按照等比逐级稀释得到一系列浓度的标准品工作液(1000,800,600,400,200,100,50,25μg/ml)。具体方法如下：取1mg/ml的储备液1600μl加入400μl甲醇中，涡旋混匀即得800μg/ml的碘海醇工作液；取800μg/ml的碘海醇工作液1000μl加入1000μl甲醇中，涡旋混匀即得400μg/ml的碘海醇工作液；取800μg/ml的碘海醇工作液300μl加入300μl的400μg/ml碘海醇工作液中，涡旋混匀即得600μg/ml的碘海醇工作液；取400μg/ml的碘海醇工作液600μl加入600μl甲醇中，涡旋混匀即得200μg/ml的碘海醇工作液；取200μg/ml的碘海醇工作液600μl加入600μl甲醇中，涡旋混匀即得100μg/ml的碘海醇工作液；取100μg/ml的碘海醇工作液600μl加入600μl甲醇中，涡旋混匀即得50μg/ml的碘海醇工作液；取50μg/ml的碘海醇工作液600μl加入600μl甲醇中，涡旋混匀即得25μg/ml的碘海醇工作液。
(2)内标标准品溶液的制备：称取碘海醇杂质i标准品10mg，精密称定，置于15ml离心管中，先加入2ml超纯水超声3min充分溶解后，全部转移至10ml容量瓶中，用甲醇清洗离心管3次并将洗液转移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度线，混匀即得1mg/ml的储备液。取1mg/ml的储备液5ml加入45ml甲醇中，充分混匀即得100μg/ml的碘海醇杂质i工作液。
(3)样品前处理：取空白血浆25μl，加入相应浓度标线或质控样品溶液25μl，内标溶液75μl，涡旋混匀3min，12000rpm离心10min,取上清50μl，与200μl纯水混合，涡旋混匀1min，转入进样瓶，检测备用。
(4)碘海醇的测定：其中，色谱条件如下：
色谱柱：thermoacclaimtm120c18(5μm,4.6×250mm)；
流动相：流动相a：甲醇，流动相b：ph＝3的磷酸水；
等度洗脱：15％a-75％b，洗脱时间10min；
温度：30℃；
流速：1ml/min；
色谱图检测波长：254nm；
进样体积：10μl。
为说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
1、色谱柱的选择
本发明对比了目前广泛使用的两种不同色谱柱：(a)hipersilgolddim.(mm)250×4.6,5μm；(b)thermoacclaimtm120c18(5μm,4.6×250mm)。从两种柱子的液相对比谱图，见图1中可以明显看出，待分析成分在b型色谱柱较a型色谱柱分离效果好，b图中的色谱峰峰形优于a图。考虑到最终成分指认结果的准确性，排除a型色谱柱，因此本发明优化选用了thermoacclaimtm120c18色谱柱。
2、洗脱方式的筛选：
(a)梯度洗脱：采用溶剂a：甲醇，溶剂b：ph＝3的磷酸水，记录如下：
0-2min，3％a-15％a；2-15min，15％a-100％a；15-18min，100％a-100％a；18-20min，100％a-3％a；
(b)等度洗脱：采用溶剂a：甲醇，溶剂b：ph＝3的磷酸水，记录如下：
15％a-75％b，洗脱时间10min；
经以上两种方式的比较，梯度洗脱两组色谱峰较难分离，峰形较差，所以选择等度洗脱。
3、dad检测器采集波长的选择：
对比210，254，280，321nm不同检测波长的碘海醇图谱，254nm下峰形较窄，吸光度最高，分离度较好，因此作为典型的吸收波长。不同检测波长下的碘海醇的色谱图见图3。
4、内标物的选择
在以上的色谱条件下，主要筛选了多尼培南和碘海醇杂质i两种内标物，其中碘海醇杂质i价格比较优惠，稳定性更好，比多尼培南更易保存，二者峰形一致，出峰时间较接近，都能与碘海醇的峰完全分离，所以最终选择了碘海醇杂质i，在不同内标物检测下碘海醇的色谱图，见图4。
5、温度的选择
进样盘的温度从15℃优化到了4℃，这样更有利于生物样品的保存。
柱温箱的温度从40℃优化到了30℃，在30℃时碘海醇和内标物的色谱峰能完全分离开，其色谱图见图5。
6、样品前处理的优化
(a)人血浆样品前处理：取血浆150μl，加入3倍体积即450μl的乙腈，涡旋混合30s，4℃静置10min，12000r/min，4℃离心10min，将上清液转移至ep管中，40℃氮气吹干，残余物用80ml的乙腈：水(3:1，v/v)超声复溶，进样检测。
(b)猴血浆样品前处理：取血浆25μl，加入甲醇100μl，涡旋混匀3min，12000r/min，4℃离心10min，取上清50μl，与200μl纯水混合，涡旋混匀1min，转入进样瓶，进样检测。
人血浆前处理的方法对血浆的消耗量比较大，相对而言猴血浆样品前处理的方法更加节约样品，节约试剂，也能达到完全沉淀蛋白，进样检测的要求。
7、方法学考察
(1)方法特异性考察
取6个不同个体的空白动物血浆和1个混合空白血浆，血浆前处理，即取血浆25μl，加入甲醇100μl，涡旋混匀3min，12000rpm离心10min，取上清50μl，与200μl纯水混合，涡旋混匀1min，转入进样瓶，进样检测所得的色谱图如下(图6-1至6-7)，与只加入400μg/ml碘海醇标准溶液(图6-8)，只加入内标物100μg/ml碘海醇杂质i(图6-9)，和动物120min时间点的实测结果(图6-10)比较。
(2)标准曲线
取碘海醇浓度分别为25、50、100、200、400、600、800和1000μg·ml-1的标准曲线血浆，按“血浆处理方法”项下操作，进样10μl检测。共处理3条标准曲线，以碘海醇浓度(μg·ml-1，c)为横坐标，碘海醇面积与内标峰面积比(ratio，y)为纵坐标，用加权(w＝1/c2)最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程。得线性方程为：y＝0.0419x+4.0734，r2＝0.9991，各浓度点准确度均在85％～115％范围内，符合要求，定量下限为25μg/ml。
(3)精密度和准确度考察
取质控血浆，测定3个分析批，每批中每个浓度6个样品，按“血浆处理方法”项下操作后检测，根据当日标准曲线计算样品的浓度和准确度，日内精密度各标准系列浓度点的rsd均小于5％，且准确度在85～115％内，符合要求日间精密度各标准系列浓度点的rsd均小于5％，符合要求。
(4)稳定性考察
1)短期稳定性
取质控血浆(75μg/ml，300μg/ml，700μg/ml)，每个浓度配制3个样品，于室温放置4h后，考察血浆在室温放置4h的稳定性；质控血浆处理后的提取液在进样瓶中室温放置4h，18h，24h后，测定浓度，考察血浆处理后提取液的室温4h，18h,24h稳定性；经过检测结果分析血浆在室温放置4h稳定性大于90％；血浆处理后提取液在进样瓶中室温放置4h，18h，24h稳定性大于90％，符合检测要求。
2)冻融稳定性
将不同冻融次数的质控血浆(75μg/ml，300μg/ml，700μg/ml)分装好以后-80℃冻存。取出-80℃贮存24h以上需冻融3次的质控血浆室温解冻，解冻完全后，将解冻的样品于-80℃再次冷冻12h以上；次日取出-80℃贮存24h以上需冻融3次和需冻融2次的质控血浆室温解冻，解冻完全后，将解冻的样品于-80℃再次冷冻12h以上；第三日取出-80℃贮存24h以上需冻融3次，需冻融2次和需冻融1次的质控血浆室温解冻，解冻完全后，将解冻的样品于-80℃再次冷冻12h以上；最后一日取出前几天的所有冻融样品和冻前的质控血浆，室温解冻后，3个浓度的质控血浆，每个浓度平行3份，按“血浆处理方法”项下操作后检测，根据当日标准曲线计算样品浓度，得出血浆-80℃反复冻融三次与冻融前比较，稳定性均大于90％，符合检测要求。
3)长期稳定性
将质控血浆配制好以后-80℃冻存，至少间隔一个月，定期取出冻存的质控血浆室温解冻，3个浓度的质控血浆，每个浓度平行3份，按“血浆处理方法”项下操作后检测，根据当日标准曲线计算样品浓度，将一个月后的检测值与一月前方法学考察时室温稳定性考察0h点的检测值进行比较，得到的稳定性均大于90％，一个月的样品稳定性符合要求。
上述检测恒河猴血浆中碘海醇含量的方法在评价药物影响gfr中的应用实施例如下：
一、实验前准备
准备进行gfr检测的动物进行称重，计算麻醉剂量。
二、实验流程
1.根据当日动物数，使用10ml注射器吸取5ml碘海醇注射液，注意在避光的条件下进行，装上静脉输液针后使用电子天平称重，标上序号待用。
2.麻醉开始，按2分钟/只的速度对所有动物依次肌肉注射10mg/kg的氯胺酮。
3.麻醉10分钟后，按2分钟/只的速度对所有动物依次上肢静脉注射5ml碘海醇注射液，注射过程控制在30秒内完成，同时准确记录开始注射和注射完成的时间，精确至秒。注射完成后计算出实际注射碘海醇量。
4.分别于注射碘海醇的120min，150min，180min，210min和240min采集前置静脉血到肝素钠抗凝真空采血管。注意严格控制采血时间，血液采集完成时间误差小于15秒。
5.每个时间点血液采集完成后，血样离心10分钟。吸取血浆到ep管中，随后冻存于-80℃冰箱待分析。
三、血液样品检测
采用上述检测恒河猴血浆中碘海醇含量的专属方法进行检测。
四、肾小球率过滤(gfr)计算
1.根据检测获得的各时间点血药浓度，根据一室模型计算得到血浆清除率cl1。cl1＝注射碘海醇剂量/auc(auc：碘海醇注射后120分钟到240分钟内的血浆浓度曲线下面积)
2.根据brochner-mortensen公式对数值进行纠正。
3.经过体表面积矫正得到最终gfr[ml/min/1.73m2]。
五、dh-1药效评价
1.动物分组及剂量设计
组别设计：对照组和空白对照组，共2组。对照组每组3只动物，空白对照组3只动物，共6只。
剂量设计：对照品为0.6mg/kg/次，每天1次。
表1组别设计信息
2.给药信息
给药途径：采用口服方式进行给药。
给药剂量：0.6mg/kg/次。
给药频率及选择理由：每天1次。
给药时间：每天上午给食前。
3.对gfr的影响
dh-1对肾病恒河猴gfr的影响见表2。
placebo组：与基线值比较，给药期间，gfr略微有所降低。
dh-1组：与基线值比较，给药期(d1-d60)gfr呈升高趋势，给药d30天gfr显著升高35.52％(p<0.05)，与安慰剂组比差异极显著(p<0.01)，给药60天结束后略有降低，但与基线值比较仍升高16.46％(p<0.05)，与安慰剂组比差异显著(p＜0.05)。恢复期28天，gfr与基线值比较升高21.15％。
表2dh-1连续给药60天后对糖尿病肾病恒河猴gfr的影响
注：“#”与基线比p<0.05。
4.讨论
在慢性肾病的临床诊断中，肾小球滤过滤(gfr)是衡量肾小球滤过功能的重要指标之一，目前临床上主要有内源性标志物测定gfr和外源性标志物测定gfr两种方法，前者操作简便，费用低廉，病人顺应性高，但是由于内源性标志物受体内影响因素多，稳定性差，并不能准确的反映真实的gfr水平，后者临床上虽然操作较为繁琐，却可以真实稳定地反应肾小球滤过功能，因此常作为慢性肾病诊断的金指标用于临床与科研试验。
碘海醇是临床上普通使用的造影剂，在体内几乎不代谢，静脉注射后只通过肾脏以原型排出，是评价gfr理想的外源性生物标志物。本次试验我们采用碘海醇作为标志物，静脉注射后在各时间点通过hplc方法测定血中碘海醇的浓度来评价gfr水平。
本次试验结果显示，dh-1组3例动物连续经口给药60天后，与基线值比较，gfr平均升高了16.46％。对gfr有较强的改善作用，安慰剂组3例动物对gfr未见有明显的改善。
5.结论
在本实验体系下，dh-10.6mg/kgbid剂量下显著改善肾病恒河猴gfr水平(16.46％)，安慰剂组bid剂量下对糖尿病肾病恒河猴gfr水平未见明显改善。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。