本发明属于医药技术领域，具体涉及到一种同时测定丹七制剂中三种脂溶性成分含量的方法。
背景技术
丹七制剂处方全方由丹参、三七两味药组成，方中以丹参活血通络、凉血消肿、清心除烦、袪瘀止痛为君；三七甘缓温通，苦降下泄，有散瘀止血、消肿定痛之功；二药合用共奏活血散瘀消肿定痛之功效。临床上多用于淤血所致的疾患，如：胸痹心痛、淤血头痛、跌打损伤、月经不调、产后瘀阻所致小腹疼痛，创伤性血肿、痛经、恶露不尽、冠心病、心绞痛、高血压等。丹七类制剂类型除了最早的丹七片剂之外，还出现了颗粒剂、胶囊剂等。这些丹七制剂因其配方不同，或者配方比例不同，或者提取精制方法不同，或者剂型不同，治疗效果也有所差异。
目前，对丹七制剂的研究主要集中在亲水性的丹酚酸及皂苷类成分，对于亲脂性成分的研究则相当有限。丹参和三七均富含脂溶性成分，常见的包括菜油甾醇(campesterol)、豆甾醇(stigmasterol)和β-谷甾醇(β-sitosterol)等植物甾醇类成分，及铁锈醇(ferruginol)、桉油烯醇(spathulenol)、镰叶芹醇(falcarinol)等萜醇类成分。这些成分具有抗炎、降低血液胆固醇、防治冠状动脉粥样硬化、预防心血管疾病等作用，有必要也对该类成分含量进行控制。因此有必要开发一种适合于检测丹七制剂中甾醇类成分的方法，以便简便、全面、快速评价丹七制剂的质量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种采用气相色谱-质谱法(gc-ms)同时测定丹七制剂中甾醇类含量的方法。在该法中，气相色谱仪与质谱仪采用串联的方式，气相色谱仪相当于质谱仪的“进样器”，试样经色谱分离后以纯物质形式进入质谱仪；质谱仪相当于气相色谱仪的“检测器”。该方法可以充分发挥气相色谱的高分离效率以及质谱定性定量检测的专属性能力，可更好的综合评价丹七制剂的质量，指导丹七制剂的生产，使消费者更全面认识该产品质地。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种采用气相色谱质谱联用法同时测定丹七制剂中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的方法，其中气相色谱条件：毛细管色谱柱；载气为高纯度氦气，流速1.0ml/min，分流比40:1；进样口温度250℃，程序升温条件：初始温度40℃，以15℃/min升至280℃，保持20min；质谱分析条件：电离方式为电子轰击离子源，电子能量70ev，质量扫描质荷比40m/z～550m/z；离子源温度280℃。
在一些实施方式中，本发明方法采用的毛细管色谱柱为db-5ms色谱柱。
在一些实施方式中，本发明方法采用的db-5ms色谱柱的规格为30mm×0.25mm，0.25μm。
在一些实施方式中，本发明方法以5α-胆甾烷为内标，所述丹七制剂经皂化处理，tmcs衍生化。
在一些实施方式中，本发明方法用于同时检测丹七制剂中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的含量。
在一些实施方式中，本发明方法所检测的丹七制剂包括三七丹参片、三七丹参颗粒、丹七片、丹七颗粒、丹七胶囊、丹七软胶囊、复方丹参滴丸。
本发明的方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：本发明方法能够在同一个检测条件下同时检测不同丹七制剂中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇3种甾醇类成分含量，避免了不同丹七制剂在甾醇类成分检测中频繁更换检测条件，提高了工作效率，适合工业化大生产的要求。
附图说明
图1：实施例1对照品标准溶液的gc-ms分析离子流图；其中1为5α-胆甾烷；2为菜油甾醇；3为豆甾醇；4为β-谷甾醇。
具体实施方案
下述是结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1：丹七制剂中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇含量的检测
(1)仪器
trace1310/tsq8000型气相色谱-质谱联用仪(美国thermo公司)，sb-800dtd型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)，分析天平(bsa224s，sartorius)，0.22μmptfe滤膜(天津津腾实验设备有限公司)。
(2)试剂与样品
对照品菜油甾醇(纯度≥95％)、豆甾醇(纯度≥95％)、β-谷甾醇(纯度≥95％)和5α-胆甾烷均购自美国sigma公司；bstfa(双三氟乙酰胺，含1％tmcs(三甲基氯硅烷))(supelco公司)；二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、95％乙醇、浓盐酸、koh(ar，国药集团化学试剂有限公司)。丹七片(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，批号：14120431，14120810，14120906，14122188，14122189)、美纳达丹七软胶囊(北京长城制药厂，批号13110105，13110215，14090101，14100101，14110113)、复方丹参滴丸(天士力制药集团股份有限公司，批号：140618，140619，141204，141218，150106)均购自京卫大药房。
(3)仪器操作条件
气相色谱条件：db-5ms毛细管色谱柱(30mm×0.25mm，0.25μm)；载气为高纯度氦气，流速1.0ml/min，分流比40:1；进样口温度250℃，升温条件：初始温度40℃，以15℃/min升至280℃，保持20min。
质谱分析条件：电离方式为电子轰击离子源(ei离子源)，电子能量70ev,质量扫描质荷比(m/z)40～550；离子源温度280℃。
(4)混合对照品溶液的配制
精密称取菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇对照品各适量置10ml棕色量瓶中，正己烷溶解并定容到刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
(5)内标溶液的配制
精密称取5α-胆甾烷5.0mg于50ml棕色量瓶中，正己烷溶解并定容到刻度，摇匀，得质量浓度为0.10mg/ml的5α-胆甾烷内标溶液。
(6)供试液的制备：
丹七方类药物中结合态的甾醇主要是以糖苷和酯态形式存在，因此先用酸液水解使糖苷态的甾醇游离出来，再用碱液皂化使酯态甾醇游离出来，而游离态甾醇可以直接用溶剂提取。称取2.0g样品于20ml具塞试管中，加入1.0ml5α-胆甾烷内标溶液及3ml4mol/lhcl的95％乙醇溶液，于80℃水解60min，水浴冷却至室温。在酸水解液中加入6ml4.0mol/lkoh的95％乙醇溶液，于80℃水解120min，水浴冷却至室温。取2ml皂化液于20ml具塞玻璃试管中，加入5ml正己烷、1ml去离子水，室温下超声振荡10min，取2.5ml正己烷萃取液于色谱瓶中，用氮气吹干；加入200μlbstfa(含1％tmcs)试剂80℃下衍生60min后，冷却加入0.3ml正己烷，进行gc-ms分析，进样量1.0μl。
(7)方法学考察
线性关系考察
精密移取菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇对照品溶液适量于10ml棕色量瓶中，配制成6个不同浓度的混合对照品溶液，各加入1ml0.10mg/ml的内标溶液，内标浓度均为10μg/ml。对上述不同浓度混合对照品溶液各取1ml，用氮气吹干后，加入200μlbstfa(含1％tmcs)试剂，80℃下衍生60min后，冷却加入0.3ml正己烷，进行gc-ms分析。以各标样浓度x(μg/ml)为横坐标，相应标样与内标的峰面积之比y为纵坐标进行回归分析，得到各甾醇的线性方程及其相关系数分别为：菜油甾醇y＝0.0311x+0.0034(r＝0.9996)，线性范围1.00～20.0μg/ml；豆甾醇y＝0.0337x+0.0109(r＝0.9996)，线性范围1.84～46.0μg/ml；β-谷甾醇y＝0.0453x-0.0189(r＝0.9997)，线性范围8.32～104.0μg/ml。
精密度试验
精密吸取混合对照品溶液1.0μl，按(3)仪器操作条件，连续进样6次分析，分别测定各对照品与内标峰面积，计算其比值，结果菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇峰面积比值rsd分别为1.4％，1.2％和0.9％，表明该测定法精密度良好。
稳定性试验
分别取同一批号的丹七片(14120431)、丹七软胶囊(14110113)和复方丹参滴丸(140618)供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12小时进样分析，计算甾醇成分与内标峰面积比值及rsd，结果丹七片中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的峰面积比值rsd分别为1.9％，1.9％和1.6％；丹七软胶囊中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的峰面积比值rsd分别为1.7％，1.8％和1.1％；复方丹参滴丸中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的峰面积比值rsd分别为1.5％，1.8％和1.3％；表明不同丹七方类药物供试品溶液在12h内均稳定。
重复性试验
分别取同一批号的丹七片(14120431)、丹七软胶囊(14110113)和复方丹参滴丸(140618)药物按“(6)供试液的制备”方法制备供试品溶液6份分别进样，计算各甾醇成分与内标峰面积比值及rsd。结果丹七片中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的峰面积比值rsd分别为2.6％，2.2％和1.9％；丹七软胶囊中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的峰面积比值rsd分别为2.3％，2.3％和1.5％；复方丹参滴丸中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的峰面积比值rsd分别为2.7％，2.9％和2.2％；表明该测定方法重复性良好。
加样回收率试验
取同一批号的丹七片(14120431)、丹七软胶囊(14110113)和复方丹参滴丸(140618)药物，分别加入适量甾醇混合对照品溶液，按“(6)供试液的制备”方法制备供试品溶液，按(3)仪器操作条件进样分析，以计算所得的实际值与加入量的比值即为其准确度。结果丹七片中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的加样回收率分别为98.2％，99.3％和100.9％，rsd分别为2.6％，3.0％和2.9％；丹七软胶囊中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的加样回收率分别为97.2％，96.9％和98.3％，rsd分别为2.2％，2.8％和3.1％；复方丹参滴丸中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的加样回收率分别为97.9％，96.5％和101.2％，rsd分别为3.3％，2.7％和3.1％；表明该方法可用于不同丹七方类药物中甾醇含量的检测。
实施例2丹七制剂中菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇含量的测定
将不同批号的丹七片、丹七软胶囊和复方丹参滴丸按照实施例1方法制备供试品溶液，进行gc-ms分析，测定不同丹七方类药物中β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的含量，结果见表1。
表1不同丹七方类药物中甾醇类成分的含量(n＝3)
本发明采用气相色谱-质谱联用法(gc-ms)测定不同丹七方类药物中3个脂溶性成分--β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的含量。方法准确度高，重现性好、适用性强，通过保留时间和质谱定性，可准确的测定不同该类药物中这3个脂溶性成分的含量。从测定结果可以看出，植物甾醇类成分在不同剂型的该类药物中含量有较大差异，相对含量从高到低依次为丹七软胶囊、丹七片和复方丹参滴丸。β-谷甾醇作为天然植物脂质中分布最广的甾醇类物质，不仅可降低人体对胆固醇的吸收，还可降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的含量，其在三种药物中的含量均最高，推测其为该类药物的降脂相关成分；豆甾醇具有抗肿瘤、降低血液胆固醇、抗骨关节炎等多种药理作用，在三种药物中含量仅次于β-谷甾醇，菜油甾醇则含量最低。此外，实验结果显示不同丹七方类药物脂溶性成分含量的有一定的差异，推测其可能与药物加工过程中采用不同的制剂工艺有关，丹七软胶囊剂型能相对较好的保留脂溶性成分成分；这一结果也为进一步探讨丹七类药物的制剂工艺和临床疗效提供了一定的理论依据；同时，亦可将其作为该类药物质量评价的参考指标之一。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。