本发明属于水体检测技术领域，涉及一种微生物测定，特别是一种微生物生化需氧量的测定传感器制备方法。
背景技术：
随着有机化工等行业的迅速发展，水体中有机化合物的含量有种类不断增加，对环境和人类健康造成了巨大的危害。然而对水体中各有机组分的进行定量检测难度较大，因此现代检测技术中常用生化需氧量(biochemicaloxygendemand，bod)来衡量水体有机污染程度。目前，国内外常用五日生化需氧量标准稀释法(bod5)测定，其定义是：在标准条件下，五天内好氧微生物氧化分解单位体积水中有机物所消耗的游离氧的数量。此方法具有适用范围广和对设备要求低等优点，但是该方法费时耗力、操作繁琐、重现性差。故需要一种检测时间短、操作简便、稳定性好、适用范围广的新方法来测定bod。
目前所报导的微生物bod传感器主要可以分为两大类，一类是溶解氧型，一类是电信号型。其中溶解氧型微生物bod传感器，是利用了微生物氧化分解水体中有机物的过程中同时消耗水体中的溶解氧，导致溶解氧降低，借助于相应的装置就能检测到水体中溶解氧浓度的变化，产生相应的信号。这一信号的大小与水样中的bod含量存在一定的线性关系，可以间接地检测出水体中的bod值。中国专利(200910090646.2)“以酿酒酵母作为生物识别元件快速测定bod的方法”与中国专利(201410204412.7)“胶原纤维负载酿酒酵母作为生物传感器识别元件快速测定bod的方法”都属于溶解氧型微生物bod传感器，并对性能进行了表征。电信号型微生物传感器，是将微生物氧化分解水体中有机物时，呼吸链中所产生的电子通过电子介导体转移到细胞外环境，借助于电化学装置便能检测到相应的电信号。电信号的强弱与水体中的bod浓度具有一定的线性关系，可以间接地检测出水体中的bod值。中国专利(00809995.2)“一种富集微生物的电化学方法,用于分析有机物和生化需氧量的生物传感器”与中国专利(201310111201.4)“一种高锰酸钾作阴极电子受体构建双室微生物燃料电池型bod传感器的方法”都属于电信号型微生物bod传感器，并对性能进行了表征。
细菌纤维素是指由醋酸菌属(acetobacter)、土壤杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)和八叠球菌属(sarcina)等中的某种微生物合成的纤维素。细菌纤维素和植物或海藻产生的天然纤维素具有相同的分子结构单元,均是由单一的d-葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键链状连接而成。但细菌纤维素纤维却有许多独特的性质，如高结晶度和高聚合度、极强的亲水性与持水性、较强的弹性模量和抗张强度、较高的生物相容性和环境可降解性。细菌纤维素的直径约为10～100nm，且具有极高的长径比，它可以形成精致的三维网状结构，能够较好地包埋酵母防止其脱落。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的技术存在上述问题，提出了一种微生物生化需氧量的测定传感器制备方法，其采用细菌纤维素固定化酵母作为敏感元件，实现快速精准检测微生物的应用效果。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种微生物生化需氧量的测定传感器制备方法，包括以下步骤：
1)将玻碳电极在麂皮上顺次用1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝抛光粉打磨，然后依次用超纯水、无水乙醇分别超声洗涤5min，使玻碳电极表面形成光滑的镜面，而后浸泡在无水乙醇中，得到预处理的玻碳电极；
2)以去离子水为分散介质，配制浓度为0.5～2.5mg/ml的科琴黑分散液，用移液枪取5μl上述科琴黑分散液滴涂于步骤1)中所得的玻碳电极上，室温下干燥，得到科琴黑修饰的玻碳电极；
3)将酿酒酵母冻干粉分散于4wt％葡萄糖溶液中，在恒温摇床中复水活化30min，控制摇床转速为180rpm，温度为37℃；将活化好的酿酒酵母用0.01m的pbs缓冲液洗涤两次，其中pbs缓冲液ph＝7；并用0.01m的pbs缓冲液调节酿酒酵母分散液的浓度为2mg/ml，得到适用的酵母分散液；
4)取适量步骤3)中所得的酵母分散液，用移液枪缓慢加入适量20mm的甲萘醌/乙醇溶液，并确保最终混合液中甲萘醌的浓度为0.2mm，最后搅拌30min，得到适用的酵母/甲萘醌混合液；
5)将细菌纤维素分散液稀释至0.02～0.24wt％，并通过机械搅拌使分散液保持均匀；将步骤4)中的酵母/甲萘醌混合液用移液枪缓慢滴加于细菌纤维素分散液中，边滴加边机械搅拌，并控制细菌纤维素分散液与酵母/甲萘醌混合液的体积比为1:1，搅拌10min，得到细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液；
6)用移液枪取20ul步骤5)中的细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液滴涂于步骤2)中所得的玻碳电极上，于4℃下低温干燥12h，最终制得以细菌纤维素固定化酵母作为敏感元件的微生物生化需氧量测定传感器。
本发明克服目前bod测试技术费时耗力、操作繁琐和重复性差等问题。本发明利用滴涂法将科琴黑分散液负载到工作电极表面，待其干燥后再将细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液负载滴涂于到科琴黑修饰后的工作电极上，形成一种载体覆膜。载体覆膜不仅能够将酵母固定于工作电极上，也能防止科琴黑在测试过程中脱落，形成了一种对水体中的有机物有响应的薄膜。然后利用电极表面的固定化微生物对有机物进行氧化分解，通过电化学测试方法进行测定。本发明利用科琴黑作为导电剂，由于其良好的导电性和高比表面积可以增强电流信号；利用细菌纤维素不但包埋固定了酵母，而且也防止了科琴黑在测试过程中发生脱落，提高了测试的稳定性。
在上述的微生物生化需氧量的测定传感器制备方法中，所述科琴黑分散液中，科琴黑的浓度为0.5～2.5mg/ml；细菌纤维素分散液中，细菌纤维素的浓度为0.02～0.24wt％；细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液中酵母的浓度为2mg/ml，甲萘醌的浓度为0.1mm，细菌纤维素的浓度为0.01～0.12wt％。
在上述的微生物生化需氧量的测定传感器制备方法中，所述pbs缓冲液为0.01m的nah2po4—na2hpo4，ph＝7；甲萘醌/乙醇溶液中，溶剂为99.5％的无水乙醇，甲萘醌的浓度为20mm。
与现有技术相比，本微生物生化需氧量的测定传感器制备方法，制备得到的微生物bod传感器操作简便、成本低廉、快速准确，可用于判断水体中的有机污染程度，具有重要的现实意义。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
微生物生化需氧量的测定传感器制备方法，包括以下步骤：
1)将玻碳电极在麂皮上顺次用1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝抛光粉打磨，然后依次用超纯水、无水乙醇分别超声洗涤5min，使玻碳电极表面形成光滑的镜面，而后浸泡在无水乙醇中，得到预处理的玻碳电极；
2)以去离子水为分散介质，配制浓度为0.5～2.5mg/ml的科琴黑分散液，用移液枪取5μl上述科琴黑分散液滴涂于步骤1)中所得的玻碳电极上，室温下干燥，得到科琴黑修饰的玻碳电极；
3)将酿酒酵母冻干粉分散于4wt％葡萄糖溶液中，在恒温摇床中复水活化30min，控制摇床转速为180rpm，温度为37℃；将活化好的酿酒酵母用0.01m的pbs缓冲液洗涤两次，其中pbs缓冲液ph＝7；并用0.01m的pbs缓冲液调节酿酒酵母分散液的浓度为2mg/ml，得到适用的酵母分散液；
4)取适量步骤3)中所得的酵母分散液，用移液枪缓慢加入适量20mm的甲萘醌/乙醇溶液，并确保最终混合液中甲萘醌的浓度为0.2mm，最后搅拌30min，得到适用的酵母/甲萘醌混合液；
5)将细菌纤维素分散液稀释至0.02～0.24wt％，并通过机械搅拌使分散液保持均匀；将步骤4)中的酵母/甲萘醌混合液用移液枪缓慢滴加于细菌纤维素分散液中，边滴加边机械搅拌，并控制细菌纤维素分散液与酵母/甲萘醌混合液的体积比为1:1，搅拌10min，得到细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液；
6)用移液枪取20ul步骤5)中的细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液滴涂于步骤2)中所得的玻碳电极上，于4℃下低温干燥12h，最终制得以细菌纤维素固定化酵母作为敏感元件的微生物生化需氧量测定传感器。
科琴黑分散液中，科琴黑的浓度为0.5～2.5mg/ml；细菌纤维素分散液中，细菌纤维素的浓度为0.02～0.24wt％；细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液中酵母的浓度为2mg/ml，甲萘醌的浓度为0.1mm，细菌纤维素的浓度为0.01～0.12wt％。
pbs缓冲液为0.01m的nah2po4—na2hpo4，ph＝7；甲萘醌/乙醇溶液中，溶剂为99.5％的无水乙醇，甲萘醌的浓度为20mm。
本发明利用滴涂法将科琴黑分散液负载到工作电极表面，待其干燥后再将细菌纤维素/酵母/甲萘醌混合液负载滴涂于到科琴黑修饰后的工作电极上，形成一种载体覆膜。载体覆膜不仅能够将酵母固定于工作电极上，也能防止科琴黑在测试过程中脱落，形成了一种对水体中的有机物有响应的薄膜。然后利用电极表面的固定化微生物对有机物进行氧化分解，通过电化学测试方法进行测定。本发明利用科琴黑作为导电剂，由于其良好的导电性和高比表面积可以增强电流信号；利用细菌纤维素不但包埋固定了酵母，而且也防止了科琴黑在测试过程中发生脱落，提高了测试的稳定性。
第一制备样品中，步骤2)中采用0.5mg/ml的科琴黑分散液，步骤5)中将细菌纤维素分散液稀释至0.24wt％；其它步骤一致，制备形成样品传感器(a)。
第二制备样品中，步骤2)中采用2.5mg/ml的科琴黑分散液，步骤5)中将细菌纤维素分散液稀释至0.02wt％；其它步骤一致，制备形成样品传感器(b)。
第三制备样品中，步骤2)中采用1.0mg/ml的科琴黑分散液，步骤5)中将细菌纤维素分散液稀释至0.12wt％；其它步骤一致，制备形成样品传感器(c)。
通过电化学测试方法对样品传感器制备过程中不同阶段进行表征。通过扫描电镜照片可知科琴黑是纳米颗粒，其拥有极大的比表面积。通过细菌纤维素/酵母/甲萘醌的扫描电镜照片，可知纳米尺寸的细菌纤维素能够很好地包埋固定微米级的酵母细胞。通过不同修饰电极的eis图，可知科琴黑的加入极大地提高了修饰电极的导电性。通过微生物bod传感器的时间电流响应曲线，可知在一定时间后，能够检测到输出电流值的增加。通过微生物bod传感器对不同浓度gga溶液的标准曲线图，可知响应电流的增加值与bod含量之间具有良好的线性关系性。
分别使用样品传感器(a)、(b)、(c)对水体进行检测，得出表1数据。
表1
通过表1数据可知品传感器(a)、(b)、(c)均能检测出水体中的bod，实现良好的水体监测功能。
本微生物生化需氧量的测定传感器制备方法，制备得到的微生物bod传感器操作简便、成本低廉、快速准确，可用于判断水体中的有机污染程度，具有重要的现实意义。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。