鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中A、B、J亚群禽白血病病毒的检测方法与流程

本发明属于禽白血病病毒检测领域，尤其涉及一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中a、b、j亚群禽白血病病毒的检测方法。

背景技术：

禽白血病(avianleukosis，al)是由禽白血病病毒(avianleukosisvirus，alv)引起的鸡的各种可传播的良性和恶性肿瘤病以及免疫抑制性疾病。alv属于反转录病毒科、α反转录病毒属，分为a-k11个不同亚群，其中6个外源性(a、b、c、d、j、k)和1个内源性(e)共7个亚群可自然感染鸡，其中较常见的为a、b、j亚群，k亚群为近年来从东南亚地区固有地方品种鸡中发现的新亚群。被外源性alv感染的鸡群除诱发死亡外，临床上多以免疫抑制、生长抑制和各器官组织出现肿瘤等为主要特征，对养禽产业造成了严重的损失。

alv的感染既可以通过垂直传播也可以通过水平传播。除此之外，相关文献报道接种了被外源性alv污染的疫苗，不仅感染的鸡群有可能发生相应的肿瘤或对生产性能有不良影响，更严重的是会造成一些带毒鸡将alv垂直传播给后代，从而会在下一代雏鸡中诱发更高的感染率和发病率。尽管目前部分大型种禽公司开展了对alv的净化工作并取得成效，但临床生产中仍时有禽白血病的发生，而且表现各异，因此活疫苗中外源性禽白血病病毒的检测对于禽白血病的净化和防控具有极其重要的意义。

市售商品化活疫苗中a、b、j亚群禽白血病病毒的检测方法主要是采用直接pcr的方法，但是直接pcr检测可能出现扩增出的目的片段是基因片段而不是完整的活病毒或者出现假阳性的情况。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种有效、准确、可靠的鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中a、b、j亚群禽白血病病毒的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中a、b、j亚群禽白血病病毒的检测方法，采用dmem对商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗进行倍比稀释后过滤，然后接种单层df-1细胞，于5％co2、37℃温箱中作用2h后更换为含1％fbs的dmem培养至第6天；收集部分细胞培养上清液进行禽白血病病毒p27群特异性抗原检测并抽取其cdna进行alv-a、b、j亚群的pcr鉴定；对阳性样品细胞孔用亚群特异性单抗进行ifa检测。

上述检测方法，按以下步骤操作进行：

(1)无菌条件下将2mldmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium)加入商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中，对其进行溶解；

(2)将溶解的疫苗使用商品化dmem进行倍比稀释，稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，将疫苗的各稀释液用直径为0.22μm的一次性过滤器(jetbiofil公司)过滤去除杂质以及减少部分粒子较大的病毒(alv、ibv、ndv直径依次为80-145nm、120nm、100～500nm)后，取100μl接种于长成80％左右的单层df-1细胞，2h后更换成含1％fbs的dmem维持培养6天，通过观察细胞的生长状况，筛选出疫苗的最佳稀释比例为1∶8，然后进行a、b、j亚群禽白血病病毒检测；

(3)按1∶8稀释疫苗，疫苗稀释液以24孔板复孔取100μl作用于长满80％的单层df-1细胞2h，随后换成含1％fbs的dmem维持培养6天；

(4)收集细胞培养物上清，进行alv-p27抗原检测(禽白血病病毒p27群特异性抗原)；alv-p27阳性样品收集细胞培养物抽取cdna，用群特异性引物进行a、b、j亚群禽白血病病毒的pcr鉴定，其对应阳性孔细胞用亚群特异性单抗进行ifa检测；

(5)鉴定结果为alv阳性样品者则取同一批号另一瓶疫苗按照上述步骤进行复检，以排除其他人为操作等污染的可能性。

alv-p27抗原检测所用试剂盒为idexxalv-p27试剂盒。

稀释液为gibco生产的dmem。

维持培养液为含1％fbs的商品化dmem。

由于鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中新城疫病毒、传染性支气管炎病毒含量多，禽白血病病毒病毒含量少，当三者混合感染细胞会产生溶细胞现象，且这些疫苗毒在细胞上的复制及其细胞致病作用对样品中可能存在的alv在df-1细胞上复制产生负面影响，而alv在df-1细胞中复制需要的时间较长。鉴于此，发明人建立了一种鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中a、b、j亚群禽白血病病毒的检测方法，采用dmem对商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗进行倍比稀释后过滤，然后接种单层df-1细胞，于5％co2、37℃温箱中作用2h后更换为含1％fbs的dmem培养至第6天；收集部分细胞培养上清液进行禽白血病病毒p27群特异性抗原检测并抽取其cdna进行alv-a、b、j亚群的pcr鉴定；对阳性样品细胞孔用亚群特异性单抗进行ifa检测。该法中过滤可有效除去相对于alv较大的病毒粒子及其它杂菌，有效减少并降低这些疫苗毒在细胞上的复制及其细胞致病作用对样品中可能存在的alv在df-1细胞上复制的负面影响，使疫苗中的alv活病毒在df-1细胞中进行有效的增殖；同时，多种检测方法进行结合避免了某些检测方法的缺陷从而提高了alv的检出率。实验结果证明，该法成功从鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中检测出一株alv-j并命名为gx14yya1。本发明具有具有灵敏、准确、可靠等特点，对禽白血病的检测及防控具有重要的意义。

附图说明

图1是商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗培养条件优化的结果图，图中：从上至下、从左至右的稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64。

图2是本发明鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中a、b、j亚群禽白血病病毒的检测方法的流程图。

图3是具体检测中使用alv分型引物对病毒分离后的细胞培养物进行pcr鉴定的结果图，图中：m为dl2000dnamaker；1为阴性对照；2为alv-a扩增结果；3为alv-b扩增结果；4为alv-j扩增结果。

图4是间接免疫荧光检测结果图，图中分别为毒株gx14yya1在df-1细胞中针对j亚群单抗ifa结果；毒株gx14yya1在df-1细胞中针对a亚群单抗ifa结果；毒株gx14yya1在df-1细胞中针对b亚群单抗ifa结果；阴性对照结果。

具体实施方式

1.疫苗

市售商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗。

2.方法

2.1引物设计

引物参照文献设计，并由上海华大生物工程有限公司合成，alv的分型引物见表1。

表1引物序列

2.2市售商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗培养条件的优化

无菌条件下将2mldmem(dulbecco’smodifiedeaglemedium，gibco生产，c11995500bt，500ml/瓶)加入商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中，对其进行溶解；将溶解的疫苗使用商品化dmem进行倍比稀释，稀释比例分别为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，将疫苗的各稀释液的用直径为0.22μm的一次性过滤器去除杂质以及减少部分粒子较大的(ndv直径为100～500nm)病毒后，取100μl接种于长成80％左右的单层df-1细胞，2h后更换成含1％fbs(foetalbovineserum，胎牛血清)的dmem维持培养6天。然后在荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态，结果如图1所示，1∶2和1∶4可见细胞脱落较多，1∶8、1∶16、1∶32和1∶64细胞生长良好，故采用其最小稀释度1∶8为最优条件。

2.3病毒分离

采用前述中最优稀释倍数(1∶8)稀释、过滤后的疫苗，取100μl稀释液接种于24孔板复孔长满80％的单层df-1细胞2h，随后换液含1％fbs的dmem维持培养6天。一部分细胞培养上清置于-80℃直至进行alv-p27抗原的检测，剩下的细胞培养物反复冻融3次后用通用型柱式基因组dna抽提试剂盒按照说明书进行样品cdna的提取，作为pcr扩增检测的模板。

2.4病原鉴定

用idexx生产alv-p27抗原检测试剂盒(alv-p27试剂盒，99-09254，5*96)并按试剂盒的说明对细胞培养上清进行p27抗原的检测。

以收集的细胞培养物按试剂盒说明书提取cdna分别进行a、b、j亚群的pcr检测。alv-a/b的pcr反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，50℃退火45秒，72℃延伸2分钟，共31个循环，最后72℃延伸10分钟。alv-j的pcr反应程序为94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，56℃退火45秒，72℃延伸2分钟，共31个循环，最后72℃延伸10分钟。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定pcr产物。结果如图3所示：alv-a和alv-b为阴性，alv-j为阳性。

将上述在37℃，5％co2条件下培养6天后的细胞孔，用pbs洗涤3次，每次2min；然后用4℃保存的冷乙醇∶丙酮(v/v＝2∶3)固定细胞5min，pbs洗涤3次，每次2min；将alv-j单抗je9按1∶250稀释，分别加至试验组和空白对照组细胞孔中，每孔150μl，在37℃湿盒中孵育3h，pbs洗涤3次，每次2min；加入fitc标记的兔抗鼠荧光抗体，按1∶300稀释，每孔150μl，在37℃湿盒中继续孵育45min。pbs洗涤3次后在倒置荧光显微镜下观察。

如图4所示，抗alv-a和alv-b单克隆抗体呈阴性反应，抗alv-j单克隆抗体呈阳性反应，感染组df-1细胞胞质中有绿色荧光而胞核无荧光，而阴性对照组中细胞胞质中未见绿色荧光。结果表明，实验用市售商品化鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中检测到一株alv-j(命名为gx14yya1)。

序列表

<110>广西大学

<120>鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗中a、b、j亚群禽白血病病毒的检测方法

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