本发明涉及一种测定马来酸氟伏沙明中各降解杂质的方法。
背景技术
马来酸氟伏沙明作用于脑神经细胞的5-羟色胺再摄取抑制剂，临床用于抗抑郁。目前国内外均有生产。
马来酸氟伏沙明及其杂质ⅰ～ⅴ的化学结构如表1所示，关于马来酸氟伏沙明杂质的控制方法，usp41-nf36、bp2018、jp17均有收载，中国药典未收载此品种，现有转正标准ybh34112005(原料)及ybh33832005(片)。
表1马来酸氟伏沙明和杂质的结构式
现行标准中，bp2018采用马来酸氟伏沙明系统使用性对照品(包含杂质ⅰ、杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅴ)、杂质ⅳ对照品定位，针对性强，准确性高、灵敏度和分离度也好，但由于英国杂质对照品购买周期长，价格高，导致购买困难，从而限制了方法的普及性。
jp17采用相对保留时间定位各个杂质，并采用校正因子计算各杂质的量，此方法容易受未知杂质干扰，出现定位困难的现象。usp41-nf36则取马来酸氟伏沙明6mg至25ml容量瓶中，120℃加热10分钟，冷却至室温后加3.0ml盐酸，水浴10分钟，同时加入50mg马来酸氟伏沙明，定容。系统破坏实验可破坏出杂质ⅱ、杂质ⅲ，采用相对保留时间定位，并用校正因子计算杂质含量。但在实验过程中发现，破坏出的杂质ⅲ(相对保留时间0.50～0.53)前面有一个未知峰(相对保留时间0.40～0.45)，相对保留时间与杂质ⅲ比较接近(见图1)，用相对保留时间定位时可能难以判定哪个是杂质ⅲ(特别是当供试品中在杂质ⅲ出峰时间附近只有一个峰时，难以判定是未知杂质还是杂质ⅲ)，且该方法对另一个降解杂质ⅳ仅采用相对保留时间定位，缺乏准确性。所以usp(美国药典)的方法也不能完全适用。
国内标准(原料及片剂)使用相对保留时间定位杂质ⅱ，同时将杂质ⅰ、杂质ⅲ、杂质ⅳ和杂质ⅴ均作为其他杂质控制，存在问题与jp17一致，方法针对性、准确性均不足。由于杂质ⅲ、杂质ⅳ、杂质ⅴ对照品难以购买，而这些杂质又是马来酸氟伏沙明必然降解产物，如果要改善该品种质量标准中杂质控制针对性不足或方法难以普及的现状，就必须寻求一种便捷的方式，以保证在日常的检验过程中可轻易获得含有杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ的溶液，用于该品种测试分析中有关物质杂质定位。
技术实现要素：
为了弥补已有检测标准中方法专属性与准确性问题，同时避免因对照品难以购买或价格过于昂贵而导致方法难以推行的缺点。寻找一种能在一般实验室条件下获取杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ、同时减少干扰杂质的简便途径，以解决马来酸伏氟沙明中杂质的定位问题，使杂质的测定具有针对性。
本发明的目的在于提供一种测定马来酸氟伏沙明中各降解杂质的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种测定马来酸氟伏沙明中各杂质的方法，包括以下步骤：
1)取马来酸氟伏沙明和马来酸标准品，用溶剂溶解，再加入碱溶液，密封，95～100℃加热0.8～2h，冷却，加入酸溶液，95～100℃加热120～180s，得破坏溶液；
取待测马来酸氟伏沙明样品，用流动相配制成供试品溶液；取供试品溶液稀释作为对照品溶液；
2)将上述破坏溶液、供试品溶液、对照品溶液分别进行液相色谱检测；
3)结果分析：如果供试品溶液的色谱图中出现与破坏溶液中杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ色谱行为一致的杂质峰，则说明待测样品中存在相应杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ；若需进一步计算待测样品中杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ的含量，则按下式进行计算：
所述杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ的结构式分别为
进一步的，步骤1)中，马来酸与马来酸氟伏沙明标准品和质量比为0.5～2.0：1。
进一步的，步骤1)中，所述流动相为40～50％v/v甲醇溶液，或者为含1～1.5％m/v磷酸氢二铵和0.2～0.3％m/v庚烷磺酸钠的溶液-甲醇，其中含1～1.5％m/v磷酸氢二铵和0.2～0.3％m/v庚烷磺酸钠的溶液的ph值为2.8～3.2，且其与甲醇的体积比为45～55：45～55。
进一步的，步骤1)中，所述供试品溶液中马来酸氟伏沙明样品的浓度为0.8～2mg/ml。
进一步的，步骤1)中，所述对照品溶液中马来酸氟伏沙明样品的浓度为0.8～2μg/ml。
进一步的，步骤3)中，校正因子f获得方法为：
取马来酸氟伏沙明及马来酸氟伏沙明杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ标准品，分别配制成一系列不同浓度的溶液，分别用2～5根不同色谱柱对所有不同浓度的溶液分别进行液相色谱检测，以浓度x对峰面积y进行回归，得各组检测的回归方程，并计算出不同色谱柱情况下杂质ⅰ～ⅴ相对于马来酸氟伏沙明的校正因子，取所有不同色谱柱柱情况下校正因子的平均值，即分别得杂质ⅰ～ⅴ的校正因子f。
进一步的，步骤3)中，杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ相对于马来酸氟伏沙明的校正因子f分别为1.1、1.0、1.0、0.36、0.89。
一种用于测定马来酸氟伏沙明中各杂质的破坏溶液，该破坏溶液的制备方法为：取马来酸氟伏沙明和马来酸标准品，用溶剂溶解，再加入碱溶液，密封，95～100℃加热0.8～2h，冷却，加入酸溶液，95～100℃加热120～180s，得破坏溶液。
进一步的，破坏溶液总体积与马来酸氟伏沙明标准品用量之间的关系为：每10ml破坏溶液中马来酸氟伏沙明标准品的用量为10～20mg。
上述所述破坏溶液在检测马来酸氟伏沙明杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本专利为了提高方法的针对性和准确性，避免使用杂质对照品从而提高方法的普及性，特发明一种马来酸氟伏沙明中各降解杂质的测定方法用于测定马来酸氟伏沙明原料及片剂中的降解杂质。
(2)本发明方法可定向破坏出杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ，且干扰杂质小，不影响各杂质的定位，解决了usp41-nf36系统适用性溶液中杂质ⅲ易受干扰，杂质ⅳ缺乏准确性的问题。即在一般实验条件下，可获得含杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ用于hplc系统中杂质的定位，同时，由于杂质ⅴ位于杂质ⅱ和主成分之间，本发明方法能够控制杂质ⅱ和主成分之间的分离度不小于4.0，确保杂质ⅱ、杂质ⅴ和马来酸氟伏沙明峰之间的分离度能符合要求。
(3)本发明方法针对性强、准确度高，同时又避免使用昂贵且难以购买的杂质对照品，使得方法易于普及推广，具有很好的应用价值。
附图说明
图1采用usp41-nf36系统适用性破坏方法检测的图谱；
图2为本发明方法所得破坏溶液的系统图谱；
图3为供试品图谱。
具体实施方式
一种测定马来酸氟伏沙明中各杂质的方法，
1)取马来酸氟伏沙明和马来酸标准品，用溶剂溶解，再加入碱溶液，密封，95～100℃加热0.8～2h，冷却，加入酸溶液，95～100℃加热120～180s，得破坏溶液；
取待测马来酸氟伏沙明样品，用流动相配制成供试品溶液；取供试品溶液稀释作为对照品溶液；
2)将上述破坏溶液、供试品溶液、对照品溶液分别进行液相色谱检测；
3)结果分析：如果供试品溶液的色谱图中出现与破坏溶液中杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ色谱行为一致的杂质峰，则说明待测样品中存在相应杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ；若需进一步计算待测样品中杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ的含量，则按下式进行计算：
所述杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ的结构式分别为
优选的，步骤1)中，马来酸与马来酸氟伏沙明标准品和质量比为0.5～2.0：1。
优选的，步骤1)中，所述溶剂选自45～95％v/v甲醇溶液、45～95％v/v乙醇溶液中的至少一种。
优选的，步骤1)中，破坏溶液总体积与马来酸氟伏沙明标准品用量之间的关系为：每10ml破坏溶液中马来酸氟伏沙明标准品的用量为10～20mg。
优选的，步骤1)中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁中的至少一种。
优选的，步骤1)中，所述酸选自盐酸、硝酸、硫酸中的至少一种。
优选的，步骤1)中，所述流动相为40～50％v/v甲醇溶液，或者为含1～1.5％m/v磷酸氢二铵和0.2～0.3％m/v庚烷磺酸钠的溶液-甲醇，其中含1～1.5％m/v磷酸氢二铵和0.2～0.3％m/v庚烷磺酸钠的溶液的ph值为2.8～3.2，且其与甲醇的体积比为45～55：45～55。
优选的，步骤1)中，用来稀释供试品溶液的稀释剂为流动相溶液或40～50％v/v甲醇溶液。
优选的，步骤1)中，所述供试品溶液中马来酸氟伏沙明样品的浓度为0.8～2mg/ml。
优选的，步骤1)中，所述对照品溶液中马来酸氟伏沙明样品的浓度为0.8～2μg/ml。
优选的，步骤3)中，校正因子f获得方法为：
取马来酸氟伏沙明及马来酸氟伏沙明杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ标准品，分别配制成一系列不同浓度的溶液，分别用2～5根不同色谱柱对所有不同浓度的溶液分别进行液相色谱检测，以浓度x对峰面积y进行回归，得各组检测的回归方程，并计算出不同色谱柱情况下杂质ⅰ～ⅴ相对于马来酸氟伏沙明的校正因子，取所有不同色谱柱柱情况下校正因子的平均值，即分别得杂质ⅰ～ⅴ的校正因子f。
优选的，步骤3)中，杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ相对于马来酸氟伏沙明的校正因子f分别为1.1、1.0、1.0、0.36、0.89。
一种用于测定马来酸氟伏沙明中各杂质的破坏溶液，该破坏溶液的制备方法为：取马来酸氟伏沙明和马来酸标准品，用溶剂溶解，再加入碱溶液，密封，95～100℃加热0.8～2h，冷却，加入酸溶液，95～100℃加热120～180s，得破坏溶液。
优选的，马来酸与马来酸氟伏沙明标准品和质量比为0.5～2.0：1。
优选的，所述溶剂选自45～95％v/v甲醇溶液、45～95％v/v乙醇溶液中的至少一种。
优选的，破坏溶液总体积与马来酸氟伏沙明标准品用量之间的关系为：每10ml破坏溶液中马来酸氟伏沙明标准品的用量为10～20mg。
优选的，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁中的至少一种。
优选的，所述酸选自盐酸、硝酸、硫酸中的至少一种。
上述所述破坏溶液在检测马来酸氟伏沙明杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ中的应用，杂质ⅱ、ⅲ、ⅳ的结构式如上所述。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种测定马来酸氟伏沙明中各降解杂质的方法
马来酸氟伏沙明中杂质ⅰ(见表1)为工艺杂质；杂质ⅱ～ⅴ(见表1)为降解杂质，在各破坏条件下均会不同程度被降解出来；根据产品结构特性，其中杂质ⅱ、杂质ⅲ杂质ⅳ、杂质ⅴ为主要降解杂质。通过各破坏实验表明，采用马来酸氟伏沙明对照品可破坏出杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ。并经过反复试验，对马来酸氟伏沙明对照品采用本发明方法进行破坏时，干扰杂质较小(从图1中可以看出，采用usp破坏方法时，杂质ⅲ之前有一个跟其峰面积相当的干扰峰，会引起定位干扰；而从图2中可以看出，本发明方法所得破坏溶液中杂质ⅲ的峰面积远远比前面的峰大，不会造成定位干扰)，可获得含杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ的系统适用性溶液用于主要降解杂质的定位。
以马来酸氟伏沙明原料为例，阐述本发明方法在日常检验马来酸氟伏沙明中各降解杂质工作中的具体操作：
1)取马来酸氟伏沙明标准品(国内有供应)约15mg，置顶空瓶中，加入马来酸10mg，用甲醇-水(体积比55:45)混合溶液2ml使溶解，再加入0.2mol/l氢氧化钠溶液1ml，密封，水浴加热(95～100℃)1.5小时，取出，放冷至室温，加入1mol/l盐酸溶液1ml，水浴加热(95～100℃)2分钟，放冷至室温，转移至10ml量瓶中，用甲醇-水(55:45)混合溶液稀释至刻度，摇匀，即获得马来酸氟伏沙明杂质ⅱ、杂质ⅲ、氟伏沙明和杂质ⅳ的混合溶液，作为系统适用性溶液(以下称破坏溶液)。
上述破坏出杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ，既可以满足定位需要而不用购买杂质对照品，又可以解决usp(美国药典)方法中杂质定位受干扰的问题。
2)取待测马来酸氟伏沙明原料(批号s13060802)适量，用流动相(含1.25％磷酸氢二铵与0.275％庚烷磺酸钠的溶液(用磷酸调节ph值至3.0)-甲醇，二者体积比为45:55)配制成每ml体系含1.5mg马来酸氟伏沙明原料的供试品溶液；
取供试品溶液，用流动相进行稀释制成每1ml中含1.5μg马来酸伏氟沙明标准品的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
3)取上述破坏溶液、供试品溶液、对照品溶液分别注入液相色谱仪，分析。破坏溶液测得马来酸氟伏沙明杂质ⅲ、杂质ⅱ、氟伏沙明和杂质ⅳ色谱峰，且各色谱峰的分离度应大于4.0(见图2)。对照品溶液中出现氟伏沙明色谱峰。供试品溶液中除了出现被测物氟伏沙明的色谱峰外，可能出现杂质ⅲ、ⅱ、ⅴ、ⅳ和杂质ⅰ的色谱峰，也可能不出现杂质的色谱峰，这取决于产品的质量。本次供试品溶液的色谱图如图3所示，含有杂质ⅱ～ⅴ，其中保留时间为14.823的色谱峰为杂质ⅲ，保留时间为21.972的色谱峰为杂质ⅱ，保留时间为24.389的色谱峰为杂质ⅴ、保留时间为38.769的色谱峰为杂质ⅳ。
4)结果计算
供试品溶液的色谱图中，如果出现与破坏溶液中杂质ⅱ、ⅲ、ⅳ色谱行为一致的杂质峰，则说明待测供试品溶液中存在相应杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ；杂质ⅰ和ⅴ在破坏溶液中虽然未出现，但可通过相对保留时间定位。若需进一步计算待测样品中杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ的含量，则按下式进行计算：
式中：f为各杂质相对于马来酸氟伏沙明的校正因子(f)，解决杂质检测的准确性问题。
上述校正因子(f)及相对保留时间的具体测定方法如下：
购买马来酸氟伏沙明及国外杂质对照品(马来酸氟伏沙明杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ)，使用3根不同品种的色谱柱(zorbaxeclipseplusc8、thermobdshypersilc8、kromasilkr100-5c8)，见表2。取马来酸氟伏沙明及国外杂质对照品马来酸氟伏沙明杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ适量，在0.5ug/ml至21ug/ml范围内配制一系列浓度，精密量取溶液20ul，进样，记录色谱图，以浓度(x)对峰面积(y)进行回归，得回归方程，并计算出各杂质相对于马来酸伏氟沙明的校正因子，同时计算各杂质平均相对保留时间(r)。具体数值见下表2。
本发明同时通过购买国外杂质对照品，测定各杂质的校正因子，通过校正因子采用自身对照法，即可准确检测出各降解杂质的量，解决了bp2018中测定成本昂贵的问题。
表2杂质ⅰ～ⅴ相对于马来酸伏氟沙明的校正因子(f)及平均相对保留时间(r)
本实施例对待测样品最终测得的杂质ⅱ～ⅴ含量分别为0.11％、0.15％、0.03％、0.05％，未检测出杂ⅰ，见表3。
表3待测样品中各杂质的含量
上述结果说明通过一个简单的破坏实验，并测得各杂质相对于马来酸氟伏沙明的校正因子，使得在日常的检验工作中，可以通过一个容易获得的马来酸氟伏沙明对照品(国内有供应)，准确而又有针对性地测定被测物中各杂质的含量，从而有效控制产品的质量。
实施例2一种测定马来酸氟伏沙明中各降解杂质的方法
1)取马来酸氟伏沙明标准品(国内有供应)约15mg，置顶空瓶中，加入马来酸10mg，用甲醇-水(体积比55:45)混合溶液2ml使溶解，再加入0.2mol/l氢氧化钾溶液1ml，密封，水浴加热(95～100℃)2小时，取出，放冷至室温，加入1mol/l硝酸溶液1ml，水浴加热(95～100℃)3分钟，放冷至室温，转移至10ml量瓶中，用甲醇-水(45:55)混合溶液稀释至刻度，摇匀，即获得马来酸氟伏沙明杂质ⅱ、杂质ⅲ、马来酸氟伏沙明和杂质ⅳ的混合溶液，作为系统适用性溶液(以下称破坏溶液)。
上述破坏出杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ，既可以满足定位需要而不用购买杂质对照品，又可以解决usp(美国药典)方法中杂质定位受干扰的问题。
2)取待测马来酸氟伏沙明原料(批号s13012411)适量，用流动相(50％v/v甲醇溶液)配制成每ml体系含2mg马来酸伏氟沙明原料的供试品溶液；
取供试品溶液，用流动相进行稀释制成每1ml中含2μg马来酸氟伏沙明标准品的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
3)取上述破坏溶液、供试品溶液、对照品溶液分别注入液相色谱仪，分析。破坏溶液测得马来酸伏氟沙明杂质ⅲ、杂质ⅱ、氟伏沙明和杂质ⅳ色谱峰，且各色谱峰的分离度应大于4.0。对照品溶液中出现马来酸氟伏沙明色谱峰。供试品溶液中除了出现被测物氟伏沙明的色谱峰外，可能出现杂质ⅲ、ⅱ、ⅴ、ⅳ和杂质ⅰ的色谱峰，也可能不出现杂质的色谱峰，这取决于产品的质量。
4)结果计算
供试品溶液的色谱图中，如果出现与破坏溶液中杂质ⅱ、ⅲ、ⅳ色谱行为一致的杂质峰，则说明待测供试品溶液中存在相应杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ；杂质ⅰ和ⅴ在破坏溶液中虽然未出现，但可通过相对保留时间定位。若需进一步计算待测样品中杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ的含量，则按下式进行计算：
式中：f为各杂质相对于马来酸氟伏沙明的校正因子(f)，杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ相对于马来酸氟伏沙明的校正因子f分别为1.1、1.0、1.0、0.36、0.89。
本实施例对待测样品的检测结果如表4所示。本发明破坏方法对各杂质的定位与英国药典用杂质对照品定位方法的结果是一致的。
实施例3一种测定马来酸氟伏沙明中各降解杂质的方法
1)取马来酸氟伏沙明标准品(国内有供应)约10mg，置顶空瓶中，加入马来酸20mg，用乙醇-水(体积比45:55)混合溶液2ml使溶解，再加入0.2mol/l氢氧化钙溶液1ml，密封，水浴加热(95～100℃)0.8小时，取出，放冷至室温，加入1mol/l硝酸溶液1ml，水浴加热(95～100℃)3分钟，放冷至室温，转移至10ml量瓶中，用乙醇-水(45:55)混合溶液稀释至刻度，摇匀，即获得马来酸伏氟沙明杂质ⅱ、杂质ⅲ、马来酸伏氟沙明和杂质ⅳ的混合溶液，作为系统适用性溶液(以下称破坏溶液)。
上述破坏出杂质ⅱ、杂质ⅲ和杂质ⅳ，既可以满足定位需要而不用购买杂质对照品，又可以解决usp(美国药典)方法中杂质定位受干扰的问题。
2)取待测马来酸伏氟沙明原料(批号110)适量，用流动相(45％v/v甲醇溶液)配制成每ml体系含0.8mg马来酸氟伏沙明原料的供试品溶液；
取供试品溶液，用水进行稀释制成每1ml中含0.8μg马来酸氟伏沙明标准品的溶液，摇匀，作为对照品溶液。
3)取上述破坏溶液、供试品溶液、对照品溶液分别注入液相色谱仪，分析。破坏溶液测得马来酸伏氟沙明杂质ⅲ、杂质ⅱ、伏氟沙明和杂质ⅳ色谱峰，且各色谱峰的分离度应大于4.0。对照品溶液中出现马来酸氟伏沙明色谱峰。供试品溶液中除了出现被测物氟伏沙明的色谱峰外，可能出现杂质ⅲ、ⅱ、ⅴ、ⅳ和杂质ⅰ的色谱峰，也可能不出现杂质的色谱峰，这取决于产品的质量。
4)结果计算
供试品溶液的色谱图中，如果出现与破坏溶液中杂质ⅱ、ⅲ、ⅳ色谱行为一致的杂质峰，则说明待测供试品溶液中存在相应杂质ⅱ、ⅲ或ⅳ；杂质ⅰ和ⅴ在破坏溶液中虽然未出现，但可通过相对保留时间定位。若需进一步计算待测样品中杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ的含量，则按下式进行计算：
式中：f为各杂质相对于马来酸氟伏沙明的校正因子(f)，杂质ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ、ⅴ相对于马来酸氟伏沙明的校正因子f分别为1.1、1.0、1.0、0.36、0.89。
本实施例对待测样品的检测结果如表4所示。本发明破坏方法对各杂质的定位与英国药典用杂质对照品定位方法的结果是一致的。
实施例4～5一种测定马来酸氟伏沙明中各降解杂质的方法
实施例4～5的检测方法同实施例1，分别对另外2批(批号分别为111、112)待测马来酸氟伏沙明原料进行检测，该2批待测品检测结果如表4所示。本发明破坏方法对各杂质的定位效果与英国药典用杂质对照品定位方法的结果是一致的。
表4各批样品测定结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。